Introduction
أهداف الطريقة الموصوفة لتحليل تركيز الكورتيزون في البراز الخيول من أجل توفير تقييم غير الغازية للنشاط الغدة الكظرية. قياس النشاط (HPA) محور الغدة النخامية، الغدة الكظرية هو نهج قبولهم للدراسة الاستجابة لحالات يحتمل أن تكون مكره في كل من الأنواع في الأسر والمحلية. تقنية الإشارة وطريقة الأكثر استخداما هو استخدام بلازما الدم 1 ومع ذلك، الطرق البديلة مثل تحليل البراز وضعت من أجل التغلب على الإجهاد الناجم عن اخذ عينات من الدم نفسها والسماح القدرة على رصد الأنواع الطليقة.
أثناء وضع مكره، تعطل التوازن الفيزيولوجي. منطقة ما تحت المهاد في الدماغ النشرات المنمية القشرية الافراج عن هرمون (CRH) الذي يعمل على الغدة النخامية الأمامية ويحفز الافراج عن الهرمون الموجه لقشر الكظر (ACTH). ACTH يدخل مجرى الدم، ويحفز قشرة الغدة الكظرية لإفراز مسكوكةق السكرية محددة (GC). ترتبط ارتباطا وثيقا السكرية الأحداث المجهدة بدلا من أن تنتج باستمرار في جميع ولايات الطاقة المتزايدة ولذا غالبا ما يتم قياسها في تفضيل اكثر من غيرها من الإجهاد ترتبط الهرمونات 2. السكرية هي المسؤولة عن العديد من الآثار التكيف في الخيول. وحشدت الطاقة بسرعة من مواقع التخزين في الجسم في شكل من الأحماض الدهنية والجلوكوز، وزيادة كمية الأوكسجين، مما يعزز وظيفة حسية (3) وانخفاض تدفق الدم الى مناطق غير الضرورية لحركة 4. وكذلك بوصفها آلية التعامل، وارتفاع التوتر الناجم في السكرية قد يساعد أيضا على إعداد الحيوان للالضغوطات المقبل 5.
تقييم مستويات الهرمون في البلازما واللعاب ينطوي على قياس هرمون تعميم الفعلي ومع ذلك، وقياس نواتج الأيض في التدابير البراز المنتج النهائي التمثيل الغذائي للهرمون. وcatabolized المنشطات المتداولة في لترإيفر قبل الإفراز في لالصفراء حيث أنها تخضع لتغييرات أخرى بتسهيل من الأنشطة الإنزيمية من النباتات البكتيرية داخل مسار الأمعاء 6. لذلك، المناعية الموجهة نحو السكرية في الدم قد لا تكون مناسبة لتحليل نواتج الأيض جلايكورتيكود البرازية 7.
كما يمكن أن يتم جمع البراز من دون أي إزعاج للحصان، وتحليل البراز للكورتيزون، وقد استخدم على نطاق واسع لمراقبة نشاط HPA في عدد من الظروف. تم الإبلاغ عن كورتيزون ارتفاع في البراز من الخيول استجابة لحالات يحتمل أن تكون مكره بما في ذلك أثناء العلاج البيطري بعد العملية 8 وفي السكن تقييدا 9. تعكس أخذ العينات البرازية مستوى جلايكورتيكود المجمعة مع مرور الوقت بدلا من نقطة في أخذ العينات في الوقت التي تقدمها البلازما واللعاب مما يجعله مناسبا لرصد المدى الطويل المزمن أو الأنماط الموسمية 10. ويرجع ذلك إلى غير الغازيةطبيعة الأسلوب، والعينات ويمكن جمع مرارا وتكرارا للفرد دون الحاجة إلى التقاط أو ضبط النفس 11. ومع ذلك، يجب أن تؤخذ أنواع محددة وقت عبور القناة الهضمية في الاعتبار عند التخطيط لبروتوكول أخذ العينات. في الخيول، والوقت الأمعاء عبور حوالي 18 ساعة 12 وبالتالي، يمكن الكشف عن استجابة الغدة الكظرية والأيض كورتيزون لاحقة في البراز بعد يوم واحد تفعيل الأولي للمحور HPA.
عندما تستخدم تقنيات المناعية غير الغازية التحقق من صحة دقيق لهذه الأنواع يجري التحقيق ضروري 13. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن الفروق بين الجنسين في هرمون الأيض إفراز ربما بسبب الاختلافات في معدل الأيض ونوع الأيض كورتيزون تفرز في مختلف الأنواع بما في ذلك الفئران 14، والدجاج (15). ولذلك كان من المهم كجزء من هذا الأسلوب الذي تم التحقق من صحة فحص للاستخدام في كل من الذكور والإناث الخيول المحلية كما هو مفصل في البروتوكول البريد. هذا الاختلاف في عملية الأيض الهرموني بين الجنسين له عواقب على نوعية البيانات إلا أنه نادرا ما يتم معالجتها وتضمينها كجزء من التحقق من صحة الفحص.
وتسمح هذه الطريقة غير الغازية تقييم المدى الطويل من النشاط الغدة الكظرية في الخيول المحلية. تفاصيل البروتوكول كل من المصادقة على فحص وتقنية فحص نفسها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: الإجراءات التي تنطوي على أخذ العينات الميدانية والحيوان موضوعات تم اعتمادها من قبل مدرسة الحيوان، الريفية والعلوم البيئية (آريس) في جامعة نوتنغهام ترنت.
1. جمع عينات البراز
ملاحظة: يجب ارتداء القفازات عند التعامل مع العينات البرازية والميثانول. إذا كان هناك شكوك قوية بأن حيوان يمكن أن يعاني من مرض حيواني المنشأ، ملابس واقية مثل وينبغي أيضا أن ترتديه معطف المختبر.
- جمع العينات البرازية في أقرب وقت ممكن (في غضون دقائق إلى بضع ساعة) بعد التغوط ووضعها في كيس من العينة. أخذ 3-5 العينات الفرعية من أي عينة يتبرز مع الوزن الكلي حوالي 10 غرام. تسمية حقيبة مع الوقت والتاريخ من جمع وهوية الأفراد، وتجميد العينة في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
- لتقليل الخطأ، وتجميد جميع العينات في -20 درجة مئوية حتى الدراسة كاملة ثم جمع عينات معا للتحليل كما دفعة واحدة. </ لى>
2. برازي هرمون استخراج
- ترك عينات البراز لذوبان الجليد في RT.
- ضمان أن العينات والمتجانس عن طريق خلط كل عينة يدويا في كيس عينة الخاصة بها.
- لكل عينة تزن 0.50 (± 0.003 ز) من المواد البرازية على توازن دقيق في وزن القارب ثم نقل البراز إلى قارورة زجاج 8 مل. استخدام تزن قارب جديد لكل عينة وتنظيف ملاقط مع 30٪ الميثانول بين كل عينة.
- الجمع بين 0.5 غرام من المواد البرازية مع 5 مل من 90٪ ميثانول: الماء، ويهز O / N على شاكر المداري في RT.
- في صباح اليوم التالي، دوامة العينة ومن ثم الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 600 غرام.
- صب جزء الميثانول في أنبوبة زجاجية 16 × 125 مم 2 ومكان في رف في حمام مائي لتعيين درجة حرارة 37 درجة مئوية. تتبخر إلى جفاف باستخدام الهواء في خزانة الدخان. شطف القارورة استخراج ووضع بيليه البراز المتبقية في كيس النفايات الطبية للتخلص منها.
- إعادة تعليق مقتطفات البرازية في 100٪، 1 مل الميثانول ونقل إلى أنبوب البولي بروبلين 12 × 75 مم 2. على الفور سقف ومخزن في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
3. تحليل هرمون
- إجراء التحليل مع انزيم مرتبط-المناعية (EIA) باستخدام بولكلونل مصل كورتيزون CJM006.
ملاحظة: تم وتقييم الأثر البيئي الثاني اختبار (الكورتيزول R4866 مصل، ولكن هذا فشل في تحقيق خطوة التحقق من صحة البيوكيميائية (انظر القسم 4.1) يتم توفير الأمصال المضادة بولكلونل كورتيزون CJM006 والكورتيزول R4866 مصل والتي تخصها، برنامج الصحة الإنجابية التي كتبها CJ مونرو، جامعة كاليفورنيا، ديفيس، كاليفورنيا. - تمييع مصل في 1: 15،000 في المخزن طلاء (0.05 M NaHCO3، ودرجة الحموضة 9.6) باستخدام ماصة المتكررة و50 ميكرولتر ماصة، تحميل لوحة التلازن 96-جيدا مع 50 ميكرولتر / جيد. تغطية لوحة مع سداده لوحة واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. ترك بئرين غير المصقول لتمثيل الآبار غير الملزمة محددة (NSB).
- مباشرة قبل الاستعمال تغسل الصحون التلازن خمس مرات باستخدام الآلي غسالة لوحة التلازن (محلول الغسيل، 0.15 م كلوريد الصوديوم، 0.05٪ توين 20).
- تحميل لوحات مع 50 ميكرولتر لكل بئر لفي جهاز الأمن القومي والآبار [عازلة تقييم الأثر البيئي (0.1 M نابو 4، 0.149 M كلوريد الصوديوم، 0.1٪ زلال المصل البقري، ودرجة الحموضة 7.0) فقط] "صفر"، ومعايير (كورتيزون، 3.9 - 1000 جزء من الغرام / أيضا) أو استخراج عينات البراز (مخفف بشكل مناسب في 1:20 عازلة تقييم الأثر البيئي، انظر القسم 4.1). يجب تشغيل المعايير والأصفار في ثلاث نسخ وquadruplicate، على التوالي. يجب تشغيل المخفف استخراج عينات البراز وفي جهاز الأمن القومي في نسختين.
- اتبع هذا على الفور مع اضافة 50 ميكرولتر جيدا / التسمية الفجل البيروكسيديز المترافقة ᵻ المخفف في المخزن EIA إلى 1: 70000.
- احتضان أطباق التلازن في الظلام لمدة 2 ساعة على RT.
- غسل أطباق التلازن مع محلول الغسيل 5 مرات، واحتضان لوحات في RT في الظلام مع 100 ميكرولتر / أهلا وسهلالتر من RT الركيزة [0.4 ملي 2،2'-azino-DI- (3-ethylbenzthiazoline السلفونيك حمض) ملح ثنائي الأمونيوم، 1.6 مم H 2 O 2، 0.05 M سترات، ودرجة الحموضة 4.0]. إعداد الركيزة مباشرة قبل الاستعمال.
- استخدام spectrophometer عند طول موجي 405 نانومتر لقراءة لوحات التلازن. تعتبر حضانة لوحات كاملة عندما الكثافة البصرية من الآبار الصفر تصل 0،8-1،0.
- لضمان التكرار، استخدام عناصر التحكم [معايير تقييم الأثر البيئي أو عينة بيولوجية المخفف في المخزن تقييم الأثر البيئي للربط في ما يقرب من 30٪ (EIA قياسي) و 50٪ (عينة على سبيل المثال البيولوجي، مجموعة من الحصان المحلي استخراج البراز) و 70٪ (EIA قياسي) ] لإثبات وجود داخل وبين فحص معاملات الاختلاف من <10٪ و <15٪ على التوالي.
4. انزيم مرتبط-المناعي: التحقق من صحة لنوع الدراسة والجنس
- الكيمياء الحيوية التحقق (التوازي)
- باستخدام عازلة تقييم الأثر البيئي، إجراء تخفيف تسلسلي على تجميع البراز خارجط م، والتي اتخذت من الناحية المثالية من يشتبه عينات تركيز الهرمون العالية والمنخفضة من عدة أفراد (المدى: أنيق، 1: 2-1: 8192)، وتعمل على تقييم الأثر البيئي كما هو موضح في القسم 3.
ملاحظة: يعتبر تحقيق التوازي عند التخفيفات المسلسل من مقتطفات البرازية تسفر عن بالتوازي منحنى النزوح الى نتائج منحنى الانحدار الخطي والقياسية تظهر R2> 0.90، منحدر> 0.50 و p <0.05. ينبغي النظر في استخراج البراز المخفف التسلسلي الذي يربط حوالي 50٪ على المنحنى القياسي لتخفيف المثالي لتشغيل جميع مقتطفات برازي (على سبيل المثال، 1:20). ليس هناك تدخل النظر فيها على الفحص عندما تظهر نتائج الانحدار الخطي R2> 0.90 و p <0.05.
- باستخدام عازلة تقييم الأثر البيئي، إجراء تخفيف تسلسلي على تجميع البراز خارجط م، والتي اتخذت من الناحية المثالية من يشتبه عينات تركيز الهرمون العالية والمنخفضة من عدة أفراد (المدى: أنيق، 1: 2-1: 8192)، وتعمل على تقييم الأثر البيئي كما هو موضح في القسم 3.
- الكيمياء الحيوية التحقق (التدخل)
- ارتفاع 200 ميكرولتر من المعايير تخفيفه بشكل متسلسل (صفر، 3،9-1٬000 نانوغرام / جيد كورتيزون) مع 200 ميكرولتر من استخراج البراز بشكل مناسب المخفف المجمعة [المخفف في 50٪ ملزمة تحددها paralleliخ (01:20)] وتعمل على تقييم الأثر البيئي كما هو الحال في الجزء 3. بعد مؤامرة تحليل تقييم الأثر البيئي تركيز لاحظ ناقص الخلفية (تركيز العينة صفر) مقابل تركيز المتوقع.
ملاحظة: إذا كان إضافة المخفف استخراج البراز المجمعة لمعايير لا يغير كثيرا من المتوقع كمية خطية نتائج الانحدار ينتج R 2> 0.90، منحدر بالقرب 1.0 و p <0.05. لم يتم إحراز أي تدخل في تقييم الأثر البيئي.
- ارتفاع 200 ميكرولتر من المعايير تخفيفه بشكل متسلسل (صفر، 3،9-1٬000 نانوغرام / جيد كورتيزون) مع 200 ميكرولتر من استخراج البراز بشكل مناسب المخفف المجمعة [المخفف في 50٪ ملزمة تحددها paralleliخ (01:20)] وتعمل على تقييم الأثر البيئي كما هو الحال في الجزء 3. بعد مؤامرة تحليل تقييم الأثر البيئي تركيز لاحظ ناقص الخلفية (تركيز العينة صفر) مقابل تركيز المتوقع.
- التحقق البيولوجي:
ملاحظة: مظاهرة أن الادارة اختارت لديه القدرة على قياس التغييرات ذات الصلة بيولوجيا من هرمون الفائدة [على سبيل المثال، ارتفاع تركيزات القشرية السكرية بعد الدوائية (ACTH في كثير من الأحيان إجراء مرخص) أو التحدي البيولوجي (على سبيل المثال، نفسية و / أو للبيئة، من المرجح أن يكون حدثا غير المنظم الانتهازية)].- اختيار، واستخراج وتحليل عينات البراز لتركيزات المستقلب القشرية السكريةباستخدام عملية بالتفصيل في القسمين 1-3 قبل وبعد الحدث تحديا.
ملاحظة: سوف الحدث تحديا تكون أنواع محددة. يتم توفير وسيلة المثال أدناه للحصول على الحصان المحلي. وقد نشرت أمثلة كاملة من الأحداث الصعبة للخيول سابقا بما في ذلك استخدام إدارة 9 و تربية الإجراءات 16. ارتفاع كبير في تركيزات المستقلب القشرية السكرية في أعقاب الحدث تحديا يجب مراعاتها وأكد باستخدام التحليل الإحصائي. هذا يجب أن تتضمن حيثما كان ذلك مناسبا، وتأثير التدابير المتكررة، تاريخ العينة والفرد. ومن ثم يعتبر تحقيق التحقق البيولوجي.
- اختيار، واستخراج وتحليل عينات البراز لتركيزات المستقلب القشرية السكريةباستخدام عملية بالتفصيل في القسمين 1-3 قبل وبعد الحدث تحديا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخيول المحلية (ن = 16، 8 الأفراس، 8 الحيوانات المخصية) تم تجميع مع متوسط أعمارهم 15 عاما (± 3) وفقا لنوع الجنس وتعرض لأربعة تصاميم المساكن مع مستويات متزايدة من العزلة الاجتماعية (ن = 4 حصان / العلاج). الإسكان 1 تشارك الخيول الذين يعيشون في بيئة القطيع، محاكاة عن كثب بيئتها الطبيعية. الإسكان 2 تشارك الخيول التي تعيش في أزواج في حظيرة في الأماكن المغلقة. الإسكان 3 الخيول المشاركة آوى وحده في الاسطبلات ولكن مع عيانا على الخيول الأخرى والإسكان 4 عزلة تامة المعنية للخيول.
كان التعرض لكل معاملة في تصميم القطاعات العشوائية لمدة خمسة أيام. تحولت بعد هذه الخيول للخروج الى المرعى العشب في مجموعاتهم التجريبية لمدة يومين قبل التعرض لمعالجة السكن المقبلة. تم جمع عينات البراز مرة واحدة يوميا في أيام 1 و 2 و 3 قضى داخل كل معاملة السكن من ن = 8 خيول (ن = 2 الخيول في كل معاملة). تم جمع عينات البراز في أقرب وقت ممكن وضمن 1 ساعة بعد التغوط. وقد تم جمع جميع العينات بعد 1200 ساعة في أول يوم كامل من معنى إيواء الماشية أن العينة الأولى في يوم واحد، تم جمعها لا يقل عن 20 ساعة بعد أن قدم الحصان إلى معالجة السكن. تم تقييم عينات من يوم واحد، اثنين وثلاثة (ما مجموعه 24 عينة في تصميم المساكن) لمستويات الكورتيزون البرازية عاكسة للساعة 18 الماضية بسبب معدل مرور هضامة 12. واستخدمت نفس الخيول الفردية للتحليل البراز طوال فترة الدراسة. لمزيد من التفاصيل الكاملة لهذا التحدي البيولوجي، بما في ذلك معايير قياس إضافية، يرجى الرجوع إلى نشر العمل 9 الأمثلة البديل من الأحداث الصعبة للخيول المحلية يمكن أيضا أن تكون موجودة في الأدب 16.
ويوفر هذا القسم سبيل المثال نتائج التحقق من صحة الكيمياء الحيوية (التوازي) لكلا كورticosterone والكورتيزول في البراز الحصان المحلية من الذكور والإناث. كما يوفر هذا القسم بيانات تمثيلية تم الحصول عليها من استخراج البراز وتحليل تقييم الأثر البيئي. وقد تم الحصول على النتائج كجزء من دراسة أكبر للتحقيق في تأثير العزلة الاجتماعية الناجمة عن تصميم المساكن، على سلوك الخيول وعلم وظائف الأعضاء 9.
وكشفت نتائج التحقق من صحة الكيمياء الحيوية أن تقييم الأثر البيئي كورتيزون كان مناسبة لقياس نشاط الغدة الكظرية [الشكل 1A الذكور عينة٪ ملزمة = 25.349 + 0.729 (٪ قياسية ملزمة)، R2 = 0.9545، و (1، 7) = 146.710، ص أقل من 0.001)؛ الشكل 1B عينة الإناث٪ ملزم = 29.989 + 0.7198 (٪ قياسية ملزمة)، R2 = 0.95594، و (1، 7) = 151.865، ص أقل من 0.001] ولكن ليس الكورتيزول EIA [الشكل 1C عينة الذكور٪ ملزم = 79.089 + 0.0629 (٪ قياسية ملزمة)، R2 = 0.175، F (1، 7) = 1.485، ع = 0.262)؛ 1D الشكل عينة الإناث٪ ملزم = 81.652 + 0.0772 (٪ قياسية ملزمة)، R2 = 0.257، F (1، 7) = 2.422، ع = 0.164]. كما أظهر تقييم الأثر البيئي كورتيزون التوازي على عكس تقييم الأثر البيئي الكورتيزول واختبار تدخل على كورتيزون كشف EIA أي دليل على تدخل مصفوفة، وإضافة استخراج البراز المخفف للمعايير كورتيزون لم يغير كمية المتوقعة (الذكور: لوحظ = 1.302 + 1.017 (المتوقعة) ، R2 = 0.9972، F1، 7 = 1287.128، ف <0.001، الإناث: لوحظ = 0.3169 + 1.0931 (المتوقعة)، R2 = 0.9972، F1، 7 = 2432.65، ف <0.001؛).
وكشفت نتائج تقييم الأثر البيئي أنه لا يوجد اختلاف كبير في مستويات الكورتيزون بين الخيول الذكور (M = 37.7، SD = 14.1) والخيول الإناث (M = 33.8، SD = 12.7؛ ر (70) = 1.23، ع = 0.22) . ارتفع مستوى الكورتيزون البراز حيث ارتفع مستوى العزلة. كانت الخيول معزولة (تصميم المساكن 4) عالية بشكل ملحوظإيه مستويات الكورتيزون البراز مقارنة بجميع تصاميم المساكن الأخرى (ويلكس لامدا = 0.58، F (3، 18) = 4.29، ع = 0.01، التربيعية ايتا جزئية متعدد المتغيرات = 0.42؛ ف ≤0.02). وكان مستوى الكورتيزون البراز العالي للجميع الخيول في جميع أيام عينة الثلاث خلال السكن الأكثر عزلة بالمقارنة مع العلاجات الإسكان الأخرى. وتعرض تركيزات كورتيزون البراز يعني لكل تصميم المساكن لكل يوم في الجدول 1.
الشكل 1. الكيمياء الحيوية التحقق (التوازي) من الكورتيزون والكورتيزول انزيم مرتبط-المناعية للذكر وأنثى الخيول. تفاصيل هذا الرقم في المئة ملزمة حمامات المخفف المسلسل من الذكور والحصان المحلي مقتطفات البرازية الإناث ضد زيادة الكورتيزون والكورتيزول تركيزات منحنى قياسي في تقييم الأثر البيئي. وتظهر النتائج أنكورتيزون (A، ذكر، B، أنثى) وليس الكورتيزول تقييم الأثر البيئي (C، الذكور؛ D، أنثى). حققت نجاحا موازيا منحنى النزوح مع منحنى كورتيزون EIA معيار الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| متوسط (± SD) البرازية كورتيزون (نانوغرام / غرام) في كل والإسكان علاج | ||||
| الإسكان علاج | اليوم 1 | يوم 2 | يوم 3 | وعموما |
| 1 | 31.73 ± 10.2 | 32.18 ± 8.0 | 29.22 ± 5.9 | 31.05 ± 7.8 |
| 2 | 32.75 ± 10.0 | 33.66 ± 12.9 | 34.67 ± 9.3 | 33.69 ± 10.3 |
| 3 | 35.06 ± 14.6 | 35.14 ± 15.9 | 33.13 ± 12.5 | 34.44 ± 13.6 |
| </ td> | * | |||
| 4 | 38.16 ± 17.8 | 42.00 ± 16.7 | 41.52 ± 17.6 | 40.56 ± 16.5 |
الجدول 1. متوسط (± SD) البراز كورتيزون (نانوغرام / غرام) لكل معاملة الإسكان ليوم واحد، اثنين وثلاثة ويعني البراز كورتيزون (نانوغرام / غرام) لجميع أيام ثلاثة (عموما) في كل معاملة الإسكان: يبين هذا الجدول القيم المتوسطة للكورتيزون البراز (نانوغرام / غرام) ± الانحراف المعياري لكل من العلاجات الإسكان خلال يوم واحد، اثنين وثلاثة. تم جمع عينات لا يقل عن 20 ساعة بعد أن دخلت الخيول السكن. لكنه يظهر أيضا كورتيزون البراز يعني (نانوغرام / غرام) ± الانحراف المعياري لجميع الأيام الثلاثة (عموما) في كل معاملة السكن. وويركز كورتيزون البرازكان أيون أعلى بكثير (*) خلال تصميم المساكن معزولة. تم العثور على أدنى تركيز الكورتيزون البراز لجميع أيام في علاج مجموعة يضم (العلاج 1). مقتبس من Yarnell وآخرون (2015)، بإذن من مجلة علم وظائف الأعضاء والسلوك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر تحليل البراز كورتيزون وسيلة لتقييم أنماط طويلة المدى لنشاط الغدة الكظرية في الخيول. طبيعة غير الغازية من طريقة تتغلب على آثار الخلط من طرق أخذ العينات الأخرى المستخدمة لتقييم نشاط الغدة الكظرية بما في ذلك اللعاب والبلازما تحليل 9. وبالإضافة إلى ذلك الأسلوب له ميزة واضحة غير الغازية إن كانت دراسة الخيول تتراوح مجانا.
هناك عدة نقاط رئيسية لمناقشة بخصوص هذه الطريقة والاستخدام المناسب لها. خطوة حاسمة في البروتوكول هو المصادقة على فحص للأنواع المذكورة واختيار الأجسام المضادة المناسبة. إذا كانت الأجسام المضادة المستخدمة عبر يتفاعل مع نواتج السكرية مماثلة هيكليا ولكنها مختلفة وظيفيا وهذا يمكن أن نخلط النتائج 17. لذلك، فحوصات لقياس نواتج الأيض الهرموني تتطلب التحقق من صحة الفسيولوجية والبيولوجية دقيق، تفاصيلها موجودة في الأدب 18،19 وضمن أن descr بروتوكولibed.
حالة من عينة البراز تحتاج إلى النظر فيها بما في ذلك نضارة العينة والتعرض البيئي والتي ثبت على حد سواء لتؤثر على مستويات الأيض الهرموني 20. ومن المعروف أن الأمطار الغزيرة أو التعرض أشعة الشمس أن تسبب الزيادة أو النقصان في تركيزات المستقلب بسبب التمثيل الغذائي البكتيري 21. يجب على الباحثين الذين يرغبون في جمع عينات من درجات متفاوتة من نضارة التحقيق في آثار الزمن على سلامة العينة، بالإضافة إلى الأثر البيئي. ويمكن أن يتم ذلك قبل الدراسة من خلال إنشاء تجربة صغيرة وبشكل دوري أخذ عينات البراز من الأفراد الذكور والإناث، مع درجات نضارة والتعرض متفاوتة تجاه المتغيرات المناخية.
في معظم الحالات الأبحاث، وعينات من الأفراد المعروفين يكون مفيدا أو ضروريا 10. في الخيول المحلية ويمكن تحقيق ذلك من خلال رصد مجموعة لdefaecation أو استخدام علامات الطعام تناولها لمعرفentify البراز من الأفراد في مجموعات أكبر 12. في الأنواع الطليقة هذا قد يثبت تستغرق وقتا طويلا كما سوف تكون هناك حاجة تتبع الفردي.
عند اختيار طريقة التحليل الاستيرويد أنه يجب النظر إلى أن نتائج فحص البراز كورتيزون تمثل عينة المجمعة مع مرور الوقت بدلا من نقطة في مقياس الزمن؛ وبالتالي، سيكون هناك أقل تقلب في البيانات. إذا كان الباحث يرغب في المدى الطويل من آثار هذا الوضع، تقنية تربية أو ممارسة الإدارة ثم يقدم تحليل البراز تقنية مناسبة. إذا كان مطلوبا تقييم أنماط على المدى القصير في تركيز الهرمون بعد ذلك البلازما أو تحليل اللعابية يكون الأسلوب المفضل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals? Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T.
- Nelson, R. J. An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , Sinaur associates Inc. Ohio, USA. 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H.
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
