Introduction
この方法は、副腎活性の非侵襲的評価を提供するために馬の糞便中のコルチコステロン濃度を分析することを目的とします。視床下部 - 下垂体 - 副腎（HPA）軸の活性を測定すると、キャプティブと国内の両方の種において潜在的に嫌悪事態への対応を研究するための一般に認められた手法です。参考技術と最も広く使用される方法は、しかしながら、例えば、糞便分析などの別の方法は、遊離の範囲の種を監視する能力を採血自体によって誘発されるストレスを克服し、可能にするために開発されてきた血漿1の使用です。
嫌悪状況の間に、生理的恒常性が破壊されています。下垂体前葉に作用し、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）の放出を刺激ホルモン放出ホルモン（CRH）の副腎皮質脳のリリースでは視床下部。 ACTHは血流に入り、種を分泌する副腎皮質を刺激しますsの特定のグルココルチコイド（GC）。グルココルチコイドは密接ではなく、一貫したがって、彼らはしばしば他のストレスリンクのホルモン2の上に優先的に測定されているすべてのエネルギーの高まりの状態で製造されるよりも、ストレスの多いイベントにリンクされています。グルココルチコイドは、馬のいくつかの適応効果を担当しています。エネルギーが急速に酸素摂取量を増加させ、脂肪酸およびグルコースの形で体内の貯蔵部位から動員され、感覚機能は、3と、血流を向上さ動き4に必要でない領域まで低下します。同様に対処メカニズムとして機能するように、グルココルチコイドの応力誘起される上昇はまた、次のストレッサー5のために動物を準備するのを助けることができます。
血漿および唾液中のホルモンのレベルを評価することは、糞便中の代謝物の測定は、ホルモンの代謝最終産物を測定し、しかし実際の循環ホルモンを測定することを含みます。循環ステロイドはリットルに異化されています彼らは腸のトラック6内細菌叢の酵素活性によって容易にさらなる変化を受ける胆汁に排泄前にアイバー。したがって、血液グルココルチコイドに向けイムノアッセイは、糞便、グルココルチコイド代謝物7の分析に適していないかもしれません。
糞便収集が馬に乱れを行うことができるように、コルチコステロンのための糞の分析は、多くの状況でHPA活性をモニターするために広く使用されています。馬の糞便中の上昇コルチコステロンは、術後獣医の治療8の間にあり、限定ハウジング9に含む潜在的嫌悪状況に応じて報告されています。糞便サンプルは、時間をかけてプールされたグルココルチコイドレベルではなく、血漿および唾液長期的に監視することが適切で作る、慢性または季節的パターン10によって提供される時間サンプリング点を反映しています。非侵襲性に起因し方法の性質は、サンプルを捕捉または拘束具11を必要とせずに、個々の繰り返し収集することができます。サンプリングプロトコルを計画する際しかし、種特異的腸通過時間を考慮しなければなりません。馬では、腸の通過時間は約18時間12したがって、副腎応答およびその後のコルチコステロン代謝物は1日HPA軸の初期起動後に糞便中に検出することができます。
非侵襲的なイムノアッセイ技術を利用する場合検討さ種について注意深く検証は13不可欠です。また、ホルモンの代謝物の排泄の性差が原因で、マウス14、鶏15を含む様々な種に排泄コルチコステロン代謝物の代謝速度とタイプの違いにおそらく報告されています。アッセイは目に詳述されているように男性と女性の国内の馬の両方で使用するために検証されたそのため、この方法の一部として重要でした電子プロトコル。男女間のホルモン代謝におけるこの違いは、アドレス指定されず、アッセイの検証の一部として含まれているまれまだデータ品質に対する影響を有しています。
この非侵襲的方法は、国内のウマにおける副腎活動の長期評価を可能にします。プロトコルの詳細分析の検証およびアッセイ技術自体の両方。
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Protocol
倫理文：フィールドサンプリングおよび動物対象を含む手順は、ノッティンガム・トレント大学の動物、農村環境科学（ARES）科で承認されています。
糞便サンプルの1コレクション
注：糞便サンプルおよびメタノールを取り扱う際は手袋を着用する必要があります。動物が人獣共通感染症に苦しんでいることができることを強い疑いがある場合は、そのような白衣などの防護服も着用してください。
- 排便、次の（数時間に分以内）できるだけ早く糞便サンプルを収集し、サンプルバッグに入れます。約10グラムの総重量で任意の排便サンプルの3つから5つのサブサンプルを取ります。 、収集の時刻と日付で袋にラベルを付け、個々のID、および分析まで-20℃でサンプルを凍結します。
- エラーを最小限に抑えるために、全てのサンプルは-20℃で凍結します °Cまでの研究である完全な単一のバッチとして分析のために一緒にサンプルを収集します。</李>
2.糞便ホルモンの抽出
- 室温で解凍し糞便サンプルを残します。
- サンプルは手動で独自のサンプルバッグ内の各サンプルを混合することにより均質化されていることを確認。
- 各サンプルについて、その後8ミリリットルのガラスバイアルに糞を転送計量ボートに天秤に糞便材料で（0.003グラム±）0.50重量を量ります。各試料についての新しい計量ボートを使用して、各試料間の30％メタノールでピンセットをクリーニングします。
- 糞便物質の0.5グラム、90％メタノール5mlでコンバイン：水、そして室温でオービタルシェーカー上でO / Nを振ります。
- 翌朝は、サンプルをボルテックスした後、600グラムで20分間遠心します。
- 37℃の温度に設定した水浴中のラックに16×125 mm 2のガラス管と、所定の位置にメタノール画分をデカント。ドラフトチャンバー内の空気を使用して乾燥するまで蒸発させます。抽出用容器をすすぎ、処分のための医療廃棄物袋に残った糞石を配置します。
- 、100％で1ミリリットルのメタノールを糞便抽出物を再懸濁し、12×75ミリメートル2ポリプロピレンチューブに移します。すぐに分析するまで-20℃でキャップや店舗。
3.ホルモン分析
- ポリクローナルコルチコステロンCJM006抗血清を用いて、酵素結合イムノアッセイ（EIA）との分析を行います。
注：第二EIAは（コルチゾールR4866抗血清を試験したが、これは（4.1節を参照してください）ポリクローナルコルチコステロンCJM006抗血清およびコルチゾールR4866抗血清とそれぞれのHRPのがCJマンロー、カリフォルニア大学によって供給されている生化学的検証ステップを達成するために失敗しました、デイビス、カリフォルニア - 繰り返しのピペットと50μlのピペットチップを使用して、コーティング緩衝液（0.05 M炭酸水素ナトリウム、pHは9.6）で15,000、50μl/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートをロード：1で抗血清を希釈します。プレートシーラーでプレートを覆い、4℃でO / Nインキュベートします。非特異的結合ウェル（Nを表現するためにコーティングされていない2つの井戸を残しますSB）。
- 使用直前に自動マイクロタイタープレート洗浄機（; 0.15MのNaCl、0.05％ツイーン20洗浄液）を用いてマイクロタイタープレートを5回洗浄します。
- 千PG / - NSBのためのウェルあたり50μlのと「ゼロ」のウェル[EIA緩衝液（0.1 MのNaPO 4、0.149 MのNaCl、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.0）でのみ]、標準（コルチコステロン、3.9でプレートをロードウェル）または糞便抽出試料（適切に1時20分EIAバッファーで希釈し、4.1節を参照してください）。標準とゼロはそれぞれ、三重および四重に実行する必要があります。希釈した糞便抽出試料とNSBのは、二重に実行する必要があります。
- 7万：50μlの/ウェルを加え1にEIA緩衝液で希釈したラベル西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートᵻですぐにこれに従ってください。
- RTで2時間、暗所でマイクロタイタープレートをインキュベートします。
- 洗浄溶液でマイクロタイタープレートを5回洗浄し、100μl/ WELと暗闇の中で、室温でプレートをインキュベートRT基板のL [0.4mMの2,2'-アジノ-ジ（3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸）ジアンモニウム塩、1.6mMのH 2 O 2、0.05 Mクエン酸、pHを4.0]。使用直前に基板を準備します。
- マイクロタイタープレートを読み取るために405nmの波長で分光光度計を使用してください。ゼロウェルの光学濃度が0.8〜1.0に達したときに、プレートのインキュベーションが完了したと見なされます。
- 再現性を保証するために、約30％（EIA規格）、50％（生物学的サンプル、 例えば、国内の馬の糞便抽出液のプール）、70％（EIA規格）に結合するためにEIA緩衝液で希釈したコントロール[EIA規格または生物学的サンプルを使用]は、それぞれ<10％の変動と<15％の内およびアッセイ間の係数を実証します。
4.酵素結合免疫測定法：研究種の検証とセックス
- 生化学的検証（並列処理）
- EIA緩衝液を使用して、プールされた糞便余分に連続希釈を行いますCT、理想的には、いくつかの個体から疑われる高および低ホルモン濃度のサンプルから採取した（範囲：ニート、1：8192：2〜1）および第3章で説明したようにEIA上で実行されます。
注：糞便抽出物の連続希釈が標準曲線と直線回帰の結果に変位曲線を平行に得たときに並列処理が達成されたと見なされはR2> 0.90、スロープ> 0.50およびp <0.05を示しています。標準曲線に50％前後を結合する段階希釈糞便抽出物は、すべての糞便抽出物を実行するために理想的な希薄化を考慮すべきである（ 例えば、1時20分）。線形回帰の結果はR2> 0.90およびp <0.05を実証するときにアッセイに考え干渉はありません。
- EIA緩衝液を使用して、プールされた糞便余分に連続希釈を行いますCT、理想的には、いくつかの個体から疑われる高および低ホルモン濃度のサンプルから採取した（範囲：ニート、1：8192：2〜1）および第3章で説明したようにEIA上で実行されます。
- 生化学的検証（干渉）
- 適当に希釈したプールされた糞便抽出液200μlで連続的に希釈した標準液200μl（ゼロ、3.9〜1000 ngの/ウェルコルチコステロン）のスパイク[50％に希釈したparalleliによって決定バインディングSM（1時20分）]およびEIA分析プロット次のセクション3のようにEIA上で実行観察濃度マイナス予想濃度対バックグラウンド（ゼロサンプルの濃度）。
注：標準の希釈プールされた糞便抽出物の添加が有意量予想と線形回帰の結果を変更しない場合はR 2> 0.90、1.0およびp <0.05に近い傾斜をもたらします。 EIAとの干渉が達成されていません。
- 適当に希釈したプールされた糞便抽出液200μlで連続的に希釈した標準液200μl（ゼロ、3.9〜1000 ngの/ウェルコルチコステロン）のスパイク[50％に希釈したparalleliによって決定バインディングSM（1時20分）]およびEIA分析プロット次のセクション3のようにEIA上で実行観察濃度マイナス予想濃度対バックグラウンド（ゼロサンプルの濃度）。
- 生物学的検証：
注：選択されたEIAは、関心のホルモンの生物学的に関連する変化を測定する能力を持っていることを実証[ 例えば、薬理以下のグルココルチコイド濃度の上昇（ACTHは、多くの場合、ライセンス手続きである）または生物学的課題（ 例えば、心理学的および/ または環境;日和見無秩序なイベントである可能性がより高いです）]。- グルココルチコイド代謝物濃度のために糞便サンプルを選択し、抽出して分析します挑戦的なイベントの前と後の3 - セクション1に詳述プロセスを使用して。
注：挑戦的なイベントは、特定の種になります。例示的な方法は、国内の馬のために以下に提供されます。馬のための挑戦的なイベントの完全な例は、管理9と飼育手順16の使用を含め、以前に発表されています。挑戦的なイベント次のグルココルチコイド代謝物濃度の有意な上昇が観察され、統計的分析を用いて確認する必要があります。これは、適切な場合には反復測定は、サンプルの日付と個々の効果を組み込む必要があります。生物学的検証は、次に達成と考えられています。
- グルココルチコイド代謝物濃度のために糞便サンプルを選択し、抽出して分析します挑戦的なイベントの前と後の3 - セクション1に詳述プロセスを使用して。
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Representative Results
国内馬（N = 16は、8頭の牝馬、8去勢馬）15年（±3）の平均年齢と性別に応じてグループ化され、社会的孤立のレベルの増加と4住宅のデザインを施した（n = 4の馬/処理）しました。密接に彼らの自然の生息地をシミュレートし、群れ環境に住んでいる住宅1関与馬。屋内納屋でペアに住んでいる住宅2関与馬。ハウジング3関与馬は厩舎ではなく、他の馬と馬のハウジング4関与総分離を視覚的に接触して、単独で収容しました。
各治療への曝露は、5日間の期間のための無作為化ブロック設計でした。次のこの馬は次の住宅治療への曝露前の2日間、彼らの実験群に草のパドックに判明しました。糞便サンプルは、1日目、2日に一度回収し、3は、n = 8頭の馬から各住宅の治療（内過ごしました各処理内のn = 2の馬）。糞便サンプルは、できるだけ早くと排便後1時間以内として収集しました。馬がハウジングの治療に導入された後初日の最初のサンプルは、少なくとも20時間を集めたことが全てのサンプルは、厩舎の意味の最初のフルの日に1200時間後に採取しました。初日、2および3（住宅の設計あたり24サンプルの合計）からの試料は、消化物12の通過速度に起因し、過去18時間の反射糞便コルチコステロンレベルについて評価しました。同じ個々の馬は試験を通じて糞便分析に使用しました。追加の測定パラメータを含む、この生物学的課題の詳細については、国内の馬のための挑戦的なイベントの9代替例も文献16に見出すことができる公開された作業を参照してください。
このセクションでは、両方のCORのための生化学的検証（並列処理）の例の結果を提供します男性と女性の国内の馬の糞中ticosteroneとコルチゾール。このセクションでは、糞便抽出し、EIA分析から得られた代表的なデータを提供します。結果は、馬の行動や生理9時に、住宅の設計に起因する社会的孤立の影響を調べた大規模な研究の一環として得られました。
生化学的検証の結果コルチコステロンEIAは、副腎活性を測定することが適切であることを明らかにした[ 図1（a）のオスのサンプル％結合= 25.349 + 0.729（標準％結合）、R2 = 0.9545、F（1、7）= 146.710、よりP少ないです0.001）; 図1Bの女性サンプル％結合= 29.989 + 0.7198（標準％結合）、R2 = 0.95594、F（1、7）= 151.865、コルチゾールEIA【 図1Cの男性サンプル％結合のp 0.001未満]ではありません= 79.089 + 0.0629（標準％結合）、R2 = 0.175、F（1、7）= 1.485、P = 0.262）; 図1D女性サンプル％結合= 81.652 + 0.0772（標準％結合）、R2 = 0.257、F（1、7）= 2.422、P = 0.164]。コルチコステロンEIAは、コルチコステロン上のコルチゾールEIAと干渉試験とは異なり、並列性を実証したようEIAは、予想される量を変化させなかったコルチコステロン規格に希釈した糞便抽出物の添加として、マトリックス干渉の証拠がないことを明らかにした（男性：観測= + 1.017 1.302（予想されます） 、R2 = 0.9972、F1、7 = 1287.128、P <0.001;女性：観測= 0.3169 + 1.0931（予定）、R2 = 0.9972、F1、= 2432.65 7、P <0.001;）。
EIAの結果は、雄ウマ（M = 37.7、SD = 14.1）と雌馬の間のコルチコステロンレベルにおける有意差がなかったことを明らかにした（M = 33.8、SD = 12.7、T（70）= 1.23、P = 0.22） 。分離のレベルが増加するにつれて糞便コルチコステロンのレベルが増加しました。孤立した馬（住宅の設計4）が大幅高でしたえー糞コルチコステロンのレベルは、他のすべての住宅の設計（; P≤0.02ウィルクスラムダ= 0.58、F（3、18）= 4.29、P = 0.01、多変量部分イータ二乗= 0.42）と比較します。他の住宅の治療と比較した場合、糞便のコルチコステロンのレベルが最も孤立した筐体の間にすべての3つのサンプルの日にすべての馬のために高かったです。それぞれの日のそれぞれのハウジングデザインの平均糞便のコルチコステロンの濃度を表1に示します。
男性と女性の馬のためのコルチコステロンおよびコルチゾール酵素結合免疫測定法の図1.生化学的検証（並列処理）。この図は、上の増加コルチコステロンおよびコルチゾール標準曲線濃度に対する男性と女性の国内の馬の糞便抽出物の連続希釈プールの結合パーセントを詳述EIA。結果は実証しますコルチコステロン（A、男性; B、メス）とないコルチゾールEIA（C、オス、D、女性は）。コルチコステロンEIA標準曲線と成功した変位曲線を平行にもたらしたこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| EACH住宅の治療における平均（±SD）糞便のコルチコステロン濃度（ng / g）を | ||||
| 住宅治療 | 1日目 | 2日目 | 3日目 | 全体 |
| 1 | 31.73±10.2 | 32.18±8.0 | 29.22±5.9 | 31.05±7.8 |
| 2 | 32.75±10.0 | 33.66±12.9 | 34.67±9.3 | 33.69±10.3 |
| 3 | 35.06±14.6 | 35.14±15.9 | 33.13±12.5 | 34.44±13.6 |
| </ TD> | * | |||
| 4 | 38.16±17.8 | 42.00±16.7 | 41.52±17.6 | 40.56±16.5 |
各住宅治療における3日間のための日1つ、2つ、3つ及び平均糞便コルチコステロン濃度（ng / g）のために、各住宅の治療のための糞便コルチコステロン濃度（ng / g）を（全体）（±SD）を表1の平均。この表が示します糞便コルチコステロン濃度（ng / g）との平均値は初日、2と3の間に住宅の各処理のための標準偏差を±します。馬は、ハウジングに入った後、試料を少なくとも20時間に採取しました。また、各住宅の治療に（全体の）すべての3日間平均値±標準偏差糞便コルチコステロン濃度（ng / g）を示しています。糞便コルチコステロンconcentratイオンは、単離された住宅の設計時に（*）が有意に高かったです。すべての日のための糞便のコルチコステロンの最低濃度は、グループに収容され、治療（治療1）で発見されました。生理学や行動のジャーナルからの許可を得て、Yarnell ら （2015）から適応。
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Discussion
糞便のコルチコステロン分析は、ウマにおいて副腎活動の長期的パターンを評価する手段を提供します。方法の非侵襲的な性質は、唾液、血漿分析9を含む副腎活性を評価するために使用される他のサンプリング方法の交絡効果を克服します。自由変動の馬を研究する場合に加えて技術は明確な非侵襲的な利点を有しています。
このメソッドとその適切な利用に関する議論には、いくつかの重要なポイントがあります。プロトコルにおける重要なステップは、質問と適切な抗体の選択における種のためのアッセイの検証です。使用した抗体は、構造的に似ていますが、機能的に異なるグルココルチコイドの代謝産物と交差反応する場合、これは結果17を混乱させる可能性があります。したがって、ホルモンの代謝物を測定するためのアッセイは、文献18,19に、プロトコルDESCR内に存在するその詳細は、慎重な生理学的または生物学的な検証が必要ibed。
糞便試料の条件は両方のホルモン代謝産物レベル20に影響を与えることが示されているサンプルおよび環境曝露の鮮度などを考慮する必要があります。過度の雨や日光曝露は、細菌代謝21による代謝産物濃度の増加または減少を引き起こすことが知られています。鮮度の様々な程度のサンプルを収集したい研究者は、環境への影響に加えて、試料の完全性に対する時間の影響を調査しなければなりません。これは、気候変数に新鮮さと露出度を変化させて、小さな実験を設定し、定期的に男性と女性の個人からの糞便をサンプリングすることによって、従来の研究に行うことができます。
ほとんどの研究のシナリオでは、既知の個体由来のサンプルは10人または必要であろう。国内の馬では、これはdefaecationのグループを監視またはIDに摂取された食物のマーカーを使用することによって達成することができます大きなグループ12内の個人から糞をentify。フリーの範囲の種において、これは、個々の追跡が必要とされるようにかかる時間を証明することができます。
グルココルチコイド分析の方法を選択する際には、糞便コルチコステロンアッセイの結果は、時間の経過にプールされたサンプルではなく、時間の測定値の時点を表すことを考慮しなければなりません。そのため、データにはあまり変動があります。研究者は、状況の長期的な影響に関心がある場合、畜産技術や管理の実践は、その後、糞の分析は、適切な技術を提供しています。ホルモン濃度の短期パターンの評価が必要とされる場合、血漿または唾液分析は、好ましい方法です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
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