Introduction
Gli obiettivi metodo descritto per analizzare le concentrazioni di corticosterone nelle feci equine per fornire una valutazione non invasiva dell'attività surrenale. Misurazione dell'attività (HPA) dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene è un approccio accettato di studiare la risposta a situazioni potenzialmente avversi in entrambe le specie in cattività e nazionali. La tecnica di riferimento e il metodo più diffuso è l'uso di plasma sanguigno 1 Tuttavia, metodi alternativi come l'analisi fecale sono state sviluppate per superare lo stress indotto mediante campionamento sangue stesso e permettere la possibilità di monitorare le specie che vanno.
Durante una situazione di avversione, l'omeostasi fisiologica è interrotta. L'ipotalamo nel cervello rilascia ormone di rilascio della corticotropina (CRH), che agisce sulla ghiandola pituitaria anteriore e stimola il rilascio di ormone adrenocorticotropo (ACTH). ACTH entra nel flusso sanguigno e stimola la corteccia surrenale a secernere species glucocorticoidi specifici (GC). I glucocorticoidi sono strettamente legate ad eventi stressanti piuttosto che essere prodotta in modo coerente in tutti gli stati di energia accresciuta quindi sono spesso misurati in preferenza rispetto ad altri di stress legato ormoni 2. I glucocorticoidi sono responsabile di diversi effetti di adattamento nei cavalli. Energia viene rapidamente mobilizzato da siti di stoccaggio nel corpo sotto forma di acidi grassi e glucosio, assunzione di ossigeno viene aumentata, funzione sensoriale è migliorata 3 e il flusso di sangue è diminuita ad aree non necessarie per il movimento 4. Così come in qualità di un meccanismo di coping, l'aumento indotto stress nella glucocorticoidi può anche aiutare a preparare l'animale per il prossimo 5 fattore di stress.
Valutare livelli dell'ormone nel plasma e nella saliva coinvolge misurare l'ormone effettivo circolante Tuttavia, misurando i metaboliti nelle misure feci il prodotto finale del metabolismo dell'ormone. steroidi circolanti sono catabolizzati nella liver prima di escrezione della bile dove subiscono ulteriori modifiche facilitati dalle attività enzimatiche della flora batterica intestinale all'interno della traccia 6. Pertanto, saggi immunologici diretti verso glucocorticoidi nel sangue può non essere adatto per l'analisi dei metaboliti fecali glucocorticoidi 7.
Come raccolta fecale può essere effettuata con nessun disturbo al cavallo, analisi delle feci per corticosterone, è stato ampiamente utilizzato per monitorare l'attività HPA in una serie di circostanze. Corticosterone elevata nelle feci dei cavalli è stata riportata in risposta a situazioni potenzialmente avversi anche durante post-operatorio trattamento veterinario 8 e nelle abitazioni restrittiva 9. Campionamento fecale riflette un livello di glucocorticoide pool nel corso del tempo, piuttosto che il punto di campionamento in tempo offerto dal plasma e la saliva che lo rende adatto per il monitoraggio a lungo termine, cronica o modelli stagionali 10. A causa della non-invasivanatura del metodo, i campioni possono essere ritirati ripetutamente per un individuo senza la necessità di cattura o di ritenuta 11. Tuttavia, specie specifica il tempo di transito intestinale deve essere preso in considerazione quando si pianifica un protocollo di campionamento. Nei cavalli, il tempo di transito intestinale è di circa 18 ore 12 Pertanto, la risposta surrenale e successive metaboliti corticosterone possono essere rilevati nelle feci un giorno dopo attivazione iniziale dell'asse HPA.
Quando utilizzando tecniche non invasive immunodosaggio una validazione accurata per le specie oggetto di indagine è essenziale 13. Inoltre, le differenze di sesso ormone metaboliti sono stati segnalati probabilmente a causa di differenze nel tasso metabolico e il tipo di metabolita corticosterone escreto nelle varie specie, tra cui topi, 14 e polli 15. Era quindi importante nell'ambito di questo metodo che il test è stato convalidato per l'uso in maschi e femmine cavalli domestici come dettagliato in the protocollo. Questa differenza nel metabolismo ormonale tra i generi ha conseguenze per la qualità dei dati eppure raramente si rivolge e incluso come parte di convalida del test.
Questo metodo non invasivo consente la valutazione a lungo termine di attività surrenalica nei cavalli domestici. I dettagli del protocollo sia la validazione del test e la tecnica di analisi in sé.
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Protocol
Etica dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti campo di campionamento e di animali sono stati approvati dalla Scuola di animali, rurale e Scienze Ambientali (ARES) alla Nottingham Trent University.
1. Raccolta di campioni di feci
NOTA: I guanti devono essere indossati durante la manipolazione dei campioni fecali e metanolo. Se c'è un forte sospetto che un animale possa essere affetto da una zoonosi, indumenti protettivi, come un camice da laboratorio dovrebbe essere indossati.
- Raccogliere i campioni fecali appena possibile (entro min a qualche ora) dopo la defecazione e metterli in un sacchetto di campionamento. Prendere tre a cinque sotto-campioni di qualsiasi campione defecato con un peso totale di circa 10 g. Etichettare il sacchetto con l'ora e la data di raccolta, ID individuale, e congelare il campione a -20 ° C fino al momento dell'analisi.
- Per ridurre al minimo errore, congelare tutti i campioni a -20 ° C fino a quando lo studio è completo quindi di raccogliere i campioni insieme per l'analisi in un unico lotto. </ Li>
2. fecale Hormone Estrazione
- Lasciare i campioni di feci per scongelare a temperatura ambiente.
- Assicurarsi che i campioni sono omogeneizzati miscelando manualmente ogni campione nel proprio sacchetto di campionamento.
- Per ogni campione pesa 0.50 (± 0,003 g) di materiale fecale su una microbilancia in una barca pesare poi trasferire le feci in una fiala di vetro 8 ml. Utilizzare una nuova barca pesare per ogni campione e pulire le pinzette con il 30% di metanolo tra ogni campione.
- Unire la 0,5 g di materiale fecale con 5 ml di metanolo al 90%: acqua e agitare O / N in un agitatore orbitale a RT.
- La mattina seguente, Vortex il campione e quindi si centrifuga per 20 minuti a 600 g.
- Decantare la frazione di metanolo in un tubo di vetro 16 x 125 mm 2 e posto in un rack in un bagnomaria regolato ad una temperatura di 37 ° C. Portare a secco con aria sotto cappa. Sciacquare la fiala di estrazione e posizionare il pellet fecale rimanente in un sacchetto di rifiuti clinici per lo smaltimento.
- Risospendere gli estratti fecali in 100%, 1 ml di metanolo e trasferire in una provetta di polipropilene da 12 x 75 mm 2. Immediatamente tappo e conservare a -20 ° C fino al momento dell'analisi.
3. Analisi Hormone
- Effettuare l'analisi con un collegato-immuno-enzimatico (EIA) utilizzando antisiero policlonale corticosterone CJM006.
NOTA:. Un secondo EIA è stato testato (cortisolo R4866 antisiero, ma questo non è riuscito a raggiungere la fase di validazione biochimica (vedere paragrafo 4.1) L'antisiero policlonale corticosterone CJM006 e cortisolo R4866 antisiero e la rispettiva HRP del sono forniti da CJ Munro, University of California, Davis, CA. - Diluire l'antisiero a 1: 15.000 in tampone di rivestimento (0,05 M NaHCO3, pH 9.6) con una pipetta ripetitiva e un puntale 50 microlitri, caricare una micropiastra a 96 pozzetti con 50 microlitri / bene. Coprire la piastra con un sigillante ed incubare O / N a 4 ° C. Lascia due pozzi non rivestiti per rappresentare i pozzi legame non specifico (NSB).
- Immediatamente prima dell'uso lavare i piatti microtitolazione cinque volte utilizzando un lavatore micropiastra automatizzato (soluzione di lavaggio; 0,15 M di NaCl, 0,05% di Tween 20).
- Caricare le piastre con 50 microlitri per bene per la NSB di e pozzi [tampone EIA (0,1 M NaPO 4, 0,149 M di NaCl, 0,1% di albumina sierica bovina, pH 7,0) soltanto] 'zero', standard (corticosterone, 3.9 - 1000 pg / bene) o campioni fecali estratto (opportunamente diluiti a 1:20 tampone EIA, vedere paragrafo 4.1). Norme e zeri devono essere eseguiti in triplice copia e quadruplice, rispettivamente. Diluito campioni estratto fecale e NSB di dovrebbero essere eseguiti in duplicato.
- Seguire questa immediatamente con l'aggiunta di 50 ml / pozzetto dell'etichetta perossidasi coniugato ᵻ diluito in tampone EIA a 1: 70.000.
- Incubare le piastre microtitolazione al buio per 2 ore a temperatura ambiente.
- Lavare le piastre microtitolazione con soluzione di lavaggio 5 volte e incubare le piastre a RT al buio con 100 l / well di RT substrato [0,4 mM 2,2'-Azino-di- (3-ethylbenzthiazoline solfonico) sale diammonico, 1.6 mM H 2 O 2, 0,05 M citrato, pH 4,0]. Preparare il substrato immediatamente prima dell'uso.
- Utilizzare un Spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 405 nm per leggere le piastre di microtitolazione. L'incubazione delle piastre è considerata completa quando la densità ottica dei pozzetti di zero raggiunge da 0,8 o 1,0.
- Per assicurare la ripetibilità, utilizzare i controlli [standard EIA o un campione biologico diluiti in tampone EIA di consolidare a circa il 30% (standard EIA), il 50% (un campione per esempio biologica, pool di cavallo domestico estratto fecale) e il 70% (standard EIA) ] a dimostrare un intra e inter-assay coefficienti di variazione di <10% e <15%, rispettivamente.
4. Enzyme Linked-immunologico: convalida per la specie di studio e sesso
- Biochimica Validation (parallelismo)
- Utilizzando tampone EIA, eseguire una diluizione seriale del pool fecale in piùct, idealmente preso da presunti campioni di alta e bassa concentrazione di ormoni da diversi individui (range: pulito, 1: 2 a 1: 8192) ed eseguire sulla VIA, come descritto nella sezione 3.
NOTA: Un parallelismo si considera raggiunto quando le diluizioni seriali di estratti fecali producono una curva spostamento parallelo ai risultati della curva e di regressione lineare standard di dimostrare R2> 0,90, una pendenza> 0,50 e p <0.05. L'estratto fecale diluito seriale che lega circa il 50% sulla curva standard dovrebbe essere considerata la diluizione ideale per eseguire tutti gli estratti fecali (ad esempio, 1:20). Non vi è alcuna interferenza considerato sul test quando i risultati di regressione lineare dimostrano R2> 0,90 e p <0.05.
- Utilizzando tampone EIA, eseguire una diluizione seriale del pool fecale in piùct, idealmente preso da presunti campioni di alta e bassa concentrazione di ormoni da diversi individui (range: pulito, 1: 2 a 1: 8192) ed eseguire sulla VIA, come descritto nella sezione 3.
- Biochimica Validation (Interference)
- Spike 200 ml di standard diluite in serie (zero, 3.9 a 1000 ng / pozzetto corticosterone) con 200 ml di estratto fecale opportunamente diluito in pool [diluito al 50% legame determinati da Parallelism (1:20)] ed eseguire sulla VIA, come al punto 3. A seguito di trama analisi EIA la concentrazione osservata meno il fondo (concentrazione del campione zero) rispetto alla concentrazione prevista.
NOTA: se l'aggiunta di estratto fecale pool diluito per gli standard non altera in modo significativo la quantità prevista e lineari risultati della regressione produce R 2> 0,90, un pendio vicino al 1.0 e p <0.05. Nessuna interferenza con l'EIA è stato raggiunto.
- Spike 200 ml di standard diluite in serie (zero, 3.9 a 1000 ng / pozzetto corticosterone) con 200 ml di estratto fecale opportunamente diluito in pool [diluito al 50% legame determinati da Parallelism (1:20)] ed eseguire sulla VIA, come al punto 3. A seguito di trama analisi EIA la concentrazione osservata meno il fondo (concentrazione del campione zero) rispetto alla concentrazione prevista.
- Validazione biologica:
NOTA: Una dimostrazione che la VIA scelta ha la capacità di misurare le variazioni biologicamente rilevanti di ormone di interesse [ad esempio, l'aumento delle concentrazioni di glucocorticoidi a seguito di un farmacologica (ACTH è spesso una procedura di licenza) o una sfida biologica (ad esempio, psicologica e / o ambientale; più probabile che sia un evento non regolamentata opportunistica)].- Selezionare, estrarre e analizzare i campioni di feci per le concentrazioni del metabolita glucocorticoidiutilizzando il processo descritto nelle sezioni 1 - 3 prima e dopo un evento impegnativo.
NOTA: Un evento impegnativo sarà determinate specie. Un metodo esempio è riportato qui sotto cavallo domestico. Esempi di eventi impegnativi per i cavalli sono stati pubblicati in precedenza compreso l'uso di gestione 9 e allevamento procedure 16. Un aumento significativo della concentrazione di metaboliti glucocorticoidi dopo l'evento impegnativo deve essere osservato e confermato con l'analisi statistica. Questo deve incorporare, se del caso, l'effetto delle misure ripetute, data campione e singoli. validazione biologica è quindi considerato raggiunto.
- Selezionare, estrarre e analizzare i campioni di feci per le concentrazioni del metabolita glucocorticoidiutilizzando il processo descritto nelle sezioni 1 - 3 prima e dopo un evento impegnativo.
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Representative Results
cavalli domestici (n = 16, 8 cavalle, 8 castroni), con un'età media di 15 anni (± 3) sono stati raggruppati in base al sesso e sottoposti a quattro disegni abitative con crescenti livelli di isolamento sociale (n = 4 cavallo / trattamento). Housing 1 coinvolti cavalli che vivono in un ambiente mandria, simulando attentamente il loro habitat naturale. Housing 2 coinvolti cavalli che vivono in coppie in una stalla coperta. Housing 3 cavalli coinvolti alloggiati solo nelle stalle, ma con il contatto visivo per altri cavalli e abitazioni 4 totale isolamento coinvolti dei cavalli.
L'esposizione a ciascun trattamento era in un disegno a blocchi randomizzati per un periodo di cinque giorni. A seguito di questo i cavalli erano risultate in paddock in erba nei loro gruppi sperimentali per due giorni prima dell'esposizione al successivo trattamento custodia. I campioni fecali sono stati prelevati una volta al giorno nei giorni 1, 2, e 3 spese all'interno di ogni trattamento della custodia n = 8 cavalli (n = 2 cavalli all'interno di ogni trattamento). I campioni fecali sono stati raccolti appena possibile ed entro 1 ora dopo la defecazione. Tutti i campioni sono stati raccolti dopo 1.200 ore il primo giorno intero di senso stallaggio che il primo campione il primo giorno è stato raccolto almeno 20 ore dopo che il cavallo è stato introdotto per il trattamento degli alloggi. I campioni di giorno uno, due e tre (totale di 24 campioni al design del corpo) sono stati valutati per i livelli di corticosterone fecali riflettenti del passato 18 ore a causa della velocità di passaggio del contenuto gastrointestinale 12. Gli stessi singoli cavalli sono stati usati per l'analisi fecale durante lo studio. Per tutti i dettagli di questa sfida biologica, compresi i parametri misurati supplementari si prega di fare riferimento alle pubblicati lavoro 9 esempi alternativi di eventi impegnativi per cavalli domestici si possono trovare anche nella letteratura 16.
Questa sezione fornisce esempi di risultati di una convalida biochimica (parallelismo) sia per corticosterone e cortisolo nelle feci cavallo domestico maschili e femminili. Questa sezione fornisce anche dati rappresentativi ottenuti dall'estrazione fecale e l'analisi EIA. I risultati sono stati ottenuti come parte di un più ampio studio che ha indagato l'impatto di isolamento sociale causato dal design del corpo, sul comportamento e la fisiologia equina 9.
I risultati della convalida biochimica ha rivelato che la VIA corticosterone era appropriato per misurare l'attività surrenalica vincolante [Figura campione maschile 1A% = 25,349 + 0,729 (vincolante% standard), R2 = 0,9545, F (1, 7) = 146,710, p meno di 0.001); Figura 1B campione femminile% vincolante = 29,989 + 0,7198 (vincolante% standard), R2 = 0,95,594 mila, F (1, 7) = 151,865, p inferiore a 0,001] ma non il cortisolo EIA [Figura 1C campione maschile% vincolante = 79,089 + 0,0629 (vincolante% standard), R2 = 0,175, F (1, 7) = 1.485, p = 0,262); campione femminile Figura 1D% Di legame = 81,652 + 0,0772 (vincolante% standard), R2 = 0,257, F (1, 7) = 2.422, p = 0,164]. Come la VIA corticosterone ha dimostrato il parallelismo a differenza della VIA cortisolo e di test di interferenza sul corticosterone VIA ha mostrato segni di interferenza della matrice, come aggiunta di estratto fecale diluito per gli standard di corticosterone non ha modificato l'importo previsto (maschio: Osservato = 1.302 + 1.017 (expected) , R2 = 0,9972, F1, 7 = 1287,128, p <0.001; femminile: Osservato = 0,3169 + 1,0931 (atteso), R2 = 0,9972, F1, 7 = 2432,65, p <0.001;).
I risultati della VIA è emerso che non vi era alcuna differenza significativa nei livelli di corticosterone tra cavalli maschi (M = 37.7, DS = 14,1) e cavalli di sesso femminile (M = 33,8, DS = 12,7; t (70) = 1.23, p = 0.22) . Il livello di corticosterone fecale aumentato il livello di isolamento aumentato. cavalli isolati (design del corpo 4) era significativamente elevatoer i livelli di corticosterone fecale rispetto a tutti gli altri disegni di alloggio (Wilks Lambda = 0.58, F (3, 18) = 4.29, p = 0,01, multivariata eta parziale quadrato = 0.42; p ≤0.02). Il livello di corticosterone fecale era superiore per tutti i cavalli su tutte tre giorni di esempio durante l'alloggiamento più isolato rispetto agli altri trattamenti abitative. Le concentrazioni di corticosterone fecale medio per ogni disegno dell'alloggiamento per ogni giorno sono presentati in Tabella 1.
Figura 1. biochimica Validation (parallelismo) di un Corticosterone e cortisolo Enzyme Linked-immunoenzimatico per maschi e femmine Cavalli. Questa cifra dettagli il legame di piscine seriali diluite di maschio e femmina cavallo domestico estratti fecali contro l'aumento delle concentrazioni curva standard di corticosterone e cortisolo su cento una VIA. I risultati dimostrano che lacorticosterone (A, maschile, B, femmina) e non il cortisolo VIA (C, maschile, D, femmina). ha prodotto un successo curva di spostamento parallelo con la curva di corticosterone standard EIA Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Medio (± SD) CORTICOSTERONE FECALE (ng / g) IN OGNI TRATTAMENTO CORPO | ||||
| HOUSING TRATTAMENTO | Giorno 1 | Giorno 2 | 3 ° giorno | COMPLESSIVAMENTE |
| 1 | 31.73 ± 10.2 | 32.18 ± 8.0 | 29.22 ± 5.9 | 31.05 ± 7.8 |
| 2 | 32.75 ± 10.0 | 33.66 ± 12.9 | 34.67 ± 9.3 | 33,69 ± 10.3 |
| 3 | 35.06 ± 14.6 | 35.14 ± 15.9 | 33.13 ± 12.5 | 34.44 ± 13.6 |
| </ Td> | * | |||
| 4 | 38.16 ± 17.8 | 42.00 ± 16.7 | 41.52 ± 17.6 | 40.56 ± 16,5 |
Tabella 1. Media (± DS) fecale Corticosterone (ng / g) per ogni trattamento alloggio per giorni uno, due e tre e medio fecale Corticosterone (ng / g) per tutti i tre giorni (totale) in ogni trattamento Housing. Questa tabella mostra i valori medi per corticosterone fecale (ng / g) ± deviazione standard per ciascun trattamento alloggiamento durante giorno uno, due e tre. I campioni sono stati raccolti almeno 20 ore dopo cavalli iscritti l'alloggiamento. Essa mostra anche corticosterone fecale media (ng / g) ± deviazione standard per tutti i tre giorni (fuori tutto) in ogni trattamento abitazioni. Il concentrat corticosterone fecaleion era significativamente più alta (*) durante la progettazione dell'alloggiamento isolato. La più bassa concentrazione di corticosterone fecale per tutti i giorni è stato trovato nel gruppo ospitato trattamento (trattamento 1). Adattato da Yarnell et al. (2015), con il permesso del Journal of Physiology e comportamento.
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Discussion
Analisi corticosterone fecale fornisce un mezzo per valutare i modelli a lungo termine di attività surrenalica nei cavalli. La natura non invasiva del metodo supera gli effetti confondenti di altri metodi di campionamento utilizzati per valutare l'attività del surrene tra cui saliva e nel plasma analisi 9. Inoltre la tecnica ha un vantaggio non invasivo chiaro se lo studio cavalli liberi che vanno.
Ci sono diversi punti chiave da discutere riguardo a questo metodo e il suo uso appropriato. Un passo fondamentale per il protocollo è la validazione del test per la specie in questione e la scelta degli anticorpi appropriata. Se l'anticorpo utilizzato cross-reagisce con metaboliti di glucocorticoidi strutturalmente simili, ma funzionalmente differenti questo potrebbe confondere i risultati 17. Pertanto, saggi per misurare metaboliti dell'ormone richiedono una validazione fisiologica o biologica attenta, esistono cui dettagli in letteratura 18,19 e nel descr protocolloibed.
Deve essere considerato incluso freschezza del campione e l'esposizione ambientale che hanno entrambi dimostrato di influenzare i livelli di metaboliti ormonali 20 La condizione del campione fecale. Pioggia eccessiva o l'esposizione del sole sono noti per causare aumenti o diminuzioni delle concentrazioni dei metaboliti a causa di metabolizzazione batterica 21. I ricercatori che desiderano raccogliere campioni di vari gradi di freschezza devono studiare gli effetti del tempo sulla integrità del campione, oltre all'impatto ambientale. Questo può essere fatto prima dello studio attraverso la creazione di un piccolo esperimento e periodicamente il campionamento di feci da individui di sesso maschile e femminile, con vari gradi di freschezza e l'esposizione a variabili climatiche.
Nella maggior parte degli scenari di ricerca, campioni provenienti da individui noti sarà utile o necessario 10. In cavalli domestici ciò può essere ottenuto controllando un gruppo per defecazione o utilizzando marcatori alimenti ingeriti per identify feci provenienti da individui in gruppi più grandi 12. Nelle specie che vanno liberi questo potrebbe rivelarsi molto tempo come sarà richiesto il monitoraggio individuale.
Nella scelta del metodo di analisi glucocorticoidi si deve considerare che i risultati del test corticosterone fecale rappresentano un campione riunito nel tempo piuttosto che un punto nel tempo misura; Pertanto, ci sarà meno fluttuazione nei dati. Se il ricercatore è interessato a effetti a lungo termine di una situazione, tecnica di allevamento o pratica di gestione, allora l'analisi fecale offre una tecnica appropriata. Se è necessaria una valutazione di modelli a breve termine nella concentrazione dell'ormone poi plasma o analisi salivare sarebbe il metodo preferito.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
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