Introduction
所描述的方法的目的来分析，以便提供肾上腺活动的非侵入性的评价在马粪便皮质酮浓度。测量下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴（HPA）的活动是一个公认的方法来研究在两个俘虏和国内品种可能厌恶的情况下的响应。参考技术和最广泛使用的方法是使用血浆1然而，替代的方法如粪便分析人为了克服由采血本身引起的应力，并允许监测自由测距物种的能力得到了发展。
在厌恶的情况下，生理动态平衡被打乱。在大脑释放促肾上腺皮质激素作用于垂体前叶，刺激促肾上腺皮质激素（ACTH）的释放释放激素（CRH）下丘脑。促肾上腺皮质激素进入血液，刺激肾上腺皮质分泌物种的具体糖皮质激素（GC）。糖皮质激素有密切联系的应激事件，而不是因此它们优先于其他应激激素的链接通常2测量的所有能量提高国家被一致产生。糖皮质激素是负责马匹数自适应的效果。能量被迅速地从存储位点中的脂肪酸和葡萄糖的形式体动员，氧摄取量的增加，感觉功能增强3和血流减少到没有必要移动4个区域。以及用作应对机构，在糖皮质激素的应力引起的上升也可能有助于制备动物为下一个压力源5。
评估血浆激素水平和唾液涉及测量实际循环激素然而，测量代谢物在粪便措施的激素的代谢终产物。循环类固醇分解代谢的L到，这里它们经受肠道6内菌群的酶活性促进进一步的变化胆汁排泄之前艾弗。因此，针对血糖皮质激素的免疫测定可能不适合用于粪便的糖皮质激素的代谢产物7的分析。
作为粪便收集可以没有干扰对马进行，粪便为皮质酮的分析，已被广泛用于监测在许多情况HPA活性。在马的粪便升高皮质酮已经报道响应于潜在厌恶情况，包括在手术后的兽医治疗8和限制性壳体9。粪便采样反映一段时间内汇集糖皮质激素水平，而不是由血浆和唾液提供实时采样使它更适合监测长期，慢性或季节性模式10点。由于非侵入性该方法的性质，样品可反复，而不需要对捕获或约束11的个体收集的。然而，在规划一个采样协议时物种特异性肠道转运时间，必须考虑到。在马，肠道运输时间大约是18小时12因此，肾上腺反应和随后的皮质酮代谢物可在粪便中一天HPA轴的初始激活后检测。
当使用非侵入性免疫分析技术正在调查该物种进行仔细验证是必需的13。此外，在激素代谢物的排泄性别差异已可能是由于在代谢率和在不同物种包括小鼠14，和鸡15排出皮质酮代谢物的类型的不同的报道。因此，有作为此方法的测定法验证在男性和女性国内马使用的一部分重要的，因为是在第详细Ë协议。男女之间的激素代谢这种差异对数据质量的后果，但它很少讨论并作为实验验证的一部分。
这种非侵入性方法允许在国内马肾上腺活性长期评估。该协议的细节在测定两者的验证和测定技术本身。
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Protocol
伦理学声明：涉及野外采样和动物个体程序已通过动物，农村与环境科学（ARES）在诺丁汉特伦特大学学院。
1.粪便样本的收集
注：手套应处理粪便样本和甲醇时佩戴。如果有一个强烈怀疑的动物能够从一种人畜共患疾病，防护服是患如白大褂也应佩戴。
- 尽快收集粪便样本（内分几个小时）以下的排便，将它们放入一个样品袋中。采取任何大便样品三至五子样本与大约10克总重量。标记的时间和收集，个别ID的日期的袋子，在-20冻结样品℃直至分析。
- 为了尽量减少错误，冻结所有样品在-20 °C，直到研究完成，然后收集样品一起分析，单批</ LI>
2.粪便激素提取
- 离开粪便样品在室温下解冻。
- 确保该样品通过在其自己的样品袋各样品手工混合均匀。
- 对每个样品称重0.50粪便物质的（±0.003克）上微量天平在称量舟然后粪便转移到8毫升的玻璃小瓶中。使用新的权衡船每个样本与每个样品之间30％的甲醇清洁镊子。
- 结合0.5克粪便物质的用5毫升90％甲醇：水，并在在室温下轨道摇床摇动O / N。
- 第二天早晨，涡旋样品，然后在600克离心20分钟。
- 滗在设定为37℃的温度下的水浴齿条甲醇馏分到一个16×125 平方毫米的玻璃管和地点。蒸发在通风橱用空气至干。冲洗提取小瓶和剩余的粪便颗粒放入一个临床废物袋处置。
- 重悬的粪便提取物在100％，1毫升甲醇和转移到一个12×75毫米2的聚丙烯管中。马上帽并储存在-20℃直至分析。
3.激素分析
- 开展与使用皮质酮多克隆抗血清CJM006的酶联免疫分析（EIA）的分析。
注意：第二次环评进行了测试（皮质醇R4866抗血清，但未能达到生化验证步骤（见第4.1节）多克隆皮质CJM006抗血清皮质醇R4866抗血清和相应的HRP的是由CJ蒙罗，加州大学提供，戴维斯，CA. - 在1稀释的抗血清：使用重复吸管和50微升枪头在包被缓冲液（0.05M碳酸氢钠，pH值9.6）15,000，装入96孔微量滴定板与50μl/孔。盖上板密封该板，并在4℃孵育O / N。假两件未涂井代表非特异性结合井（NSB）。
- 使用前立即用自动微量滴定板垫圈（0.15 M氯化钠，0.05％吐温20洗涤溶液）洗涤微量滴定板五次。
- 加载板，每孔50微升为NSB的和“零”的孔[EIA缓冲液（0.1M磷酸钠4，0.149摩尔NaCl，0.1％牛血清白蛋白，pH 7.0）中仅]，标准（皮质酮，3.9 - 1000皮克/好）或粪便提取物样品（在1:20 EIA缓冲液适当稀释，见4.1）。标准和零点应一式三份，并一式四份分别运行。稀释粪便提取物样品和NSB的应一式两份运行。
- 70000：立即加入50微升/孔的EIA缓冲液稀释至1标签辣根过氧化物酶结合物ᵻ按照此。
- 孵育在黑暗中微量滴定板在室温2小时。
- 用洗涤液在室温在暗处用100微升洗涤微量滴定板5次，并培育板/ WEL升的RT衬底[0.4mM的2,2'-连氮基-二- （3-乙基磺酸）二铵盐，1.6毫的 H 2 O 2，0.05M的柠檬酸盐，pH为4.0]中。准备基底在使用前立即。
- 使用分光光度计在405nm的波长读取微量滴定板。板的温育被认为完成时，零孔的光密度达到0.8至1.0。
- 以确保可重复性，使用在EIA缓冲液稀释到结合在约30％（EIA标准），50％（生物样品如国内马的粪便提取物的池）和70％（EIA标准）的控制[EIA标准或生物样品]分别展示出的<10％的变化和<15％的区域内和测定间的系数。
4.酶联免疫法：为验证研究物种和性别
- 生化验证（并行）
- 使用EIA缓冲池化粪额外进行连续稀释CT，最好从疑似高，低浓度的激素样取自几个人（范围：整齐，1：2至1：8192）和第3节中描述的EIA运行。
注意：被视为实现了并行时粪便提取物的连续稀释产生平行于标准曲线和线性回归结果的位移曲线展示R2> 0.90，坡度> 0.50和P <0.05。该标准曲线上结合约50％的序列稀释的粪便提取物应该被认为是理想的稀释运行所有粪便提取物（ 例如，1:20）。没有对测定考虑当线性回归结果表明R2> 0.90和p <0.05的干扰。
- 使用EIA缓冲池化粪额外进行连续稀释CT，最好从疑似高，低浓度的激素样取自几个人（范围：整齐，1：2至1：8192）和第3节中描述的EIA运行。
- 生化验证（干扰）
- 穗200微升的连续稀释的标准（零，3.9到1000纳克/孔皮质酮）与200微升适当稀释汇集粪便提取物[在50％稀释的结合而paralleli确定SM（1:20）和环评作为运行在第3节继EIA分析图观察到的浓度减去背景（零样品浓度）与预期的浓度。
注：如果在加入稀释汇集粪便提取物与标准不显著改变量预期和线性回归的结果产生，R 2> 0.90，接近1.0且p <0.05的斜率。环评无干扰已经实现。
- 穗200微升的连续稀释的标准（零，3.9到1000纳克/孔皮质酮）与200微升适当稀释汇集粪便提取物[在50％稀释的结合而paralleli确定SM（1:20）和环评作为运行在第3节继EIA分析图观察到的浓度减去背景（零样品浓度）与预期的浓度。
- 生物验证：
注：所选择的环境影响评价具有测量感兴趣的激素生物相关变化的能力演示[ 例如，在以下药理糖皮质激素浓度上升（ACTH往往是有执照的程序）或生物攻击（ 例如，心理和/或环境;更可能是一种机会不管制事件）。- 选择，提取和分析粪便样本对糖皮质激素代谢物浓度使用1节详述的过程 - 前一个具有挑战性的事件之后3。
注：一个具有挑战性的活动将是具体的物种。的示例方法是针对国内马下面提供。马具有挑战性的活动全部例子已经包括使用管理9和饲养过程16先前公布。糖皮质激素代谢物浓度显著上升后的富有挑战性的活动必须遵守并利用统计分析证实。这必须包括在适当情况下，重复测量，采样日期和个人的影响。生物验证，然后视为实现。
- 选择，提取和分析粪便样本对糖皮质激素代谢物浓度使用1节详述的过程 - 前一个具有挑战性的事件之后3。
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Representative Results
国产马（N = 16，8匹母马，8阉马）15年（±3），平均年龄按性别，进行到四房的设计与社会隔离（N = 4马/治疗）的增加水平分组。房屋1参与马生活在畜群环境，密切模拟其自然栖息地。房屋2匹涉及生活在对在室内谷仓。房屋3参与马马厩但视觉接触到其他马匹和马匹房屋涉及4完全隔离单独放置。
暴露于每种处理是在一个随机的块设计，为期五天。在此之后的马匹曝光到下壳体治疗前原来成草围场在他们的实验组两天。粪便样品收集每天一次天1，2和3从每组8马每个壳体处理（内花每次治疗中的N = 2匹）。粪便样品尽快收集尽可能和排便后1小时之内。即在一天的第一样品收集至少为20小时的马被引入到壳体处理后后的停放含义第一天1200小时所有样品收集。从一两天，三个（共％的住房设计24个样品）样品进行了评估，由于消化12的通过率反射过去18小时的粪便皮质酮水平。同一个人的马匹被用于整个研究粪便分析。对于这种生物的挑战的全部细节，包括额外的测量参数请参照国内的马具有挑战性的事件发表的作品9备用的例子也可以在文献中找到16。
本节为双方提供一个心病生化验证（并行）结果示例ticosterone和皮质醇的男性和女性的驯马屎。本节还提供了从粪便中提取和EIA分析得到的代表性数据。结果作为更大的研究，调查引起壳体设计社会隔离的影响，在马的行为和生理9的一部分得到。
生化验证的结果表明，皮质酮EIA是适当的测量肾上腺活性图1A男性样本％结合= 25.349 + 0.729（标准％结合），R 2 = 0.9545，F（1,7）= 146.710，对小于0.001）; 图1B雌性样品％结合= 29.989 + 0.7198（标准％结合），R 2 = 0.95594，F（1,7）= 151.865，对小于0.001]，但不皮质醇EIA [ 图1C男性样本％结合= 79.089 + 0.0629（标准％结合），R 2 = 0.175，F（1,7）= 1.485，p = 0.262）; 图1D雌性样品％结合= 81.652 + 0.0772（标准％结合），R 2 = 0.257，F（1,7）= 2.422，P = 0.164]。由于皮质酮EIA证明不像皮质醇EIA和干扰测试的皮质酮并行EIA没有发现基质干扰的证据，因为加入稀粪便提取物皮质酮的标准并没有改变预期的金额（男：实测值= 1.302 + 1.017（预期） ，R 2 = 0.9972，F1，7 = 1287.128，p <0.001;女性：观测= 0.3169 + 1.0931（预期），R 2 = 0.9972，F1，7 = 2432.65，p <0.001）。
环境影响评估的结果显示，有雄性马（M = 37.7，SD = 14.1），女马之间的皮质酮水平没有显著差异（M = 33.8，SD = 12.7; T（70）= 1.23，P = 0.22） 。粪皮质酮水平随着隔离级别增加。隔离马（房屋设计4）有显著高呃粪便皮质酮的水平相比，所有其他住房设计（威尔克斯波长= 0.58，F（3,18）= 4.29，P = 0.01，多元偏Eta平方= 0.42，P≤0.02）。粪皮质酮水平相比，其他住房时，治疗最偏远的住房时是在所有这三个样本天所有的马高。每个壳体设计的每一天的平均粪便皮质酮的浓度在表1中。
一个皮质酮和皮质醇酶联免疫分析男，女马图1.生化检验（平行）。此图详细介绍了百分之反对增加皮质酮和皮质醇标准曲线的男性和女性的驯马的粪便提取物系列稀释池结合环境影响评估。的结果表明，该皮质酮（A，男性; B，女），而不是皮质醇EIA（C，男性; D，女）。产生了位移曲线平行于皮质酮EIA标准曲线成功的请点击此处查看该图的放大版本。
| 平均（±SD）粪皮质酮（纳克/克）的每套住房治疗 | ||||
| HOUSING治疗 | 1天 | 第2天 | 第3天 | 总体 |
| 1 | 31.73±10.2 | 32.18±8.0 | 29.22±5.9 | 31.05±7.8 |
| 2 | 32.75±10.0 | 33.66±12.9 | 34.67±9.3 | 33.69±10.3 |
| 3 | 35.06±14.6 | 35.14±15.9 | 33.13±12.5 | 34.44±13.6 |
| </ TD> | * | |||
| 4 | 38.16±17.8 | 42.00±16.7 | 41.52±17.6 | 40.56±16.5 |
表1.平均（±SD）粪皮质酮（纳克/克）每个房屋治疗的日子之一，二，三和平均粪便皮质酮（纳克/克），对所有三天（总体）在每个住宅治疗。此表显示对于粪便皮质酮（纳克/克）的平均值每天一，二，三中±每个的外壳的治疗标准偏差。样品收集至少为20小时的马进入外壳之后。它也显示平均粪便皮质酮（纳克/克）±标准差为全部三天（整体）中的每个壳体治疗。粪便皮质酮concentrat离子是显著升高（*）独立的房屋设计中。所有天粪皮质酮浓度最低的群养处理（处理1）被发现。从亚内尔等改编。（2015），从生理学杂志和行为的许可。
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Discussion
粪便皮质酮分析提供了评估在马肾上腺活性长期型态的手段。该方法的非侵入性克服了用于评估肾上腺活性，包括唾液和血浆分析9其他采样方法混杂影响。此外，该技术具有如果学习自由测距马匹的明确的非侵入性的优势。
有几个关键点对本方法及其适当的使用进行讨论。在协议中的一个关键步骤是测定在质询和适当抗体的选择品种的验证。如果所使用的抗体与结构相似但功能不同的糖皮质激素的代谢产物交叉反应，这可能混淆结果17。因此，实验测量激素的代谢产物需要进行仔细的生理或生物验证，其中的细节在文献18,19和协议DESCR中存在IBED。
需要考虑包括已都被证明影响激素代谢物水平20的样品和环境暴露的新鲜粪便样品的条件。过度雨或阳光曝露已知会造成增加或代谢物浓度减小由于细菌代谢21。谁希望收集不同程度的新鲜感样本的研究人员必须调查的时间对样品的完整性的影响，除了对环境的影响。这可以在研究之前，通过建立一个小实验，并定期从雌雄个体取样粪便，伴有不同程度的新鲜感和暴露的气候变量来完成。
在大多数情况下的研究，从已知的个体样本将是有益的或必需的10。在国内的马匹，这可以通过监视组排便或使用摄入的食物标记ID来实现entify来自个人的粪便在大组12。在自由放养的品种，这可能证明是一次个别跟踪将需要耗时。
当选择的糖皮质激素分析的方法，必须考虑该粪便皮质酮测定的结果表示汇集样品随着时间的推移，而不是在时间测量一个点;因此，将有在数据波动更少。如果研究者有兴趣的局面长期影响，饲养技术或管理实践再粪便分析提供了一个合适的技术。如果需要在激素浓度的短期模式评估然后血浆或唾液分析将是优选的方法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
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