Introduction
המטרות תארו השיטה לנתח ריכוזי corticosterone בצואת סוסים כדי לספק הערכה לא פולשנית של פעילות כליה. מדידת ההיפותלמוס-היפופיזה-אדרנל (HPA) פעילות ציר היא גישה מקובלת ללמוד התגובה למצבים מרתיעים פוטנציאל בשני מיני בשבי ומקומיים. טכניקת התייחסות השיטה הנפוצה ביותר היא השימוש פלזמת דם 1 עם זאת, שיטות חלופיות כגון ניתוח צואה פותחו כדי להתגבר על הלחץ הנגרם על ידי לקיחת דמים עצמו ולאפשר את היכולת לפקח מינים הנעים בחינם.
במהלך מצב מרתיע, הומאוסטזיס פיסיולוגי מופר. ההיפותלמוס ב המוח משחרר corticotrophin משחררים הורמון (CRH) אשר פועלת על בלוטת יותרת המוח הקדמית ומעורר שחרור הורמון אדרנוקורטיקוטרופי (ACTH). ACTH נכנס לזרם הדם ומעורר את קליפת יותרת הכליה להפריש מצלצליםזה גלוקוקורטיקואידים ספציפיים (GC). Glucocorticoids מתקיים קשר הדוק לאירועים מלחיצים ולא שיופק באופן עקבי בכל המדינות מוגברות האנרגיה ולכן הם נמדדים לעתים קרובות עדיפים על פני הורמונים צמודי מתח אחרים 2. Glucocorticoids אחראי מספר השפעות אדפטיבית בסוסים. אנרגיה מגויסת במהירות מאתרי אחסון בגוף בצורה של חומצות שומן וגלוקוז, צריכת חמצן מוגברת, תפקוד חושי הוא משופר 3 ואת זרימת דם יורדת לאזורים אין צורך לתנועה 4. כמו גם מתנהג כמו מנגנון התמודדות, עליית המתח המושרית ב Glucocorticoids עשויה גם לעזור להכין את חית הדחק הבא 5.
הערכת רמות הורמוני הפלזמה ורוק כרוך מדידת ההורמון במחזור בפועל לעומת זאת, מדידת מטבוליטים אמצעי צואת המוצר הסופי המטבולית של ההורמון. סטרואידים במחזור הם catabolized ב lIver לפני ההפרשה אל המרה שם הם עוברים שינויים נוספים בהנחייתם של הפעילות אנזימטית של פלורת חיידקים בתוך מסלול מעי 6. לכן, immunoassays מכוונת גלוקוקורטיקואידים דם ואינה מתאימה לניתוח של מטבוליטים בסטרואידי צואת 7.
כמו אוסף צואה יכול להתבצע ללא הפרעה אל הסוס, ניתוח ובצואה corticosterone, כבר נעשה שימוש נרחב כדי לעקוב אחר פעילות HPA בכמה נסיבות. Corticosterone הגבוהה בצואה של סוסים דווחה בתגובה למצבים מרתיעים פוטנציאל כלל במהלך טיפול וטרינרי ניתוח שלאחר 8 ו בדיור 9 מגבילים. דגימת צואה משקפת רמה בסטרואידים נקוותה לאורך זמן ולא טעם דגימת זמן המוצע על ידי פלזמה ורוק מה שהופך אותו מתאים לניטור ארוך טווח, כרוני או דפוסים עונתיים 10. בשל פולשניטבעה של השיטה, דגימות ניתן לאסוף שוב ושוב ליחיד ללא צורך ללכוד או ריסון 11. עם זאת, זמן מעבר במעי ספציפי מינים חייב להילקח בחשבון בעת תכנון פרוטוקול דגימה. בסוסים, זמן מעבר במעי הוא סביב 18 שעות 12 ולכן, תגובת כלית מטבוליטים corticosterone עוקבים ניתן לאתר בצואה יום אחד לאחר הפעלה ראשונית של ציר HPA.
כאשר ניצול טכניקות immunoassay פולשני אימות זהירה עבור המין הנחקרת היא 13 חיונית. בנוסף, קיימים הבדלים בין המגדרים בהפרשת הורמון המטבוליט דווחו ככל הנראה בשל הבדלים בקצב חילוף החומרים וסוג המטבוליט corticosterone מופרש מינים שונים, כולל עכברים 14, ותרנגולות 15. לכן היה חשוב כחלק בשיטה זו כי assay שקיבל תוקף לשימוש גם זכר וגם נקבה סוסים המקומי כפי מפורט הפרוטוקול הדואר. להבדל הזה במטבוליזם הורמון בין המינים השלכות על איכות הנתונים ובכל זאת לעתים רחוקות התייחס וכלל כחלק מאימות assay.
שיטה לא פולשנית זו מאפשרת הערכה לטווח ארוכה של פעילות כליה בסוסים מקומיים. פרטי הפרוטוקול הוא האימות של assay ואת טכניקת assay עצמו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרה אתיקה: הנהלים הקשורים בנושאים הדגימה ובעלי חיים בשדה אושרו על ידי בית הספר Animal, כפרי ואיכות הסביבה מדע (ARES) ב נוטינגהאם טרנט האוניברסיטה.
1. איסוף של דגימות צואה
הערה: יש ללבוש כפפות בעת טיפול דגימות צואה, מתנול. אם קיים חשד כבד כי חיה יכול להיות סובל ממחלה zoonotic, ביגוד מגן כגון חלוק מעבדה צריך גם להיות משוחק.
- לאסוף את דגימות צואה בהקדם האפשרי (בתוך דקות עד מספר שעות) לאחר עשיית צרכים ולהכניס אותם לתוך שקית מדגם. להימשך בין שלוש לחמש subsamples של כל מדגם חירבן במשקל כולל של כ -10 גרם. לייבל את השקית עם השעה והתאריך של אוסף, מזהה הפרט, ולהקפיא המדגם ב -20 ° C עד הניתוח.
- כדי למזער שגיאות, להקפיא את כל הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס עד המחקר הושלם ואז אוסף את הדגימות יחד לניתוח כקבוצה אחת. </ Li>
2. הפקת הורמון צואה
- השאירו את דגימות צואה להפשיר ב RT.
- ודא כי דגימות הומוגני ידי ערבוב כל דגימה ידנית בתיק מדגם משלו.
- עבור כל דגימה שוקלת 0.50 (± 0.003 גרם) של חומר צואתי על microbalance בסירה לשקול מכן להעביר את הצואה כדי בקבוקון זכוכית 8 מיליליטר. השתמש בסירה לשקול חדשה עבור כל דגימה ולנקות פינצטה עם מתנול 30% בין כל דגימה.
- מערבבים את 0.5 גרם של חומר צואתי עם 5 מ"ל של 90% מתנול: מים, ולנער O / N על שייקר מסלולית ב RT.
- למחרת בבוקר, מערבולת המדגם ולאחר מכן צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 600 גרם.
- למזוג את שבר מתנול לתוך צינור זכוכית 16 x 125 מ"מ 2 ומניחים מתלים באמבט מים על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. להתאדות כדי יובש באמצעות אוויר בתוך ארון קטר. יש לשטוף את בקבוקון החילוץ ומניח גלולת הצואה הנותרת לתוך שקית פסולת קלינית לסילוק.
- Re- להשעות את תמציות צואתי ב 100%, 1 מ"ל מתנול להעביר צינור פוליפרופילן 12 x 75 מ"מ 2. מיד כובע ולאחסן ב -20 ° C עד הניתוח.
3. ניתוח הורמון
- לבצע את הניתוח עם-immunoassay מקושר האנזים (EIA) באמצעות antiserum CJM006 corticosterone polyclonal.
הערה:. EIA השני נבדק (antiserum קורטיזול R4866, אבל זה לא הצליחה להשיג את שלב האימות ביוכימיים (ראה סעיף 4.1) את antiserum Polyclonal corticosterone CJM006 ו antiserum קורטיזול R4866 ואת בהתאמה HRP של מסופקים על ידי CJ מונרו, אוניברסיטת קליפורניה, דיוויס, קליפורניה - לדלל את antiserum ב 1: 15,000 חיץ ציפוי (0.05 מ 'NaHCO3, pH 9.6) בעזרת פיפטה חוזרות קצה פיפטה 50 μl, לטעון צלחת microtitre 96-היטב עם 50 μl / היטב. מכסים את הצלחת עם אוטם צלחת דגירה O / N ב 4 ° C. השאר שתי בארות ללא ציפוי לייצג את בארות מחייב הלא ספציפיות (NSB).
- מייד לפני המריחה יש לשטוף את צלחות microtitre חמש פעמים באמצעות מכונת כביסת צלחת microtitre אוטומטית (פתרון לשטוף; 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20).
- טען את צלחות עם 50 μl לכל טוב עבור NSB של ו 'אפס' בארות [חיץ EIA (0.1 M 4 Napo, 0.149 M NaCl, 0.1% בסרום שור אלבומין, pH 7.0) רק], תקנים (corticosterone, 3.9 - 1,000 pg / כן) או לחלץ דגימות צואה (מדולל כראוי בשעה 1:20 חיץ EIA, ראה סעיף 4.1). לתקני אפסים צריכים לרוץ בשלושה עותקים ארבעה פעמים, בהתאמה. מדוללים לחלץ דגימות צואה NSB של צריכות להתנהל בשני עותקים.
- בצע את זה מיד עם תוספת של 50 μl / טוב של ᵻ המצומד peroxidase תווית חזרת מדולל במאגר EIA עד 1: 70,000.
- דגירה צלחות microtitre בחושך במשך שעה 2 ב RT.
- שטפו את צלחות microtitre עם פתרון לשטוף 5 פעמים דגירה צלחות ב RT בחושך עם 100 μl / well של המצע RT [0.4 מ"מ 2,2'-azino-דוּ (חומצה sulfonic 3-ethylbenzthiazoline) מלח diammonium, 1.6 מ"מ H 2 O 2, 0.05 מ 'ציטראט, pH 4.0]. מכינים את המצע מיד לפני השימוש.
- השתמש spectrophometer באורך גל של 405 ננומטר כדי לקרוא את לוחית microtitre. דגירה של צלחות נחשבת להשלים כאשר הצפיפות האופטית של אפס הבארות מגיעה 0.8 1.0.
- כדי להבטיח את הדירות, השתמש שולטת [סטנדרטים EIA או דגימה ביולוגית מדולל במאגר EIA להיקשר בכ 30% (תקן EIA), 50% (א למשל דגימה ביולוגית, מאגר של תמצית המקומי סוס צואה) ו -70% (תקן EIA) ] להפגין מקדמי תוך-assay יתר של וריאציה של <10% ו- <15% בהתאמה.
4. אנזימים צמוד immunoassay: תיקוף של מיני הלימוד והמין
- אימות ביוכימיים (מקביליות)
- באמצעות חיץ EIA, לבצע דילול סדר על ותקווה צואה נוספתct, אידיאלי שנלקחו דגימות ריכוז הורמון גבוהות ונמוכות חשד מכמה אנשים (טווח: מסודר, 1: 2 עד 1: 8192) ולהפעיל על EIA כמפורט בסעיף 3.
הערה: הקבלה נחשבת מושגת כאשר דילולי סדרה של תמציות צואה להניב במקביל עקום עקירה לתוצאות רגרסיה העקומה ולינארית התקן להפגין R2> 0.90, מדרון> 0.50 ו- p <0.05. התמצה הצואה המדוללת סדרה שקושר סביב 50% על עקומת הסטנדרט יש לשקול דילול האידיאלי כדי להפעיל את כל התמציות בצואה (למשל, 1:20). אין הפרעה נחשב על assay כשתוצאות רגרסיה ליניארית להפגין R2> 0.90 ו- p <0.05.
- באמצעות חיץ EIA, לבצע דילול סדר על ותקווה צואה נוספתct, אידיאלי שנלקחו דגימות ריכוז הורמון גבוהות ונמוכות חשד מכמה אנשים (טווח: מסודר, 1: 2 עד 1: 8192) ולהפעיל על EIA כמפורט בסעיף 3.
- אימות ביוכימיים (התאבכות)
- ספייק 200 μl של סטנדרטים בדילול סדרתי (אפס, 3.9 כדי 1000 ng / טוב corticosterone) עם 200 μl של תמצית צואה בדילול ונקווה כראוי [מדולל ב 50% כריכת שקבע paralleliSM (1:20)] ולהפעיל על EIA כמו בסעיף 3. בעקבות עלילת ניתוח EIA הריכוז שנצפה מינוס ברקע (הריכוז של המדגם אפס) לעומת הריכוז הצפוי.
הערה: אם תוספת של תמצית צואה ונקווה בדילול לתקנים לא לשנות באופן משמעותי את הסכום הצפוי ולינארית תוצאות רגרסיה מניב R 2> 0.90, מדרון קרוב ל -1.0 ו- p <0.05. אין התערבות עם EIA הושגה.
- ספייק 200 μl של סטנדרטים בדילול סדרתי (אפס, 3.9 כדי 1000 ng / טוב corticosterone) עם 200 μl של תמצית צואה בדילול ונקווה כראוי [מדולל ב 50% כריכת שקבע paralleliSM (1:20)] ולהפעיל על EIA כמו בסעיף 3. בעקבות עלילת ניתוח EIA הריכוז שנצפה מינוס ברקע (הריכוז של המדגם אפס) לעומת הריכוז הצפוי.
- אימות ביולוגיות:
הערה: הפגנה כי EIA נבחר יש את היכולת למדוד שינויים רלוונטיים הביולוגי של הורמון עניין [למשל, העלייה הריכוזית בסטרואידים בעקבות תרופתי (ACTH היא בדרך כלל הליך מורשה) או אתגר ביולוגי (למשל, פסיכולוגיים ו / או סביבתי; סיכוי גבוה יותר להיות אירוע מוסדר אופורטוניסטים)].- בחר, לחלץ ולנתח דגימות צואה לריכוזי המטבוליט בסטרואידיםבאמצעות התהליך המפורטים בסעיפים 1 - 3 לפני ואחרי אירוע מאתגר.
הערה: אירוע מאתגר יהיה מינים ספציפיים. שיטה למשל מוצגת להלן הסוס המקומי. דוגמאות מלאות של אירועים מאתגרים לסוסים פורסמו בעבר כולל שימוש פרוצדורות ניהול 9 ו בעלי 16. עלייה משמעותית בריכוז המטבוליט בסטרואידים בעקבות האירוע המאתגר יש להקפיד ואשרה באמצעות ניתוח סטטיסטי. זה חייב לשלב במידת צורך, את ההשפעה של מדידות חוזרות, תאריך מדגם בודד. אימות ביולוגית נחשבה אז מושגת.
- בחר, לחלץ ולנתח דגימות צואה לריכוזי המטבוליט בסטרואידיםבאמצעות התהליך המפורטים בסעיפים 1 - 3 לפני ואחרי אירוע מאתגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סוסים מקומיים (n = 16, 8 סוסות, 8 מסורסים) עם גיל ממוצע של 15 שנים (± 3) קובצו לפי מגדר נתון העיצובים דיור ארבעה ברמות הולכות וגדלות של בידוד חברתי (n = 4 סוסים / טיפול). שיכון 1 מעורבת סוסים חיים בסביבת עדר, מקרוב המדמה את סביבתם הטבעית. דיור 2 מעורבות סוסים חיים בזוגות באסם מקורה. סוסים ושיכון 3 מעורבים שוכנו לבד באורוות אבל עם קשר עין לסוסים אחרים בבידוד מוחלט מעורב דיור 4 של הסוסים.
חשיפת כל טיפול הייתה בעיצוב בלוק באקראי לתקופה של חמישה ימים. בעקבות זאת היו הסוסים התבררו לתוך כרי מרעה דשא בקבוצות הניסוי שלהם במשך ימים לפני החשיפה לטיפול הדיור הבא. דגימות צואה נאספו פעם ביום בימים 1, 2, ו -3 בילו בתוך כל טיפול דיור מ n = 8 סוסים (n = 2 סוסים בתוך כל טיפול). דגימות צואה נאספו בהקדם האפשרי ולא יאוחר מ- 1 שעות לאחר עשיית צרכים. כל הדגימות נאספו לאחר 1,200 שעות ביום המלא הראשון של משמעות stabling כי המדגם הראשון ביום אחד נאסף לפחות 20 שעות לאחר שהסוס הוצג טיפול הדיור. דוגמאות מהיום הראשון, שתיים או שלוש (סה"כ 24 דגימות לכל עיצוב דיור) הוערכו על רמות corticosterone צואה רעיוניות של 18 השעות האחרונות בשל קצב חלוף digesta 12. אותו סוסים בודדים שימשו לניתוח צואה לאורך כל תקופת המחקר. לפירוט מלא של האתגר הביולוגי הזה, כולל פרמטרים שנמדדו נוספים עיינו הדוגמות החלופיות פרסמו את עבודת 9 אירועים מאתגרים לסוסים מקומיים גם ניתן למצוא בספרות 16.
סעיף זה מספק תוצאות דוגמא אימות ביוכימיים (הקבלה) היא corticosterone וקורטיזול בצואה הסוס המקומי זכר ונקבה. סעיף זה מספק גם נתוני נציג המתקבלים מיצוי צואה וניתוח EIA. תוצאות התקבלו כחלק ממחקר גדול יותר, שחקר את שפעת הבידוד החברתי שנגרם על ידי עיצוב דיור, על התנהגות סוסים ופיזיולוגיה 9.
תוצאות אימות ביוכימיים גילו כי EIA corticosterone היה מתאים למדידת פעילות כליה [% למדגם גברי איור 1A מחייבים = 25.349 + 0.729 (% תקן מחייב), R2 = 0.9545, F (1, 7) = 146.710, p פחות 0.001); איור 1B הנשים שהשתתפו במדגם% מחייב = 29.989 + 0.7198 (% תקן מחייב), R2 = 0.95594, F (1, 7) = 151.865, p 0.001] אבל לא את EIA קורטיזול [% מדגם זכר תרשים 1C מחייב = 79.089 + 0.0629 (% תקן מחייב), R2 = 0.175, F (1, 7) = 1.485, p = 0.262); איור 1D הנשים שהשתתפו במדגםמחייב% = 81.652 + 0.0772 (% תקן מחייב), R2 = 0.257, F (1, 7) = 2.422, p = 0.164]. ככל EIA corticosterone הפגין הקבלה בניגוד EIA קורטיזול מבחן הפרעה על corticosterone EIA עולה כי אין ראיות של הפרעת מטריקס, כחיבור של תמצית צואתיים מדוללת לתקני corticosterone לא שינה את הסכום הצפוי (זכר: צפה ב = 1.302 + 1.017 (צפוי) , R2 = 0.9972, F1, 7 = 1287.128, p <0.001; הנשי: צפו ב = 0.3169 + 1.0931 (צפוי), R2 = 0.9972, F1, 7 = 2432.65, p <0.001;).
התוצאות של EIA גילה כי לא נמצא הבדל משמעותי ברמות corticosterone בין סוסים זכר (M = 37.7, SD = 14.1) וסוסים נקבה (M = 33.8, SD = 12.7; t (70) = 1.23, p = 0.22) . רמת corticosterone הצואה גדלה ככל שהרמה בבידוד גוברת. סוסים מבודדים (דיור עיצוב 4) היו באופן משמעותי גבוהיםאה רמות של corticosterone צואה בהשוואה לכל עיצובי הדיור האחרים (וילקס Lambda = 0.58, F (3, 18) = 4.29, p = 0.01, ETA חלקית רב משתנה בריבוע = 0.42; p ≤0.02). רמת corticosterone הצואה הייתה גבוהה יותר עבור כל הסוסים על כל השלושה ימים המדגמים במהלך הדיור המבודד ביותר בהשוואת טיפולי דיור האחרים. ריכוזי corticosterone צואה ממוצע עבור כל עיצוב דיור לכל יום מוצגים בלוח 1.
איור 1. אימות ביוכימיים (מקביליות) של קישור-Immunoassay אנזימי corticosterone וקורטיזול עבור סוסים זכר ונקבה. נתון זה מפרט את אחוז עקדת ברכות סדרתי המדוללת של זכר ותמציות צואת סוס המקומי נשיות נגד ההגדלה ריכוזי עקומת סטנדרט corticosterone וקורטיזול על EIA. התוצאות מראות כיcorticosterone (A, זכר; B, נקבה) ולא EIA קורטיזול (C, זכר; D, נקבה). הניב במקביל עקומת עקירה מוצלח עם עקומת סטנדרט corticosterone EIA אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| ממוצע (± סטיית תקן) corticosterone בצואה (ng / g) בכל טיפול ודיור | ||||
| טיפול ודיור | יום 1 | יום 2 | יום 3 | באופן כללי |
| 1 | 31.73 ± 10.2 | 32.18 ± 8.0 | 29.22 ± 5.9 | 31.05 ± 7.8 |
| 2 | 32.75 ± 10.0 | 33.66 ± 12.9 | 34.67 ± 9.3 | 33.69 ± 10.3 |
| 3 | 35.06 ± 14.6 | 35.14 ± 15.9 | 33.13 ± 12.5 | 34.44 ± 13.6 |
| </ Td> | * | |||
| 4 | 38.16 ± 17.8 | 42.00 ± 16.7 | 41.52 ± 17.6 | 40.56 ± 16.5 |
טבלה 1. Mean (± סטיית תקן) צואה corticosterone (ng / g) עבור כל טיפול לדיור ימים אחד, שניים או שלושה ולהתכוון צואה corticosterone (ng / g) עבור כל שלושה ימים (בסך הכל) בכל טיפול השיכון. מופעים טבלה זו הערכים הממוצעים עבור corticosterone בצואה (ng / g) ± סטיית התקן עבור כל אחד מטיפולי הדיור במהלך יום אחד, שתיים או שלוש. דגימות נאספו לפחות 20 שעות לאחר סוסים נכנסו הדיור. הוא גם מראה ממוצע corticosterone בצואה (ng / g) ± סטיית התקן עבור כל שלושה ימים (הכולל) בכל טיפול הדיור. תרכיזי corticosterone צואתיהיון היה גבוה משמעותי (*) בשלבי תכנון הדיור המבודד. הריכוז הנמוך ביותר של corticosterone צואה לכל הימים נמצא בטיפול שוכן הקבוצה (טיפול 1). מעובד מתוך Yarnell et al. (2015), באישור בכתב העת Journal of Physiology והתנהגות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח corticosterone צואה מספק אמצעי להערכת דפוסים לטווח ארוך של פעילות כליה בסוסים. האופי הלא-פולשני של השיטה מתגבר על תופעות בלבול של שיטות דגימה אחרות המשמשות כדי להעריך את פעילות כליה כוללים ניתוח רוק פלזמה 9. בנוסף הטכניקה יש יתרון לא פולשנית ברורה אם לומדים סוסים הנעים בחינם.
ישנן מספר נקודות מפתח כדי לדון לגבי שיטה זו והשימוש בהם. שלב קריטי בפרוטוקול הוא האימות של assay עבור המין מדובר ובחירת נוגדנים מתאימה. אם הנוגדן משמש צולבות מגיב עם מטבוליטים של גלוקוקורטיקואידים דומה מבני אבל מבחינה תפקודית שונה זה יכול לבלבל תוצאות 17. לכן, מבחנים למדוד מטבוליטים הורמון דורשים אימות פיסיולוגיות או ביולוגיות זהירות, שפרטיו קיימים בספרות 18,19 ובתוך descr הפרוטוקולibed.
התנאי של דגימת הצואה צריך להיחשב כולל רעננות של המדגם סביבתי וחשיפה אשר הוכח הוא להשפיע על רמות המטבוליט הורמונלית 20. גשם מוגזם או חשיפת שמש ידועה כגורמי עליות או ירידות בריכוזים המטבוליט בשל metabolization בקטריאלי 21. חוקרים המבקשים לאסוף דגימות של בדרגות שונות של רעננות חייבים לחקור את ההשפעות של זמן על שלמות מדגם, בנוסף השפעה על סביבה. ניתן לעשות זאת לפני המחקר על ידי הגדרת ניסוי קטן הדגימה צואה מעת לעת מיחידים זכר ונקבה, בדרגות שונות של רעננות וחשיפה משתנים אקלימיים.
ברוב תרחישי מחקר, דגימות אנשים הידועים תהיינה מועילות או צורך 10. בסוסים מקומיים זו יכולה להיות מושגת על ידי ניטור קבוצה עבור defaecation או באמצעות סמני מזון מעובדים כדי identify צואת מיחידים בקבוצות גדולות 12. במינים חינם החל זה עלול להסתבר זמן רב כמו מעקב פרט יידרש.
בעת בחירת שיטת ניתוח בסטרואידים הוא חייב לקחת בחשבון כי תוצאות assay corticosterone צואת מייצגי מדגם נקווה לאורך זמן ולא נקודה במידת זמן; ולכן, יהיו תנודות פחות בנתונים. אם החוקר מעוניין השפעות ארוכות טווח של מצב, טכניקה בעלי או ניהול בפועל אזי ניתוח צואה מציעה טכניקה מתאימה. אם הערכת דפוסים בטווח קצר בריכוז הורמון נדרשה אז פלזמה או ניתוח רוק תהיה השיטה המועדפת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals? Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T.
- Nelson, R. J. An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , Sinaur associates Inc. Ohio, USA. 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H.
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
