Introduction
Das beschriebene Verfahren Ziele Corticosteron-Konzentrationen in equine Kot, um eine nicht-invasive Beurteilung von adrenalen Aktivität bereitzustellen zu analysieren. Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA) Aktivität zu messen, ist ein akzeptierter Ansatz, um die Reaktion auf potenziell aversiven Situationen sowohl in Gefangenschaft und Haustierarten zu untersuchen. Die Referenztechnik und die am weitesten verbreitete Methode ist die Verwendung von Blutplasma 1 jedoch alternative Methoden wie Stuhlanalyse wurden entwickelt, um sich durch Blutentnahme induziert , den Stress zu überwinden und ermöglichen die Fähigkeit , frei lebenden Arten zu überwachen.
Während einer aversiven Situation wird physiologische Homöostase gestört. Der Hypothalamus im Gehirn Freisetzungen Releasing Hormon (CRH), Corticotropin, die auf der vorderen Hypophyse wirkt und stimuliert Freisetzung von adrenocorticotropen Hormons (ACTH). ACTH gelangt in den Blutkreislauf und regt die NNR specie absonderns spezifische Glucocorticoide (GC). Glucocorticoide sind eng mit belastenden Ereignissen verknüpft und nicht in allen Energie erhöhte Staaten konsequent produziert deshalb werden sie häufig bevorzugt , gemessen über andere Stress verbunden Hormone 2. Glucocorticoide sind mehrere adaptive Effekte bei Pferden verantwortlich. Energie schnell von Speicherstellen im Körper in Form von Fettsäuren und Glukose mobilisiert wird, wird die Sauerstoffaufnahme erhöht, sensorische Funktion 3 erhöht und der Blutfluss zu den Bereichen verringert nicht erforderlich , für die Bewegung 4. Neben dem Einsatz als Bewältigungsmechanismus wirkt, kann der Stress induzierten Anstieg der Glukokortikoide auch das Tier für die nächste Stressor helfen 5 vorzubereiten.
Beurteilung der Hormonspiegel im Plasma und Speichel beinhaltet jedoch die tatsächliche zirkulierenden Hormons Messung der Stoffwechselprodukte in den Faeces Maßnahmen die metabolische Endprodukt des Hormons gemessen wird. Zirkulieren Steroide sind in der l katabolisiertIver vor Ausscheidung in die Galle , wo sie weitere Veränderungen durch die enzymatischen Aktivitäten der Bakterienflora im Darm Spur 6 erleichtert unterziehen. Daher auf Blut Glucocorticoide gerichtet Immunoassays kann nicht für die Analyse von Stuhl Glukokortikoidmetaboliten 7 geeignet sein.
Als fäkale Sammlung kann das Pferd ohne Störung durchgeführt werden, die Analyse der Faeces für Corticosteron, umfassend zu überwachen, HPA-Aktivität in einer Reihe von Umständen verwendet wurde. Erhöhte Corticosteron im Kot von Pferden hat als Reaktion auf potenziell aversiven Situationen berichtet worden 9 während der postoperativen Behandlung Veterinär 8 und in restriktiver Gehäuse einschließlich. Fecal Probenahme spiegelt eine gepoolte Glucocorticoid - Ebene im Laufe der Zeit , statt den Zeitpunkt Probenahme von Plasma und Speichel bot es angemessen für die Überwachung der langfristigen machen, chronische oder saisonale Muster 10. Aufgrund der nicht-invasiveNatur des Verfahrens Proben 11 ohne die Notwendigkeit für die Aufnahme oder Rückhalte wiederholt für einen einzelnen gesammelt werden. Allerdings müssen bestimmte Darmtransitzeit Arten berücksichtigt werden, wenn ein Probenahmeprotokoll zu planen. Bei Pferden ist gut Laufzeit ca. 18 Std 12 daher, Neben Reaktion und anschließender Corticosteron - Metaboliten in den Kot einen Tag nach der ersten Aktivierung der HPA - Achse erfasst werden.
Wenn nicht-invasive Techniken Immunoassay verwendet eine sorgfältige Validierung für die Spezies untersucht 13 von wesentlicher Bedeutung. Darüber hinaus Geschlechtsunterschiede in der Hormon Ausscheidung der Metaboliten wurden in Stoffwechselrate und die Art des Corticosteron - Metaboliten ausgeschieden in verschiedenen Arten , darunter Mäuse 14 und Hühner 15 aufgrund von Unterschieden berichtet wahrscheinlich ist. Es war daher wichtig, als Teil dieses Verfahrens, daß der Assay für die Verwendung sowohl in männlichen und weiblichen Hauspferde validiert wurde wie detailliert in the Protokoll. Dieser Unterschied in der Hormonmetabolismus zwischen den Geschlechtern hat Konsequenzen für die Datenqualität noch ist es selten als Teil der Assayvalidierung angesprochen und einbezogen.
Diese nicht-invasive Methode ermöglicht langfristige Beurteilung der Nebentätigkeit bei domestizierten Pferden. Die Protokolldetails sowohl die Validierung des Assays und der Assay-Technik selbst.
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Protocol
Ethik-Anweisung: Verfahren beteiligt Feld Probenahme und Tier Themen wurden von der Schule für Tier, ländliche und Umweltwissenschaften (ARES) an der Nottingham Trent University genehmigt.
1. Sammlung von Kotproben
HINWEIS: sollten Handschuhe getragen werden, wenn Stuhlproben und Umgang mit Methanol. Wenn es einen starken Verdacht, dass ein Tier aus einem Zoonose, Schutzkleidung wie Laborkittel leiden könnten, sollten auch getragen werden.
- Sammeln Sie die Kotproben so schnell wie möglich (innerhalb von Minuten bis zu einigen Stunden) nach einer Darmentleerung und legen Sie sie in einen Probenbeutel. Dauern drei bis fünf Unterstichproben von jeder defecated Probe mit einem Gesamtgewicht von ca. 10 g. Beschriften Sie die Tasche mit dem Datum und Uhrzeit der Sammlung, individuelle ID und gefrieren die Probe bei -20 ° C bis zur Analyse.
- Zur Minimierung der Fehler, einfrieren alle Proben bei -20 ° C, bis die Studie abgeschlossen ist, die Proben zusammen für die Analyse als eine einzelne Charge dann sammeln. </ Li>
2. Fecal Hormon Extraktion
- Lassen Sie die Kotproben bei RT auftauen.
- Stellen Sie sicher, dass die Proben durch manuelles Mischen jede Probe in einem eigenen Probenbeutel homogenisiert werden.
- Für jede Probe in einem Boot dann wiegen auf einer Mikrowaage 0,50 (± 0,003 g) von Fäkalien wiegen übertragen die Fäkalien auf ein 8 ml Glasfläschchen. Verwenden Sie eine neue wiegen Boot für jede Probe und reinigen Sie die Pinzette mit 30% Methanol zwischen jeder Probe.
- Kombinieren Sie die 0,5 g Fäkalien mit 5 ml 90% Methanol: Wasser, und schütteln O / N auf einem Orbitalschüttler bei RT.
- Am nächsten Morgen, Strudel der Probe und dann für 20 Minuten bei 600 g zentrifugiert werden.
- Man dekantiert die Methanolfraktion in eine 16 x 125 mm Glasrohr 2 und in einem Gestell in einem Wasserbad auf eine Temperatur von 37 ° C eingestellt. Dampfe in einem Abzug mit Luft bis zur Trockenheit. Spülen Sie die Extraktion Fläschchen und legen Sie die restlichen fäkalen Pellets in einer klinischen Abfallbeutel zur Entsorgung bringen.
- Re-suspend die Stuhlextrakten in 100%, 1 ml Methanol und Transfer in ein 12 x 75 mm 2 Polypropylenröhrchen. Sofort verschließen und bei -20 ° C bis zur Analyse.
3. Hormonanalyse
- Führen Sie die Analyse mit einem Enzym Linked-Immunoassay (EIA) polyklonalen Corticosteron CJM006 Antiserum.
. HINWEIS: Eine zweite EIA (Cortisol R4866 Antiserum getestet wurde, aber dies konnte die biochemische Validierungsschritt (siehe Abschnitt 4.1) Die polyklonalen Corticosteron CJM006 Antiserum und Cortisol R4866 Antiserum und die jeweilige HRP des von CJ Munro, University of California geliefert werden, zu erreichen, Davis, CA. - Verdünnen Sie das Antiserum bei 1: 15.000 in Beschichtungspuffer (0,05 M NaHCO3, pH 9,6) eine sich wiederholende Pipette und eine 50 ul Pipettenspitze, legen Sie eine 96-Well Mikrotiterplatte mit 50 & mgr; l / Vertiefung. Die Platte mit Abklebefolie und bebrüten O / N bei 4 ° C. Verlassen zwei Vertiefungen, die nicht-spezifischen Bindungs Vertiefungen darzustellen ungestrichen (NSB).
- Unmittelbar vor dem Gebrauch waschen Sie die Mikrotiterplatten fünfmal eine automatisierte Mikrotiterplatte Wascher (Waschlösung, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).
- Legen Sie die Platten mit 50 & mgr; l pro Vertiefung für die NSB und "Null" Brunnen [EIA - Puffer (0,1 M NaPO 4, 0,149 M NaCl, 0,1% Rinderserumalbumin, pH 7,0) nur], Normen (Corticosteron, 3,9 - 1000 pg / gut) oder Fäkalextrakt Proben (in geeigneter Weise um 1:20 EIA-Puffer verdünnt, siehe Abschnitt 4.1). Standards und Nullen sollten in dreifacher Ausfertigung und vierfacher Ausfertigung, jeweils ausgeführt werden. Verwässertes Fäkalextrakt Proben und NSB sollte doppelt durchgeführt werden.
- Folgen Sie diese sofort mit der Zugabe von 50 & mgr; l / Vertiefung des Etiketts Meerrettichperoxidasekonjugat ᵻ in EIA - Puffer verdünnt auf 1: 70.000.
- Inkubieren der Mikrotiterplatten im Dunkeln für 2 h bei RT.
- Waschen Sie die Mikrotiterplatten mit Waschlösung 5 mal und Inkubation der Platten bei RT im Dunkeln mit 100 ul / well der RT - Substrat [0,4 mM 2,2'-Azino-di- (3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) diammoniumsalz, 1,6 mM H 2 O 2, 0,05 M Citrat, pH 4,0]. Vorbereiten des Substrats unmittelbar vor der Verwendung.
- Verwenden Sie ein Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 405 nm der Mikrotiterplatten zu lesen. Inkubation der Platten wird als vollständig betrachtet, wenn die optische Dichte der Null Vertiefungen 0,8 bis 1,0 erreicht.
- Um sicherzustellen , Wiederholbarkeit, verwenden Kontrollen [EIA - Standards oder einer biologischen Probe , verdünnt in EIA - Puffer bei etwa 30% (EIA - Standard) zu binden, 50% (eine biologische Probe zB Pool von Hauspferd Fäkalextrakt) und 70% (EIA - Standard) ] intra- und inter-Assay-Variationskoeffizienten von <10% und <15% bzw. zu demonstrieren.
4. Enzyme Linked-Immunoassay: Validierung für die Studie Spezies und Sex
- Biochemische Validation (Parallelism)
- Mit EIA Puffer, führen Sie eine serielle Verdünnung auf gepoolten fäkale Extract, im Idealfall genommen von Verdacht auf hohe und niedrige Hormonkonzentration Proben von mehreren Personen (Bereich: ordentlich, 1: 2 bis 1: 8192) und auf der EIA laufen, wie in Kapitel 3 beschrieben.
ANMERKUNG: Eine Parallelität erreicht betrachtet, wenn die Reihenverdünnungen von Stuhlextrakten eine Verschiebungskurve parallel zu der Standardkurve und der linearen Regressionsergebnisse ergeben zeigen R2> 0,90, eine Steigung> 0,50 und p <0,05. Die serielle verdünnte Fäkalextrakt , die rund 50% auf die Standardkurve bindet sollte die ideale Verdünnung betrachtet werden alle Stuhlextrakten zu laufen (zB 1:20). Es gibt keine Störungen auf den Assay betrachtet, wenn die lineare Regressionsergebnisse zeigen, R2> 0,90 und p <0,05.
- Mit EIA Puffer, führen Sie eine serielle Verdünnung auf gepoolten fäkale Extract, im Idealfall genommen von Verdacht auf hohe und niedrige Hormonkonzentration Proben von mehreren Personen (Bereich: ordentlich, 1: 2 bis 1: 8192) und auf der EIA laufen, wie in Kapitel 3 beschrieben.
- Biochemische Validation (Interferenz)
- Spike 200 & mgr; l seriell verdünnte Standards (Null, 3,9 bis 1000 ng / well Corticosteron) mit 200 ul der entsprechend verdünnten gepoolt Fäkalextrakt [bei 50% verdünnt paralleli bestimmten Bindungsm (1:20)] und laufen auf der EIA wie in Abschnitt 3 EIA Analyseplot Nach der beobachtete Konzentration minus der Hintergrund (Konzentration der Nullprobe) im Vergleich zu der erwarteten Konzentration.
HINWEIS: Wenn die Zugabe von verdünnter gepoolt Fäkalextrakt Standards nicht wesentlich ändern , um die Menge zu erwarten und die lineare Regression Ergebnisse liefert R 2> 0,90, eine Steigung nahe bei 1,0 und p <0,05. Keine Interferenz mit der EIA wurde erreicht.
- Spike 200 & mgr; l seriell verdünnte Standards (Null, 3,9 bis 1000 ng / well Corticosteron) mit 200 ul der entsprechend verdünnten gepoolt Fäkalextrakt [bei 50% verdünnt paralleli bestimmten Bindungsm (1:20)] und laufen auf der EIA wie in Abschnitt 3 EIA Analyseplot Nach der beobachtete Konzentration minus der Hintergrund (Konzentration der Nullprobe) im Vergleich zu der erwarteten Konzentration.
- Biologische Validierung:
Hinweis: Eine Demonstration , dass die gewählte EIA die Fähigkeit zur Messung der biologisch relevanten Änderungen des Hormons von Interesse hat [zB der Anstieg der Glukokortikoid - Konzentrationen nach einer pharmakologischen (ACTH ist oft ein lizenzierter Verfahren) oder biologische Herausforderung (zB psychologische und / oder Umwelt, eher eine opportunistische unregulierten Ereignis)] zu sein.- Wählen Sie, zu extrahieren und zu analysieren Kotproben für Glucocorticoid MetabolitkonzentrationenVerwendung des Verfahrens in Abschnitten ausführlich 1-3 vor und nach einem schwierigen Fall.
HINWEIS: Eine anspruchsvolle Veranstaltung artspezifisch sein wird. Ein beispielhaftes Verfahren wird im Folgenden für das Hauspferd zur Verfügung gestellt. Ausführliche Beispiele für anspruchsvolle Veranstaltungen für Pferde wurden zuvor einschließlich der Verwendung von Management - 9 und Haltungsverfahren 16 veröffentlicht. Ein signifikanter Anstieg der Glucocorticoid-Metabolitenkonzentrationen nach dem herausfordernden Ereignis muss anhand einer statistischen Analyse beobachtet und bestätigt werden. Diese müssen über die gegebenenfalls die Wirkung der wiederholten Messungen, Proben Datum und individuell. Biologische Validierung wird angenommen, dann erreicht.
- Wählen Sie, zu extrahieren und zu analysieren Kotproben für Glucocorticoid MetabolitkonzentrationenVerwendung des Verfahrens in Abschnitten ausführlich 1-3 vor und nach einem schwierigen Fall.
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Representative Results
Hauspferde (n = 16, 8 Stuten, 8 Wallache) mit einem mittleren Alter von 15 Jahren (± 3) wurden nach Geschlecht gruppiert und zu vier Gehäusebauformen mit zunehmenden sozialen Isolation unterworfen (n = 4 Pferd / Behandlung). Das Gehäuse 1 beteiligt Pferde in einer Herde Umgebung leben, eng ihrem natürlichen Lebensraum zu simulieren. Das Gehäuse 2 beteiligt Pferde paarweise in einer Indoor-Scheune leben. Das Gehäuse 3 beteiligten Pferde allein in Ställen untergebracht, aber mit Sichtkontakt zu anderen Pferden und Gehäuse 4 beteiligt totale Isolation der Pferde.
Exposition gegenüber jeder Behandlung wurde in einer randomisierten Blockdesign für einen Zeitraum von fünf Tagen. Im Anschluss an diese die Pferde wurden in Gras Paddocks in ihren experimentellen Gruppen für zwei Tage vor der Exposition gegenüber der Behandlung nächsten Gehäuse herausstellte. Kotproben wurden an den Tagen einmal pro Tag gesammelt 1, 2 und 3 in jedem Gehäuse Behandlung von n = 8 Pferde ausgegeben (n = 2 Pferde innerhalb jeder Behandlung). Kotproben wurden so schnell wie möglich und innerhalb von 1 h nach der Defäkation gesammelt. Alle Proben wurden nach 1200 Stunden auf dem ersten vollen Tag der Stallung Bedeutung gesammelt, dass die erste Probe am ersten Tag mindestens 20 Stunden gesammelt wurde, nachdem das Pferd mit dem Gehäuse Behandlung eingeführt wurde. Die Proben von Tag eins, zwei und drei (insgesamt 24 Proben pro Gehäusedesign) wurden für die fäkale Corticosteron Ebenen reflektiert die letzten 18 Stunden beurteilt aufgrund Durchtrittsgeschwindigkeit von Digesta 12. Die gleichen einzelnen Pferde wurden für fäkale Analysen während der gesamten Studie verwendet. Für vollständige Details dieser biologischen Herausforderung, einschließlich zusätzlicher Messgrößen finden Sie in den veröffentlichten Arbeiten 9 Alternative Beispiele für anspruchsvolle Veranstaltungen für Hauspferde können auch in der Literatur 16 zu finden.
Dieser Abschnitt enthält Beispiel Ergebnisse einer biochemischen Validierung (Parallelität) für beide corticosterone und Cortisol bei männlichen und weiblichen Hauspferd Kot. Dieser Abschnitt enthält auch repräsentative Daten aus fäkalen Extraktion und EIA-Analyse erhalten. Die Ergebnisse wurden im Rahmen einer größeren Studie erhalten, die die Auswirkungen der sozialen Isolation , die durch Gehäusedesign untersucht, bei der Pferde-Verhalten und Physiologie 9.
Die Ergebnisse der biochemischen Validierung ergab , dass die Corticosteron EIA adrenale Aktivität zu messen [1A männlichen Probe% Bindung = 25,349 + 0,729 (Standard% Bindung), R2 = 0,9545, F (1, 7) = 146,710, p weniger geeignet war als 0,001); 1B weibliche Probe% Bindung = 29,989 + 0,7198 (Standard% Bindung), R2 = 0,95594, F (1, 7) = 151,865, p weniger als 0,001] , aber nicht das Cortisol EIA [1C männlichen Probe% Bindung = 79,089 + 0,0629 (Standard% Bindung), R2 = 0,175, F (1, 7) = 1,485, p = 0,262); 1D weibliche Probe% Bindung = 81,652 + 0,0772 (Standard% Bindung), R2 = 0,257, F (1, 7) = 2,422, p = 0,164]. Da die Corticosteron EIA Parallelität im Gegensatz zu den Cortisol EIA und Störprüfung auf der Corticosteron demonstriert ergab EIA keine Hinweise auf eine Matrix Interferenz als Zugabe von verdünnter fäkal-Extrakt zu Corticosteron-Standards hat den Betrag nicht ändern erwartet (männlich: Beobachtete = 1,302 + 1,017 (Erwartete) R2 = 0,9972, F1, 7 = 1287,128, p <0,001; weiblich: Beobachtete = 0,3169 + 1,0931 (voraussichtlich), R2 = 0,9972, F1, 7 = 2432,65, p <0,001;).
Die Ergebnisse der EIA ergab , dass es keinen signifikanten Unterschied in Corticosteron Ebenen zwischen männlichen Pferden (M = 37,7, SD = 14.1) und weibliche Pferde (M = 33,8, SD = 12,7; t (70) = 1,23, p = 0,22) . Die Höhe der fäkalen Corticosteron erhöht als die Höhe der Isolation erhöht. Isolierte Pferde (Gehäusedesign 4) hatten eine signifikant hoheer Niveaus des fäkalen Corticosteron im Vergleich zu allen anderen Gehäusebauformen (Wilks Lambda = 0,58, F (3, 18) = 4,29, p = 0,01, multivariate Teil eta Quadrat = 0,42; p ≤0.02). Die Höhe der fäkalen Corticosteron höher war für alle Pferde, die auf allen drei Testtage während der am stärksten isolierten Gehäuse, wenn zu den anderen Gehäuse Behandlungen verglichen. Die Konzentrationen der mittlere fäkale Corticosteron für jede Gehäusedesign für jeden Tag sind in Tabelle 1 dargestellt.
Abbildung 1. Biochemische Validation (Parallelism) eines Corticosteron und Cortisol Enzyme Linked-Immunoassay für männliche und weibliche Pferde. Diese Zahl beschreibt die Prozent der seriellen verdünnten Pools von männlichen Bindung und weibliche Hauspferd Stuhlextrakten gegen steigende Corticosteron und Cortisol Standardkurve Konzentrationen auf eine UVP. Die Ergebnisse zeigen, dass dieCorticosteron (A, männlich, B, weiblich) und nicht die Cortisol EIA (C, männlich, D, weiblich). ergab eine erfolgreiche Verlagerungskurve parallel mit der EIA Standardkurve Corticosteron Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| MEAN (± SD) FÄKALE Corticosteron (ng / g) in jedem Gehäuse BEHANDLUNG | ||||
| WOHNUNGS BEHANDLUNG | Tag 1 | Tag 2 | Tag 3 | INSGESAMT |
| 1 | 31,73 ± 10,2 | 32.18 ± 8.0 | 29.22 ± 5.9 | 31.05 ± 7.8 |
| 2 | 32,75 ± 10,0 | 33,66 ± 12,9 | 34.67 ± 9.3 | 33,69 ± 10,3 |
| 3 | 35.06 ± 14,6 | 35,14 ± 15,9 | 33,13 ± 12,5 | 34,44 ± 13,6 |
| </ Td> | * | |||
| 4 | 38,16 ± 17,8 | 42.00 ± 16,7 | 41,52 ± 17,6 | 40,56 ± 16,5 |
Tabelle 1 : Mittlere (± SD) Fecal Corticosteron (ng / g) für jedes Gehäuse Behandlung für Days Eins, Zwei und Drei und mittlere Fecal Corticosteron (ng / g) für alle drei Tage (Overall) in jedem Gehäuse Behandlung. Diese Tabelle zeigt die Mittelwerte für fäkale Corticosteron (ng / g) ± Standardabweichung für jede der Gehäusebehandlungen während des Tages ein, zwei und drei. Die Proben wurden mindestens 20 Stunden gesammelt, nachdem Pferde das Gehäuse eingetragen. Es zeigt auch, mittlere fäkale Corticosteron (ng / g) ± Standardabweichung für alle drei Tage (insgesamt) in jedem Gehäuse Behandlung. Die fäkale Corticosteron KonzentratIon war signifikant höher (*) während der isolierten Gehäuse-Design. Die niedrigste Konzentration von fäkalen Corticosteron für alle Tage in der Gruppe untergebracht Behandlung (Behandlung 1). Angepasst von Yarnell et al. (2015), mit freundlicher Genehmigung der Zeitschrift für Physiologie und Verhalten.
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Discussion
Fecal Corticosteron Analyse stellt ein Mittel zur bei Pferden langfristig Muster der Nebentätigkeit zu beurteilen. Die nicht-invasive Art des Verfahrens überwindet die verwirrende Wirkung anderer Stichprobenverfahren verwendet , um adrenale Aktivität einschließlich Speichel und Plasmaanalyse 9 beurteilen. Darüber hinaus hat die Technik eine klare, nicht-invasive Vorteil, wenn freilaufenden Pferde zu studieren.
Es gibt mehrere wichtige Punkte in Bezug auf diese Methode und ihre angemessene Nutzung zu diskutieren. Ein entscheidender Schritt in dem Protokoll ist die Validierung des Tests für die betreffende Art und entsprechende Antikörper Wahl. Wenn der verwendete Antikörper kreuzreagiert mit Metaboliten von strukturell ähnlichen , aber funktionell verschiedene Glucocorticoide könnte diese Ergebnisse durcheinander bringen 17. Deshalb, um Assays Hormonmetaboliten messen eine sorgfältige physiologischen oder biologischen Validierung erforderlich ist , deren Einzelheiten in der Literatur existieren 18,19 und innerhalb des Protokolls Beschribed.
Der Zustand der Stuhlprobe muss einschließlich Frische zu betrachten der Probe und der Umweltexposition , die gezeigt wurden , sowohl auf hormonelle Metabolitenspiegel 20 beeinflussen. Übermäßige regen oder Sonnenschein Exposition sind dafür bekannt , steigt zu verursachen oder verringert im Metabolitenkonzentrationen aufgrund von bakteriellen Verstoffwechselung 21. Forscher, die wünschen Proben von unterschiedlichem Grad der Frische zu sammeln, muss die Wirkung der Zeit auf Probenintegrität, zusätzlich zu den Auswirkungen auf die Umwelt zu untersuchen. Dies kann vor der Studie durch die Einrichtung eines kleinen Experiment durchgeführt werden und in regelmäßigen Abständen Kot von männlichen und weiblichen Individuen Abtasten, mit unterschiedlichem Grad der Frische und der Belastung durch Klimavariablen variiert wird.
In den meisten Forschungsszenarien Proben von bekannten Personen werden 10 hilfreich oder notwendig sein. In Hauspferde kann dies durch die Überwachung einer Gruppe für den Darm zu entleeren oder mit der aufgenommenen Nahrung Marker-ID erreicht werdenentify Kot von Individuen in größeren Gruppen 12. Im freien Bereich Spezies nachweisen kann dies zeitaufwendig, da individuelle Tracking erforderlich sein wird.
Wenn die Methode der Glucocorticoid-Analyse der Auswahl muss berücksichtigt werden, dass die Ergebnisse der fäkalen Corticosteron-Test eine gepoolte Probe über die Zeit eher als ein Zeitpunkt Maßnahme darstellen; Daher wird es weniger Schwankungen in den Daten sein. Wenn die Forscher in langfristigen Auswirkungen einer Situation interessiert ist, Haltung Technik oder Management-Praxis dann fäkale Analyse bietet eine geeignete Technik. Wenn Einschätzung der kurzfristigen Muster in der Hormonkonzentration, die erforderlich ist, dann würde Plasma oder Speichel-Analyse die bevorzugte Methode sein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
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