Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

मानव परिधीय रक्त की Immunophenotypic विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करने के लिए एक अर्ध-स्वचालित दृष्टिकोण

Published: February 8, 2016 doi: 10.3791/53485
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 3, 1,4
1Human Immune Monitoring Laboratory, Earle A. Chiles Research Institute, Providence Cancer Center, Providence Portland Medical Center, 2Sony Biotechnology, 3Beckman Coulter, Inc. Life Sciences, 4Bristol-Myers Squibb

Abstract

प्रवाह से परिधीय रक्त की Immunophenotyping cytometry रोग और उपचार के दौरान परिधीय ल्यूकोसाइट्स की आवृत्ति और सक्रियण स्थिति में परिवर्तन निर्धारित करता है। यह संभावित चिकित्सीय प्रभावकारिता की भविष्यवाणी और उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए है। पूरे रक्त धुंधला unmanipulated खून है, जो कि कलाकृतियों नमूना तैयार करने के दौरान हो सकता है कम से कम इस्तेमाल करता है। हालांकि, पूरे रक्त धुंधला भी हौसले से एकत्र रक्त पर किया जाना चाहिए नमूना की अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए। इसके अतिरिक्त, यह एक ही दिन में एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करने के लिए मिलकर-रंगों के संभावित अस्थिरता से बचने और शानदार बैंगनी रंगों के बीच अभिकर्मक बातचीत को रोकने के लिए सबसे अच्छा है। इसलिए, पूरे रक्त धुंधला अंतर और अंतर-प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित करने के लिए सावधान मानकीकरण की आवश्यकता है।

यहाँ, हम antibod बनाने का एक मानक प्रक्रिया में एक दो आयामी (2 डी) बारकोड रीडर के साथ सुसज्जित एक स्वचालित तरल हैंडलर की तैनाती की रिपोर्टसे फ्लो के लिए y कॉकटेल। 2 डी बारकोड वाले एंटीबॉडी एक साथ 96 प्रारूप और उनकी सामग्री एक डेटाबेस में संकलित में व्यवस्था की ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया गया। तरल हैंडलर तो डेटाबेस के भीतर एंटीबॉडी के नाम संदर्भित द्वारा स्रोत एंटीबॉडी शीशियों का पता लगाने सकता है। हमारे विधि स्रोत एंटीबॉडी ट्यूब की स्थिति के लिए थकाऊ समन्वय सफाया कर दिया। यह उपयोगकर्ता आसानी से प्रत्येक परख के लिए सॉफ्टवेयर विधि में पटकथा को फिर से लिखना के बिना डेटाबेस को संशोधित करके इस तरह के उपयोग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी, मात्रा, और गंतव्य के रूप में एंटीबॉडी वितरण प्रक्रिया में विवरण के किसी भी संख्या को बदलने की अनुमति बहुमुखी प्रतिभा प्रदान की है।

अवधारणा प्रयोग का एक सबूत बकाया अंतर और अंतर परख सटीक, परख cytometry एक 11-रंग, 17-एंटीबॉडी के प्रवाह को दोहराने की तैयारी द्वारा प्रदर्शन हासिल की। इन तरीकों assays के प्रवाह cytometry के लिए समग्र throughput वृद्धि हुई है और विस्तृत pheno के लिए आवश्यक जटिल एंटीबॉडी कॉकटेल की तैयारी में मदद की दैनिकहौसले से एकत्र anticoagulated परिधीय रक्त की िटिपक विशेषता।

Introduction

मानव परिधीय रक्त की Immunophenotyping प्रतिरक्षा सेल सबसेट 1 में मात्रात्मक और गुणात्मक परिवर्तन निर्धारित करता है। यह कार्रवाई और प्रतिरोध, भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की खोज एड्स के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, और संयोजन immunotherapies के विकास की सुविधा। इसलिए, सत्यापन और immunophenotyping के मानकीकरण अकादमिक शोधकर्ताओं, नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं और उद्योगों को काफी रुचि का एक क्षेत्र है।

प्रवाह cytometric विधियों द्वारा परिधीय रक्त की immunophenotyping वर्तमान में hematological दुर्दमताओं 2,3 और मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) संक्रमण 4,5, प्रतिरक्षा मांगों के लिए परिधीय रक्त के विश्वसनीय immunophenotyping सत्यापन और मानकीकरण, क्योंकि उस में विशिष्ट विचार के नैदानिक ​​प्रबंधन के लिए प्रयोग किया जाता है यद्यपि प्रतिरक्षा सेल सबसेट और सक्रियण / निरोधात्मक रिसेप्टर्स 1,6-8 पर अधिक व्यापक कवरेज की आवश्यकता है। successful immunophenotyping साधन सेटअप और सेल धुंधला प्रक्रिया 9,10 से संबंधित प्रयोग करने वाली प्रयोग परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए सावधान मानकीकरण की आवश्यकता है। जबकि प्रवाह cytometry के लिए साधन सेटिंग्स के मानकीकरण में अच्छी तरह से पूर्व चिंता 9,11,12 संबोधित करने के लिए स्थापित किया गया है, यह स्पष्ट नहीं हुआ है कि कैसे प्रतिरक्षा सेल सबसेट और उनके सक्रियण स्थिति के कवरेज सीमित बिना सेल धुंधला से संबंधित परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए।

एंटीजन की संख्या बढ़ जाती है पता लगाया जा करने के रूप में, तो भी त्रुटि और परिवर्तनशीलता सबऑप्टिमल अभिकर्मक वितरण और पार संदूषण के कारण के लिए अवसर है। anticoagulated पूरे रक्त की phenoptypic विश्लेषण के लिए तरीके देर नैदानिक ​​प्रयोगशाला assays में उपयोग के लिए 1980 में स्थापित किए गए थे। ये एक ही तरीके का नमूना तैयार करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशाला की आवश्यकताओं की सेवा। महत्वपूर्ण बात है, एंटीबॉडी नैदानिक ​​प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता कॉकटेल आम तौर पर कम जटिल और एवा हैंilable पूर्व titered और निर्माता से पूर्व मिश्रित। केवल पूर्व मिश्रित एंटीबॉडी कॉकटेल का एक भी हस्तांतरण की आवश्यकता है। अनुसंधान सेटिंग में, 10-16 एंटीबॉडी के एंटीबॉडी कॉकटेल विशिष्ट हैं। प्रत्येक कॉकटेल प्रयोगशाला द्वारा स्थिरता के लिए मान्य है या प्रत्येक परख से पहले नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए। एक नमूना के लिए कई एंटीबॉडी कॉकटेल तैयारी 50-80 व्यक्ति एंटीबॉडी के pipetting, कि दोनों थकाऊ और त्रुटि प्रवण है एक काम करना पड़ेगा सकता है।

कॉकटेल तैयार करने के स्वचालन इस तरह के कम त्रुटियों के रूप में मैनुअल कॉकटेल तैयारी पर कई फायदे हैं, pipetting की सटीकता की वृद्धि हुई है, और संभवतः भी अभिकर्मक बर्बादी में कमी आई है। यहाँ, हम तैयारी नमूना से संबंधित परिवर्तनशीलता को कम करने के immunophenotyping की सेल-धुंधला प्रक्रिया में एक दो आयामी (2 डी) बारकोड रीडर के साथ सुसज्जित एक स्वचालित तरल हैंडलर की सफल शुरूआत की रिपोर्ट।

Protocol

संग्रह और इस प्रोटोकॉल में परिधीय रक्त के उपयोग के प्रोविडेंस स्वास्थ्य और सेवाएँ संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी मानव विषयों उनके लिखित सूचित सहमति प्रदान की है।

नोट: सार्वभौम सावधानियों का पालन करें। सभी मानव रक्त के रूप में यदि संक्रामक और जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रथाओं के अनुसार संभाला व्यवहार किया जाना चाहिए।

नोट: परिधीय पूरे रक्त के साथ immunophenotyping फ्लोरोसेंट टैग मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ पूरे रक्त anticoagulated incubating लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए कोशिका की सतह एंटीजन, hypotonic सेल द्वारा पीछा पता लगाने के लिए किया जाता है। प्रकोष्ठों धो रहे हैं और नमूना एक प्रवाह कोशिकामापी द्वारा विश्लेषण किया है। विधि वर्णित एक 2 डी बारकोड रीडर के साथ सुसज्जित स्वचालित तरल हैंडलर का उपयोग कर एंटीबॉडी कॉकटेल की तैयारी पर केंद्रित है। सबसे पहले, "बेस कॉकटेल" है कि प्रतिरक्षा सेल सबसेट को दिखाता है और "एक्टिवेशन कॉकटेल" है कि मैं पर नजर रखता हैnducible एंटीजन अलग से तैयार कर रहे हैं (तालिका 1)। तो फिर दोनों एक कॉकटेल "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" बनाने के लिए मिलाया जाता है। कार्यप्रवाह के लिए चित्रा 1 देखें।

1. नमूना

  1. एक सोडियम हेपरिन anticoagulated रक्त संग्रह ट्यूब में venipuncture के माध्यम से परिधीय रक्त ले लीजिए, धीरे कई बार उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए पलटना, और फिर आरटी पर पकड़। नमूना अस्वीकार करता है, तो पका या 13 hemolyzed।

2. Labware तैयारी

  1. लेबल 2 डी मानव पठनीय लेबल के साथ बारकोड ट्यूब (एंटीबॉडी का नाम, विक्रेता, सूची संख्या, और बहुत संख्या)।
  2. इसी 2 डी बारकोड ट्यूबों के लिए विक्रेता (1 टेबल में सूचीबद्ध) से एंटीबॉडी शीशियों की संपूर्ण सामग्री के हस्तांतरण।
    नोट: करने के लिए अत्यधिक सावधानी रखना बुलबुले परिचय नहीं के रूप में झूठा बुलबुले तरल स्तर संवेदन (LLS) कि अभिकर्मक के सबऑप्टिमल हस्तांतरण में यह परिणाम ट्रिगर।
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्रत्येक एंटीबॉडी VIअल चलाने के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी है।
  3. पढ़ें 2 डी बारकोड रीडर द्वारा प्रत्येक ट्यूब के लिए 2 डी बारकोड।
  4. एक स्प्रेडशीट (बीसी) एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एंटीबॉडी नेम (एबी) और बारकोड पढ़ता होता है कि बनाने के लिए और के रूप में "AB_BC.csv" (तालिका 2) अलग मान (CSV) फ़ाइल में एक अल्पविराम इसे बचाने के लिए।
    नोट: बारकोड संख्या यदि कोई हो (जैसे, +०१६३५६२५४४) के लिए पहली बार "0" के रूप में रखने के लिए "पाठ" नहीं "संख्या" कोशिकाओं प्रारूप करने के लिए सुनिश्चित करें। डेटा के अंत निर्दिष्ट करने के लिए अंत में "एक्स, 0000000000" जोड़ें।
  5. स्वचालित तरल हाथ के इस बल्लेबाज में डेक के फ्रेम करने के लिए पेंच LLS धातु प्लेट LLS सकें।

3. स्वचालित तरल हैंडलर के लिए Programing

नोट: मास्टर Antibo बनाने के लिए "एक)" बेस कॉकटेल "और" एक्टिवेशन कॉकटेल "में 3.1) बनाने के लिए एक विधि है, और ख) एक विधि: दो तरीकों से स्वचालित तरल हैंडलर के लिए सॉफ्टवेयर में क्रमादेशित किया जाएगावि कॉकटेल बेस कॉकटेल "और" एक्टिवेशन कॉकटेल "में 3.2) (चित्रा 1)" के संयोजन से "।

  1. "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" (चित्रा 2) बनाने के लिए एक विधि बनाएँ।
    1. स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एक स्प्रेडशीट P50 टिप्स (BASE_CT_P50 साथ "बेस कॉकटेल" के लिए μl में एंटीबॉडी नेम (AB_NAME), गंतव्य स्थान ट्यूब (अच्छी तरह से आधार या अच्छी तरह से अधिनियम), और मात्रा (वॉल्यूम) के लिए जानकारी है कि बनाने: टेबल 3) या P200 टिप्स (BASE_CT_P200: टेबल 4) और P50 टिप्स (ACT_CT_P50 के साथ "एक्टिवेशन कॉकटेल ': टेबल 5) या P200 टिप्स (ACT_CT_P200: टेबल 6)। उन्हें CSV फाइल के रूप में सहेजें। "अच्छी तरह से आधार" और "अच्छी तरह से अधिनियम" स्थान के लिए, चित्रा 3 में संख्या को देखें।
      नोट: खंड = अनुमापांक एक्स μl (धुंधला + 2 #)। तालिका 1 में titers बहुत विशिष्ट हैं। ऑपरेटर एक चूची का निर्धारण करना चाहिएप्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एर दूसरों 14 से वर्णित है।
    2. "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" बनाने के लिए एक विधि बनाने के लिए कंप्यूटर पर स्वचालित तरल हैंडलर के लिए सॉफ्टवेयर लांच करने के लिए एक आइकन पर क्लिक करें।
      नोट: निम्नलिखित कदम 3.1.3-3.1.7 Labware परिभाषित करेगा: 2 डी बारकोड ट्यूब (चित्रा 4) के साथ ट्यूब रैक। माप एक संदर्भ के रूप में प्रदान की जाती हैं। जांचकर्ताओं को निर्धारित करने और प्रत्येक साधन के लिए समायोजित करना चाहिए।
    3. "प्रोजेक्ट" के तहत उपकरण पट्टी में, "Labware प्रकार संपादक" का चयन करें। एक साथ 96 फ्लैट प्लेट के लिए एक वस्तु पर राइट-क्लिक करें, "कॉपी" और एक पॉप-अप विंडो में "Matrix_OneML_TubeRack" टाइप करें।
    4. संवाद बॉक्स खोलने के लिए वस्तु "Matrix_OneML_TubeRack" पर डबल क्लिक करें। हाइलाइट "मूलभूत जानकारी", १२.७७५ सेमी (एक्स) और "काल" के लिए ८.५४६ सेमी (वाई) और "ऊँचाई" के लिए ४.६२५ सेमी निर्धारित किया है। (चित्रा 4 क)।
    5. अगले, उजागर "movemईएनटी जानकारी "। ग्रिपर सेट ऑफसेट 0 (एक्स), 0 (वाई), और 0.3 (जेड), ग्रिपर -0.1cm निचोड़, ग्रिपर Unsqueeze 2.6 सेमी, गति सीमा 75%, और फिर जाँच" ग्रिपर सेंसर का प्रयोग करें "(चित्रा 4 बी)।
    6. फिर, "Well_1" पर प्रकाश डाला। इस प्रकार के रूप में सेट: "ठीक है ऑफसेट"; 1.5 सेमी (एक्स) और 1.13 सेमी (वाई), "ठीक गणना"; 12 (एक्स) और 8 (वाई), "ठीक है रिक्ति"; 0.9 (एक्स) और 0.9 (वाई), "अधिकतम मात्रा"; 1,500 μl, स्वरूप ", नियमित रूप से," Colum 2 ऑफसेट ", 0, और" डिफ़ॉल्ट वॉल्यूम "; 0 (चित्रा 4C)।
    7. अंत में, एक प्रेस "संपादित करें ..." "ठीक विन्यास" (चित्रा 4C) की सही करने के लिए बटन। एक पॉप-अप विंडो में, के रूप में स्थापित: "आकार"; गोल, "ऊपरी त्रिज्या"; 0.37 सेमी, "कम त्रिज्या"; 0.37 सेमी, और "ऊँचाई"; 3.9 सेमी। "नीचे अनुभाग" और सेट "आकार" की जाँच करें; कोन, "त्रिज्या"; 0.37 सेमी, और "ऊँचाई"; 0.4 सेमी (चित्रा 4D)।
      नोट: microfuge ट्यूब के साथ ट्यूब रैक: निम्नलिखित कदम 3.1.8-3.1.11 Labware को परिभाषित करेगा। माप एक संदर्भ के रूप में प्रदान की जाती हैं। जांचकर्ताओं को निर्धारित करने और प्रत्येक साधन के लिए समायोजित करना चाहिए।
    8. "प्रोजेक्ट" के तहत उपकरण पट्टी में, "Labware प्रकार संपादक" का चयन करें। एक 24 स्थिति रैक के लिए एक वस्तु पर राइट-क्लिक करें, "कॉपी" और प्रकार "SmallTuberack_microfugetubes"।
    9. संवाद बॉक्स खोलने के लिए वस्तु "SmallTuberack_microfugetubes" पर डबल क्लिक करें। हाइलाइट "मूलभूत जानकारी", 12.75 सेमी (एक्स) और "काल" के लिए 8.5 सेमी (वाई) और "ऊँचाई" के लिए 3.95 सेमी निर्धारित किया है।
    10. अगला, "Well_1" पर प्रकाश डाला। इस प्रकार के रूप में सेट: "ठीक है ऑफसेट"; १.६२१ सेमी (एक्स) और 1.181 सेमी (वाई), "ठीक गणना"; 6 (एक्स) और 4 (वाई), "ठीक है रिक्ति"; 1.9 (एक्स) और 1.9 (वाई), "अधिकतम मात्रा"; 1,000 μl, स्वरूप ", नियमित रूप से," Colum 2 ऑफसेट ", 0, और" डिफ़ॉल्ट वॉल्यूम "; 0।
    11. अंत में, प्रेसएक "संपादित करें ..." "ठीक विन्यास" का सही करने के लिए बटन। एक पॉप-अप विंडो में, के रूप में स्थापित: "आकार"; गोल, "ऊपरी त्रिज्या"; .3345 सेमी, "कम त्रिज्या"; 0.274 सेमी, और "ऊँचाई"; ३.६,७२८ सेमी। "नीचे अनुभाग" और सेट "आकार" की जाँच करें; गोलार्ध, और "त्रिज्या"; .1575 सेमी।
      नोट: निम्न चरणों के 3.1.12-3.1.35 "नई विधि" कार्यक्रम के लिए कैसे "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" (चित्रा 2) बनाने के लिए समझाना होगा।
    12. "नई विधि" आइकन और खोलें क्लिक करें।
    13. एक "प्रारंभ" और "समाप्त" नई विधि में (चित्रा 2) आइकन के बीच एक "अगर" आइकन खींचें। क्लिक करें और "यदि" आइकन पर प्रकाश डाला। टाइप स्थिति के लिए निम्नलिखित:। CreateObject ( "World.EngineObject") का अनुकरण
      नोट: यह त्रुटि जाँच प्रदर्शन से सॉफ्टवेयर रोकने के लिए और काम करने के लिए इस विधि के लिए सक्षम हो जाएगा। इस कदम के बिना, एसoftware डाटासेट के लिए लापता जानकारी सचेत करेंगे बारकोड के रूप में पढ़ता कदम "VisionMate: बारकोड को पढ़ने" के बाद ही उपलब्ध हैं 3.1.20 में वर्णित)। चूंकि यह कदम सॉफ्टवेयर में सत्यापन कदम को निष्क्रिय करता है, ऑपरेटर वहाँ पर्याप्त सुझावों और डेक पर अभिकर्मक इस विधि प्रदर्शन कर रहे हैं की पुष्टि करनी होगी।
    14. "यदि" आइकन (चित्रा 2) के तहत "फिर" आइकन और पहली "एंड" आइकन के बीच एक "साधन सेटअप" आइकन डालें।
      नोट: निम्न सभी चरणों के लिए, "वरना" आइकन और दूसरा "अंत" "यदि" आइकन के तहत आइकन के बीच खींचें माउस इतना है कि चरण "वरना" में समझाया जाता है।
    15. (चित्रा 2) विधि में "वरना" आइकन के नीचे "साधन सेटअप" आइकन खींचें।
    16. विंडो खोलने के लिए विधि में "साधन सेटअप" आइकन पर क्लिक करें। P50 LLS फ़िल्टर खरीदारों के लिए माउस को खींचकर labwares विन्यस्त करें, P200 LLS फ़िल्टर टिप्स, P1000 टिप्स, "Matrix_OneML_TubeRack" दो "SmallTuberack_microfugetubes", और आइकन सूची से संबंधित डेक स्थान पर जलाशय।
    17. "Matrix_OneML_TubeRack" और "के रूप में AB_BOX" नाम के लिए संवाद बॉक्स खोलें। "SmallTuberack_microfugetubes" के लिए संवाद बॉक्स खोलने के लिए और बेस कॉकटेल के लिए "BASE_CT" और एक्टिवेशन कॉकटेल के लिए "ACT_CT" के रूप में अन्य (चित्रा 5) के रूप में एक नाम है।
    18. "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" के लिए microfuge ट्यूबों में जलाशय से बफर स्थानांतरित करने के लिए एक कदम जोड़ने की विधि (चित्रा 2) के लिए एक "स्थानांतरण" आइकन खींचें। स्थानांतरण मात्रा = 25 μl एक्स "बेस कॉकटेल" और = 25 μl एक्स के लिए (+2 धुंधला की #) (# 2 धुंधला की) "एक्टिवेशन कॉकटेल" के लिए।
    19. 2 डी बारकोड रीडर पर "Matrix_OneML_TubeRack" बढ़ने के लिए कदम जोड़ें। (विधि के लिए एक "VisionMate हटो" आइकन खींचें फाईआंकड़ा 2) और डेक पर बारकोड रीडर की स्थिति के लिए प्रारंभिक मंजिल से कदम निर्दिष्ट करें।
    20. खींचें एक "VisionMate: बारकोड को पढ़ने" विधि (चित्रा 2) के लिए आइकन। संवाद बॉक्स खोलें, और डिवाइस के रूप में "VisionMate" चुनते हैं और डेटा के रूप में "BC_Read" सेट के नाम पर।
    21. एक "उपयोगकर्ता रोकें" (चित्रा 2) खींचें चुनें "पूरे सिस्टम को रोकें और इस संदेश को प्रदर्शित" और क्षेत्र में एक टिप्पणी टाइप पुष्टि है कि सभी बारकोड अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले पढ़ी जाती हैं उन याद दिलाने के लिए।
      नोट: निम्न चरणों के 3.1.22-3.1.26 अच्छी तरह से स्थानों और एंटीबॉडी के नाम बारकोड जानकारी का उपयोग कर के बीच कड़ी होगी। यह स्वचालित तरल हैंडलर विशेष एंटीबॉडी का नाम "अटल बिहारी" पर आधारित एंटीबॉडी के एक स्थान खोजने के लिए सक्षम हो जाएगा।
    22. विधि (चित्रा 2) के लिए एक "रिपोर्टिंग चरण" आइकन खींचें।
    23. एक पाठ कार्यक्रम का उपयोग कर एक पाठ फ़ाइल बनाने और इसे बचाने के लिए"BC_Readout" कंप्यूटर पर दस्तावेज़ फ़ोल्डर में के रूप में।
    24. "चरण रिपोर्टिंग" के लिए संवाद बॉक्स खोलें, रिपोर्ट शैली के लिए "पाठ फाइल" चुनते हैं, और ब्राउज़िंग के माध्यम से "BC_Readout" फ़ाइल का चयन करें।
      नोट: बारकोड के लिए 2 डी बारकोड जानकारी ट्यूब और "Matrix_OneML_TubeRack" में अच्छी तरह से स्थानों के लिए पढ़ता सहित 3.1.16 में विन्यस्त के रूप में जिसके परिणामस्वरूप "BC_Readout" फ़ाइल सुझावों के सिवाय डेक पर सभी labwares के लिए जानकारी होगी।
    25. बारकोड और अच्छी तरह से जानकारी जोड़ने के लिए एक "डेटा सेट बनाएं" कदम जोड़ें। (चित्रा 2) विधि को "बनाएँ डेटा सेट" आइकन खींचें (2 टेबल 2.4 में बनाया गया), संवाद बॉक्स खोलने के लिए क्लिक करें यह चुन "एक फ़ाइल से पढ़ें" और "AB_BC.csv", "जाँच कॉमा- सीमांकित "और" फाइल एक शीर्ष लेख पंक्ति "है।
      नोट: फ़ाइल पूर्वावलोकन विंडो में, एंटीबॉडी के नाम (एबी) और बारकोड पढ़ता (BC) में देखा जाना चाहिए।
    26. एस में3.1.25 में "बनाएँ डेटा सेट" AME संवाद बॉक्स में, "VM1" Labware स्थान के लिए "0" ढेर गहराई के लिए, चयन और चुनें "नमूना आईडी से मेल", और क्षेत्र "ई.पू." उपयोग डेटा के साथ मैच करने के लिए "BC_Read" सेट। "अटल बिहारी" और "ई.पू." "डेटा सेट में पैदा किए जाने के लिए" (चित्रा 6) का चयन करें।
    27. विधि (चित्रा 2) के लिए एक "VisionMate हटो" आइकन खींचें और वापस छत पर प्रारंभिक डेक की स्थिति के लिए बारकोड रीडर स्थिति "VM1" से कदम निर्दिष्ट करें।
      नोट: निम्न चरणों के 3.1.28-3.1.33 "बेस कॉकटेल" के लिए हस्तांतरण कदम को परिभाषित करेगा।
    28. एक "Worklist" आइकन (चित्रा 2) खींचें और worklist फ़ाइल "Base_CT_P50" (3 टेबल) 3.1.1 में बनाई गई चयन करने के लिए ब्राउज़ करें। "पाश पूरे worklist" की जाँच करें।
    29. (चित्रा 2) "Worklist" आइकन के नीचे सीधे "स्थानांतरण" आइकन खींचें। </ Li>
    30. विनिर्देश क्षेत्र को खोलने के लिए "स्थानांतरण" आइकन पर क्लिक करें। जांच के सिर्फ एक है, P50 LLS फ़िल्टर सुझावों का चयन करें, "उन्हें उतारना" जब हस्तांतरण किया जाता है, और जाँच "स्थानान्तरण के बीच सुझावों के बदले"। क्लिक करके स्रोत जोड़ें labware, और डेक पर स्थान का चयन नाम "AB_BOX" के रूप में, चुनें "Matrix_OneML_TubeRack" "एक सूत्र जोड़ने के लिए यहाँ क्लिक करें"।
    31. "स्थानांतरण" के लिए विशिष्टता क्षेत्र में, "ज़ूम में" राइट क्लिक करके 96 कुओं के चित्र पर और "अटल बिहारी" के तुरंत बाद "का प्रयोग करें डेटा सेट" चुनें और चुनें जहां उसके मूल्यों और "= AB_NAME" "के बराबर हैं" । चुनाव के हस्तांतरण तकनीक का चयन करें।
      नोट: LLS का उपयोग अत्यधिक नीचे के पास मलबा उपजी हो रहा से बचने के लिए सिफारिश की है।
    32. "स्थानांतरण", क्लिक करके चुनिंदा गंतव्य के लिए विशिष्टता क्षेत्र में "एक गंतव्य जोड़ने के लिए यहाँ क्लिक करें", सही में ज़ूम करने के लिए क्लिक करें और "SmallTuberack_microfugetubes "एक Labware के रूप में, के रूप में मात्रा" = वॉल्यूम ", और स्थान के नाम से डेक पर" BASE_CT "। बाहर zooming के बाद, फिर से राइट क्लिक करें की जांच," पाठ के रूप में चयन निर्दिष्ट करें ", और" अभिव्यक्ति के साथ लक्ष्यों को निर्दिष्ट करें नीचे: "और प्रकार" = एक गंतव्य डेक स्थिति के लिए एक चर के रूप में WELL_BASE "।
    33. 3.1.29-3.1.32 दोहराएँ इसी तरह P200 सुझावों के साथ "बेस कॉकटेल" के लिए, सीएसवी फ़ाइल "Base_CT_P200" (तालिका 4) का चयन तो P200 P200 LLS LLS छान छान खरीदारों के लिए सुझावों के साथ ही उचित पिपेट तकनीक का चयन करके।
      नोट: निम्नलिखित कदम 3.1.34 और 3.1.35 "एक्टिवेशन कॉकटेल" के लिए हस्तांतरण कदम को परिभाषित करेगा।
    34. 3.1.29-3.1.32 दोहराएँ इसी तरह P50 सुझावों के साथ "एक्टिवेशन कॉकटेल" के लिए, एक गंतव्य के रूप में सीएसवी फ़ाइल "ACT_CT_P50" (5 तालिका) का चयन और "ACT_CT" का चयन करके। सही गंतव्य पर क्लिक करें और जाँच "पाठ के रूप में चयन निर्दिष्ट करें";। एक गंतव्य स्थान के लिए एक चर के रूप और प्रकार "= WELL_ACT": जाँच करें "नीचे अभिव्यक्ति के साथ लक्ष्यों को निर्दिष्ट करें"।
    35. 3.1.34 दोहराएँ इसी तरह P200 सुझावों के साथ "एक्टिवेशन कॉकटेल" के लिए, सीएसवी फ़ाइल "ACT_CT_P200" (तालिका 6) और P200 LLS फ़िल्टर सुझावों का चयन करके।
      नोट: "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" बनाने के लिए विधि को बचाने के बाद बंद कर दिया जा सकता है।
  2. "बेस कॉकटेल" और 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब (चित्रा 7) में "एक्टिवेशन कॉकटेल" के संयोजन से "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" बनाने के लिए एक नई विधि बनाएँ।
    ध्यान दें: 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब के साथ ट्यूब रैक: निम्नलिखित कदम 3.2.1-3.2.6 Labware को परिभाषित करेगा। नंबर संदर्भ के लिए प्रदान की जाती हैं। जांचकर्ताओं का निर्धारण और साधन के लिए समायोजित करना चाहिए।
    1. "प्रोजेक्ट" के तहत उपकरण पट्टी में, "Labware प्रकार संपादक" का चयन करें। राइट-सीएल24-स्थिति रैक के लिए एक वस्तु पर ICK, "कॉपी" का चयन करें और एक पॉप-अप विंडो में "BiocisionCoolRack_XT" टाइप करें।
    2. संवाद बॉक्स खोलने के लिए वस्तु "BiocisionCoolRack_XT" पर डबल क्लिक करें।
    3. हाइलाइट "मूलभूत जानकारी", 12.78 सेमी (एक्स) और "काल" के लिए 8.57 सेमी (वाई) और "ऊँचाई" के लिए 7.93 सेमी निर्धारित किया है।
    4. "Well_1" पर प्रकाश डाला। इस प्रकार के रूप में सेट: "ठीक है ऑफसेट"; 1.55 सेमी (एक्स) और 1.33 सेमी (वाई), "ठीक गणना"; 6 (एक्स) और 4 (वाई), "ठीक है रिक्ति"; 1.95 (एक्स) और 1.97 (वाई), "अधिकतम मात्रा"; 2,000 μl, स्वरूप ", नियमित रूप से," Colum 2 ऑफसेट ", 0, और" डिफ़ॉल्ट वॉल्यूम "; 0।
    5. खोलें "ठीक विन्यास" संपादित करने के लिए। "आकार";: के रूप में स्थापित गोल, "ऊपरी त्रिज्या"; .5375 सेमी, "कम त्रिज्या"; 0.48 सेमी, और "ऊँचाई"; 7.07 सेमी। "नीचे अनुभाग" और सेट "आकार" की जाँच करें; गोलार्ध, और "त्रिज्या"; 0.45 सेमी।
      नोट: निम्न चरणों में3.2.6-3.2.7 हस्तांतरण कदम को परिभाषित करेगा और कदम 3.2.14 में इस्तेमाल किया जाएगा।
    6. निम्नलिखित हेडर के साथ एंटीबॉडी कॉकटेल बनाने के लिए एक सीएसवी फ़ाइल "AB_MACT" (तालिका 7) बनाएं: एक) "SRC_BASE"; "बेस कॉकटेल ', ख)" WELL_BASE "के लिए एक Labware नाम; अच्छी तरह से "बेस कॉकटेल", ग) "VOL_BASE" के लिए Labware में स्थानों; "बेस कॉकटेल" μl में, घ) "SRC_ACT" के लिए हस्तांतरण मात्रा; "एक्टिवेशन कॉकटेल", ई) "WELL_ACT" के लिए एक Labware नाम; अच्छी तरह से "एक्टिवेशन कॉकटेल", च) "VOL_ACT" के लिए Labware में स्थानों; "एक्टिवेशन कॉकटेल" μl में, छ) "DEST_MACT" के लिए हस्तांतरण मात्रा; "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल", और ज) "WELL_MACT" के लिए डेक स्थिति की जानकारी; अच्छी तरह से "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" के लिए ट्यूब रैक में जानकारी स्थिति।
    7. क) "BASE_CT" का उपयोग करें: इस प्रकार के रूप में बनाई गई 3.2.6 हेडर) (तालिका 7) के तहत जानकारी भरेंSRC_BASE के तहत, ख) सूची में अच्छी तरह से स्थान चित्रा 3 ए में दिखाया गया है "WELL_BASE" के लिए जानकारी, ग) एंटीबॉडी की सूची कुल मात्रा (बफर + "VOL_BASE" के तहत एक धुंधला के लिए सभी आधार एंटीबॉडी titers) की राशि के 25 μl, डी) का उपयोग करें "WELL_BASE" के रूप में चित्रा 3 बी, एफ) सूची एंटीबॉडी की कुल मात्रा (बफर + "VOL_ACT" के तहत एक धुंधला के लिए सभी सक्रियण एंटीबॉडी titers) की राशि के 25 μl में दिखाया गया के लिए "ACT_CT" SRC_ACT, ई) सूची में अच्छी तरह से स्थान की जानकारी के अंतर्गत। स्थानांतरण टी-सेल FM3 के लिए बफर के 25 μl। के रूप में चित्रा 8 में दिखाया टेस्ट 1-3, छ) "WELL_MACT" के लिए "SPL_TUBES_1" (3.2.10 देखें) "DEST_MACT" के लिए, और एच) सूची में अच्छी तरह से स्थान जानकारी का उपयोग के लिए 1 तालिका को देखें।
      नोट: निम्न चरणों के 3.2.8-3.2.15 "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" बनाने के लिए विधि कार्यक्रम होगा
    8. एक नई विधि (चित्रा 7) खोलें।
    9. खींचें "Instrument सेटअप "(चित्रा 7) नई विधि के लिए चिह्न।
    10. "साधन सेटअप" P1000 खरीदारों के लिए, खींचें माउस, दो "SmallTuberack_microfugetubes", और "BiocisionCoolRack_XT" डेक पर आरेख के विनिर्देश क्षेत्र में। "BASE_CT" और "ACT_CT", क्रमशः के रूप में दो "SmallTuberack_microfugetubes" और नाम के लिए संवाद बॉक्स खोलें, 3.1.17 के रूप में निर्दिष्ट। "BiocisionCoolRack_XT" के लिए संवाद बॉक्स और "SPL_TUBES_1" 3.2.7 (9 चित्रा) के रूप में निर्दिष्ट के रूप में नाम खोलें।
    11. विधि (चित्रा 7) के लिए एक "समूह" आइकन खींचकर एक नया "समूह" जोड़ें।
    12. सीधे "समूह" आइकन के नीचे "स्थानांतरण फ़ाइल से" आइकन खींचें "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" (चित्रा 7) बनाने के लिए "बेस कॉकटेल" हस्तांतरण करने के लिए।
    13. "फ़ाइल से स्थानांतरण" के लिए विशिष्टता क्षेत्र में, उपयोग में P1000 सुझावों का चयन करें, एसचुनाव "उन्हें उतारना" जब हस्तांतरण किया जाता है, और जाँच "स्थानान्तरण के बीच सुझावों के बदले"।
    14. "फ़ाइल से स्थानांतरण" के लिए विशिष्टता क्षेत्र में, फ़ाइल "AB_MACT" (तालिका 7) ब्राउज़िंग द्वारा चयन करें, जाँच "फाइल एक शीर्ष लेख पंक्ति है"। स्रोत Labware पद के लिए "SRC_BASE" और स्रोत Labware में अच्छी तरह से जानकारी के लिए "WELL_BASE" का चयन करें, गंतव्य के लिए Labware "DEST_MACT" और गंतव्य Labware में अच्छी तरह से जानकारी के लिए "WELL_MACT" का चयन करें, और ( "VOL_BASE" का चयन मात्रा के बारे में जानकारी के लिए चित्रा 10)। P1000 खरीदारों के लिए उचित तकनीक हस्तांतरण चुना।
      नोट: LLS इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है।
    15. यह सीधे "एक्टिवेशन कॉकटेल" "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" बनाने के लिए "बेस कॉकटेल" के साथ मिलाया जा रहा है कि हस्तांतरण करने के लिए नीचे "समूह" खींचकर एक और "फाइल से स्थानांतरण" जोड़ें (चित्रा 7 </ Strong>)। इसी तरह 3.2.13 और 3.2.14 में कदम के रूप में स्थानांतरण की स्थापना की। अपवाद के रूप में निम्नानुसार हैं: एक) स्रोत Labware में अच्छी तरह से जानकारी के लिए स्रोत Labware पद के लिए "SRC_ACT", ख) "WELL_ACT" का चयन करें, और ग) की मात्रा के बारे में जानकारी के लिए "VOL_ACT"।

4. संचालन प्रक्रिया

  1. पहला, सॉफ्टवेयर चिह्न डबल-क्लिक कंप्यूटर पर 2 डी बारकोड रीडर लांच करने के लिए।
  2. फिर, सॉफ्टवेयर चिह्न डबल-क्लिक कंप्यूटर पर स्वचालित तरल हैंडलर लांच करने के लिए।
  3. के तहत "साधन", स्वचालित तरल हैंडलर के प्रधानमंत्री सीरिंज के लिए "घर सभी अक्ष" का चयन करें। सुनिश्चित करें कि सभी सीरिंज नहीं दिखाई हवाई बुलबुले को शामिल करें।
    नोट: "घर सभी अक्ष" भी साधन है जिसके बाद से चालें बनाने के लिए संदर्भ का एक बिंदु दे देंगे।
  4. एक के लिए "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" बनाने के लिए विधि सॉफ्टवेयर में (चित्रा 2) खोलेंutomated तरल हैंडलर।
  5. Microfuge ट्यूब "BASE_CT" और "ACT_CT" "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" की संख्या के हिसाब से किए जाने के लिए के लिए "SmallTuberack_microfugetubes" (चित्रा 3) में रखें। फिर "साधन सेटअप" (चित्रा 5) के अनुसार डेक पर उन्हें जगह है।
  6. "साधन सेटअप" के अनुसार डेक पर बफर के साथ जलाशय रखें।
  7. डी-टोपी 2 डी बारकोड एक 8 चैनल पेंच टोपी decapper का उपयोग कर एंटीबॉडी युक्त ट्यूबों। आदेश पार संक्रमण से बचने के लिए एक टोपी धारण ट्रे पर सटीक क्रम में टोपियां रखें। "साधन सेटअप" (चित्रा 5) के अनुसार डेक पर "Matrix_OneML_TubeRack" रखें।
  8. प्लेस P50 LLS फ़िल्टर टिप्स, P200 LLS फ़िल्टर टिप्स, और P1000 सुझावों के डेक पर "साधन सेटअप" (चित्रा 5) के अनुसार।
  9. हरी त्रिकोणीय क्लिक करके विधि शुरूकोण के आकार का प्रारंभ आइकन। पॉपअप विंडो से प्रेरित के रूप में, सुनिश्चित करें कि डेक पर सभी आइटम "साधन सेटअप" मैच के रूप में परिभाषित विधि बनाते हैं। किसी भी वस्तु है कि छत पर "साधन सेटअप" में सूचीबद्ध नहीं हैं, जगह के रूप में इस फली और / या ग्रिपर कुचल सकता है मत करो। आगे बढ़ने के लिए प्रेस "ठीक है"।
  10. बाद "Matrix_OneML_TubeRack" 2 डी बारकोड रीडर पर ले जाया जाता है और बारकोड को पढ़ रहे हैं, एक और पॉप अप विंडो से पूछना होगा कि क्या सभी बारकोड को पढ़ रहे हैं। दबाने "ठीक है" से आगे बढ़ना एक बार पुष्टि की है।
  11. स्वचालित तरल हैंडलर द्वारा हस्तांतरण के पूरा होने पर, 2 डी बारकोड वाले एक 8 चैनल पेंच टोपी decapper का उपयोग कर नलियों संक्षिप्त, और उन्हें वापस 4 डिग्री सेल्सियस के लिए डाल दिया।
  12. भंवर सभी microfuge ट्यूबों सख्ती 20 सेकंड के लिए, और उन्हें ट्यूब रैक में वापसी।
    नोट: अपर्याप्त vortexing कोशिकाओं के सबऑप्टिमल धुंधला में परिणाम हो सकता है।
  13. "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" बनाने के लिए विधि बंद। फिर "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" बनाने के लिए विधि खुला।
  14. "BiocisionCoolRack_XT" (8 चित्रा) पर पूर्व लेबल 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूबों सेट अप और डेक पर जगह है। लेबल संकेत चाहिए क्या "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" के रूप में अच्छी तरह से उचित रोगी आईडी के रूप में मिश्रित कर रहे हैं।
  15. "बेस कॉकटेल", "एक्टिवेशन कॉकटेल", और P1000 सुझावों के डेक पर (9 चित्रा) के लिए ट्यूब रैक रखें। विधि (चित्रा 7) शुरू करें। पॉपअप विंडो से प्रेरित के रूप में, यह सुनिश्चित कर लें कि विधि में डेक मैच वाद्य सेटअप पर आइटम (9 चित्रा)। आगे बढ़ने के लिए प्रेस "ठीक है"।
  16. जब उपरोक्त प्रक्रिया से किया जाता है, स्वयं एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब कि एंटीबॉडी कॉकटेल होता है में रक्त नमूनों में से 50 μl जोड़ें।
  17. एक द्वितीय श्रेणी के जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर भंवर नमूना ट्यूब और अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट सेते हैं। Takई देखभाल ट्यूबों के किनारों पर खून streaking से बचने के लिए, के रूप में यह असंगत धुंधला में परिणाम होगा। ध्यान से प्रवाह धोने बफर के साथ सिक्त कपास swabs द्वारा रक्त के किसी भी धारियाँ को हटा दें।
  18. आरबीसी lysis बफर के 1 मिलीलीटर मैन्युअल रूप से जोड़ें और अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट सेते हैं।
  19. 400 x जी 5 मिनट के लिए प्रवाह धोने बफर (0.1% सोडियम azide, 1% बीएसए, 10 यू / 1x HBSS में मिलीलीटर हेपरिन) और सेंट्रीफ्यूज के 2 मिलीलीटर जोड़ें। एक द्वितीय श्रेणी के जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर सतह पर तैरनेवाला त्यागें। इस कपड़े धोने की प्रक्रिया को दोहराएं। फिर से निलंबित प्रवाह धोने बफर के 0.5 मिलीलीटर में दाग कोशिकाओं।
  20. सेट अप है कि एक प्रवाह cytometer आटा लेजर और उपयुक्त फिल्टर, और चलाने के नमूनों 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब का उपयोग के साथ सुसज्जित है। डेटा संग्रह 12,15 के लिए मानक कोशिकामापी अंशांकन और प्रतिदीप्ति मुआवजा विधियों का उपयोग करें। तालिका 1 में "fluorophore" में सूचीबद्ध सभी मापदंडों लीजिए।
    नोट: उचित नियंत्रण सामग्री उचित गधा सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक दौड़ में इस्तेमाल किया जाना चाहिएप्र प्रदर्शन।
  21. चल नमूनों के बाद, निर्यात एफसीएस फ़ाइलों के रूप में डेटा हासिल कर ली।
  22. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण। टी सेल एक gating रणनीति मानव इम्यूनोलॉजी 1 परियोजना द्वारा उल्लिखित का उपयोग कर सबसेट को पहचानें।

Representative Results

पूरे रक्त immunophenotyping के लक्ष्य मात्रात्मक (प्रतिरक्षा सेल सबसेट का चित्रण) और गुणात्मक (सक्रियण स्थिति का पता लगाने) प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए है। हम थोड़ा टी सेल immunophenotyping पैनल मानव इम्यूनोलॉजी 1 परियोजना द्वारा प्रस्तावित हमारे विधि (तालिका 1) के समग्र प्रदर्शन में सुधार करने के लिए संशोधित किया है। हमारे टी सेल पैनल भोले, केंद्रीय स्मृति (मुख्यमंत्री), प्रेरक स्मृति (ईएम), और प्रेरक टी कोशिकाओं की पहचान करना है। संक्षेप में, हम एफसीएस-ए और एफसीएस-एच के आधार पर भेदभाव दोहरी। तो फिर हम ओर तितर बितर और CD45 के स्तर के आधार पर लिम्फोसाइट गेट। टी कोशिकाओं तो CD3 की अभिव्यक्ति से पहचाने जाते हैं। CD3 + टी कोशिकाओं γδ टी कोशिकाओं और αβ टी कोशिकाओं में भेदभाव कर रहे हैं। αβ टी कोशिकाओं आगे सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी कोशिकाओं में विभाजित हैं। सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी कोशिकाओं तो expressio के आधार पर उनके सबसेट के लिए विश्लेषण कर रहे हैंCD45RA और CCR7 के एन: - CCR7 + मुख्यमंत्री, CD45RA + CCR7 + भोली, CD45RA + CCR7 - CD45RA प्रेरक, और CD45RA - CCR7 - ईएम टी कोशिकाओं 1। इसके अतिरिक्त, हम भी इस तरह के CD38, एचएलए डॉ, ICOS, पीडी -1, GITR, 4-1BB, CD69, NKG2D, और OX40 के रूप में सक्रियण मार्कर की उनकी अभिव्यक्ति की निगरानी गुणात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए।

इस विधि का सटीक प्रदर्शन करने के लिए, हम पूरे परिधीय रक्त के नमूनों 4 स्वस्थ दाताओं से 5 बार एक दिन में दाग। चित्रा 11 gated लिम्फोसाइटों और विचरण (% सीवी) का प्रतिशत गुणांक पर प्रतिशत टी सेल उप-जनसंख्या के बीच संबंध को दर्शाता है। Gated लिम्फोसाइटों और प्रत्येक सबसेट के लिए% CV पर प्रतिशत टी सेल उप-जनसंख्या की एक विस्तृत टूटने टेस्ट 2 से 8। डेटा तालिका में दिखाया गया है और 3 चित्रा 11 और सादगी के लिए टेबल 8 में शामिल नहीं हैं। 25% से कम सीवीरन (अंतर-परख सटीक) के बीच अनुसंधान उपयोग के लिए 10 प्ररूपी बायोमार्कर assays के लिए स्वीकृति मानदंडों के लिए सुझाव दिया गया है। सभी मापन ICOS + γδ टी कोशिकाओं (26.64-46.39%। टेबल 8) और ICOS + CD8 टी कोशिकाओं (14.64-58.39%। टेबल 8) को छोड़कर इस मापदंड से मुलाकात की। इन मूल्यों प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए दिखाए जाते हैं। हम इन मापों का उपयोग नहीं क्योंकि ICOS मुख्य रूप से सीडी 4 टी कोशिकाओं की सक्रियता के 16 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आबादी है कि कुल आबादी के लिए एक कम प्रतिशत समावेश में उच्च% सीवी की प्रवृत्ति दूसरों 7 से मनाया गया। मामले में जांचकर्ताओं दुर्लभ घटनाओं की निगरानी में रुचि रखते हैं, कोशिकाओं की संख्या की जांच की जरूरत है ताकि अधिक से अधिक अस्पष्टता दूर करने के लिए 17 में वृद्धि हुई है। साथ में, हमारे डेटा पूरे रक्त का नमूना immunophenotyping तैयारी में स्वचालन के सफल तैनाती दिखा।

< img alt = "चित्रा 1" src = "/ files / ftp_upload / 53,485 / 53485fig1.jpg" />
चित्रा 1. परिधीय पूरे रक्त के साथ immunophenotyping के लिए कार्यप्रवाह। Immunophenotypic परख के कदम से कदम कार्यप्रवाह दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" बनाने के लिए विधि का अवलोकन। "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" स्वचालित तरल हैंडलर के लिए सॉफ्टवेयर में बनाने के लिए विधि में कदम दिखाए जाते हैं। देखने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

ई 3 "src =" / files / ftp_upload / 53,485 / 53485fig3.jpg "/>
चित्रा 3. BACE_CT और ACT_CT साथ ट्यूब रैक के लिए लेआउट। (ए) ट्यूब रैक "BACE_CT" के लिए लेआउट दिखाता है। (बी) ट्यूब रैक "ACT_CT" के लिए लेआउट दिखाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. 2 डी बारकोड ट्यूब के साथ ट्यूब रैक के लिए Labware परिभाषा। 2 डी बारकोड ट्यूब के साथ ट्यूब रैक को परिभाषित करने के कदम प्रक्रिया द्वारा कदम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

485fig5.jpg "/>
चित्रा 5. "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" बनाने के लिए विधि के लिए साधन सेटअप। यह "बेस कॉकटेल" और "एक्टिवेशन कॉकटेल" बनाने के लिए विधि के लिए डेक लेआउट दिखाता है। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें चित्रा।

चित्रा 6
चित्रा 6 "डेटा सेट बनाएँ" के लिए सेटअप। इसके लिए "बनाएँ डेटा सेट" विस्तृत सेटिंग से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
figu पुन 7. "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" बनाने के लिए विधि का अवलोकन। स्वचालित तरल हैंडलर के लिए सॉफ्टवेयर में "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" बनाने के लिए विधि में कदम दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
चित्रा 8. 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब के साथ ट्यूब रैक के लिए लेआउट। यह ट्यूब रैक "SPL_TUBES_1" के लिए लेआउट दिखाता है। FM3 का मतलब प्रतिदीप्ति शून्य से 3 (421 प्रतिभाशाली बैंगनी, phycoerythrin, और allophycocyanin)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ftp_upload / 53,485 / 53485fig9.jpg "/>
9 चित्रा "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" बनाने के लिए विधि के लिए साधन सेटअप। यह "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" बनाने के लिए विधि के लिए डेक लेआउट दिखाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 10
चित्रा 10 "फ़ाइल से स्थानांतरण" के लिए सेटअप। यह "फ़ाइल से स्थानांतरण के लिए" विस्तृत सेटिंग से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

11 चित्रा
चित्रा 11. कम vari चार स्वस्थ दाताओं से विश्लेषण किया सभी सेल आबादी के एकल सीवी मूल्यों अर्द्ध स्वचालित पूरे रक्त immunophenotyping में क्षमता। नीले खुला चक्र के रूप में दिखाया गया है। प्रतिगमन वक्र ब्लू लाइन में दिखाया गया है। लाल लाइनों से संकेत मिलता है 95% विश्वास बैंड और लालच बिंदीदार लाइनों 95% भविष्यवाणी बैंड दिखाने बिंदीदार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 12
चित्रा 12. सबऑप्टिमल धुंधला हो जाना। धुंधला की एक उदाहरण है "BACE_CT" और "ACT_CT" से microfuge ट्यूबों की पर्याप्त या अपर्याप्त vortexing के साथ आयोजित किया गया। वहाँ बी में दो गेटेड आबादी हैं। कमजोर CD45 धुंधला के साथ नाबालिग आबादी कोशिकाओं है कि इष्टतम धुंधला नहीं मिलता है प्रतिनिधित्व करता है।g12large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ग्रुप मार्कर fluorophore क्लोन अनुमापांक (μl / धुंधला)
आधार कॉकटेल TCELL CD45 FITC 2D1 0.4
CD3 Alexa700 UCHT1 1
सीडी 8 एपीसी-H7 SK1 0.4
सीडी 4 PerCP-Cy5.5 SK3 2
CCR7 पीई-CF594 150,503 1
CD45RA पीई Cy7 L48 1
TCRab BV786 </ Td> T10B9.1A-31 1
TCRgd BV650 बी 1 5
सक्रियण कॉकटेल-1 test1 एचएलए डीआर BV421 G46-6 5
CD278 (ICOS) पीई DX29 5
CD38 एपीसी HB7 1
सक्रियण कॉकटेल-2 test2 CD279 (PD1) BV421 EH12.1 2.5
CD357 (GITR) पीई eBioAITR 5
CD137 (41BB) एपीसी 4B4-1 10
सक्रियण कॉकटेल-3 test3 CD69 BV421 FN50 1 </ Td>
CD314 (NKG2D) पीई 1D11 2
CD134 (OX40) एपीसी ACT35 5

तालिका 1. संशोधित टी सेल पैनल के लिए एक एंटीबॉडी सूची।

एबी ई.पू.
CD45_FITC 0163562388
CD3_Alexa700 0163562110
CD4_PerCP_CY5.5 0163562364
CD8_APC-H7 0163562363
CCR7_PE-CF594 0163562387
CD45RA_PE-Cy7 0163562091
TCRab_BV786 0163562069
TCRgd_BV650 0163562108
0163562339
A_CD278 (ICOS) _PE 0163562082
A_CD38_APC 0163562317
A_CD279 (PD1) _BV421 0163562340
A_CD357 (GITR) _PE 0163562093
A_CD137 (41BB) _APC 0163562315
A_CD69_BV421 0163562341
A_CD314 (NKG2D) _PE 0163562314
A_CD134 (OX40) _APC 0163562316

2 डी बारकोड संख्या के साथ तालिका 2 एंटीबॉडी के नाम।

ग्रुप WELL_BASE AB_NAME वॉल्यूम
TCELL 1 7.2
TCELL 1 CD45_FITC 7.2
TCELL 1 CD3_Alexa700 18
TCELL 1 CCR7_PE-CF594 18
TCELL 1 CD45RA_PE-Cy7 18
TCELL 1 TCRab_BV786 18

तालिका 3. एक फ़ाइल "BASE_CT_P50": एंटीबॉडी के नाम और मात्रा के बारे में जानकारी।

ग्रुप WELL_BASE AB_NAME वॉल्यूम
TCELL 1 CD4_PerCP_CY5.5 36
TCELL 1 TCRgd_BV650 90

तालिका 4. एक फ़ाइल "BASE_CT_P200": एंटीबॉडी के नाम और मात्रा के बारे में जानकारी।

ग्रुप WELL_ACT AB_NAME वॉल्यूम
test1 7 A_HLA-DR_BV421 30
test1 7 A_CD278 (ICOS) _PE 30
test1 7 A_CD38_APC 6
test2 13 A_CD279 (PD1) _BV421 15
test2 13 A_CD357 (GITR) _PE 30
test3 19 A_CD314 (NKG2D) _PE 12
test3 19 A_CD69_BV421 6
test3 19 A_CD134 (OX40) _APC 30

सारणी 5. एक फ़ाइल "ACT_ CT_P50": एंटीबॉडी के नाम और मात्रा के बारे में जानकारी।

ग्रुप WELL_ACT AB_NAME वॉल्यूम
test2 13 A_CD137 (41बी बी) _APC 60

6 तालिका एक फ़ाइल "ACT_CT _P200": एंटीबॉडी के नाम और मात्रा के बारे में जानकारी।

HD003
दाता # SRC_
आधार 		आधार कॉकटेल कुंआ_
आधार 		VOL_
आधार 		SRC_ACT ACTI-
छुपा
कॉकटेल 		कुंआ_
अधिनियम 		VOL_ACT DEST_MACT कुंआ_
एमएसीटी
HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 1
HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test1 7 36 SPL_TUBES_1 7
HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test2 13 42.5 SPL_TUBES_1 13
HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test3 19 33 SPL_TUBES_1 19
HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 2
HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 test1 7 36 SPL_TUBES_1 8
HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test2 13 42.5 SPL_TUBES_1 14
HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test3 19 33 SPL_TUBES_1 20
HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 3
HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test1 7 36 SPL_TUBES_1 9
BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test2 13 42.5 SPL_TUBES_1 15
HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test3 19 33 SPL_TUBES_1 21
HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 4
HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test1 7 36 SPL_TUBES_1 10
HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test2 13 42.5 SPL_TUBES_1 16
HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT test3 19 33 SPL_TUBES_1 22

टेबल 7. एक फ़ाइल "AB_MACT": स्रोत और "मास्टर एंटीबॉडी कॉकटेल" के लिए गंतव्य के बारे में जानकारी।

छवि में जनसंख्या #। 1 मैं द्वितीय III चतुर्थ v
जनसंख्या नाम CD3 + एबी टी कोशिकाओं जीडी टी कोशिकाओं CD3 + सीडी 4+ CD3 + सीडी 8 +
लिम्फोसाइटों के% </ Td> Heathly दाता # 1 ७९.८० 75.20 2.70 49.60 22.30
Heathly दाता # 2 69.40 ६१.९० 5.85 44.40 16.20
Heathly दाता # 3 ७५.८० 69.60 4.75 42.00 23.50
Heathly दाता # 4 ७७.२० 73.50 1.98 52.70 18.90
%सीवी Heathly दाता # 1 1.42 1.58 3.70 2.50 1.56
Heathly दाता # 2 2.48 2.39 5.74 2.82 2.41
Heathly दाता # 3 1.15 1.40 6.32 1.42 2.72
Heathly दाता # 4 0.81 0.94 5.45 1.20 1.44
औसत 1.47 1.58 5.30 1.99 2.03
मानक विचलन 0.72 0.61 1.13 0.79 0.63

लिम्फोसाइट और प्रत्येक सबसेट के लिए% सीवी में चित्रा 4. नोट साजिश रची का% के लिए तालिका 8. कच्चे डेटा है कि टेस्ट मैचों में 2 और 3 के लिए डेटा डेटा प्रस्तुति को आसान बनाने के लिए चित्रा 5 और 8 तालिका में नहीं दिखाया जाता।

Discussion

परिधीय रक्त की Immunophenotyping प्रतिरक्षा करने के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाओं में अंतर्दृष्टि पाने के लिए महत्वपूर्ण है। चुनौती प्रयोग करने वाली प्रयोग परिवर्तनशीलता 1,14 नियंत्रित करने के लिए परख मानकीकरण में निहित है। परिवर्तनशीलता का एक मुख्य स्रोत के नमूने के मानव हेरफेर में निहित है। इसलिए, यह है कि नमूना प्रसंस्करण के आंशिक या पूर्ण स्वचालन प्रयोग करने वाली प्रयोग परिवर्तनशीलता 1,14 में एक नाटकीय कमी की सुविधा होगी बोधगम्य है। इस प्रोटोकॉल में, हम हमारे सफल पूरे रक्त नमूना immunophenotyping में धुंधला के लिए 2 डी बारकोड रीडर के साथ सुसज्जित एक स्वचालित तरल हैंडलर को शुरू करने से परख परिवर्तनशीलता को कम करने के प्रयास की रिपोर्ट।

डिजाइन में, हमारे विधि बहुमुखी है और अतिरिक्त "बेस कॉकटेल" को परिभाषित करने के लिए उन्हें जोड़ने के द्वारा अन्य प्रतिरक्षा सबसेट निगरानी कर सकते हैं। इस तरह के सबसेट टी सहायक कोशिकाओं, टी नियामक कोशिकाओं बी कोशिकाओं, एन.के. कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं, और monocytes (पांडुलिपि में शामिलतैयारी) 18। हम 1 अतिरिक्त मार्कर को शुरू करने से संघ की सिफारिश की एंटीबॉडी पैनलों अनुकूलित। सेल आबादी "बेस कॉकटेल" शानदार बैंगनी 421 (BV421) में कम से कम उत्सर्जन के साथ fluorochromes संयुग्मित, phycoerythrin (पीई) का उपयोग कर की पहचान की गई है, और allophycocyanin (एपीसी) डिटेक्टरों, जैसा कि हम inducible एंटीजन का पता लगाने के लिए इन चैनलों को आरक्षित करना चाहता था। यह सुविधा न केवल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता स्थिति पर नजर रखने के लिए उच्चतम संवेदनशीलता सुनिश्चित करता है लेकिन यह भी नए सक्रियण मार्कर का लचीला आवास के रूप में इन तीन fluorochromes सबसे अक्सर inducible मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित हैं सक्षम बनाता है। इसलिए, हमारे विधि न केवल पूरे रक्त immunophenotyping के लिए कॉकटेल तैयार करने के लिए उपयुक्त है, लेकिन यह भी परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear और कोशिकाओं अलग-अलग ऊतकों (जैसे, ट्यूमर) से बरामद सहित अन्य नमूने धुंधला करने के लिए उपयोगी है।

सफल परिचयहमारे विधि के duction Labware तैयारी में कदम के लिए विशेष ध्यान देने की, और programing और विधि के निष्पादन की आवश्यकता है। 2 डी बारकोड ट्यूब की तैयारी मानव पठनीय लेबल और नामित ट्यूबों के लिए एंटीबॉडी के हस्तांतरण के साथ लेबलिंग भी शामिल है। त्रुटियों की शुरूआत को रोकने के लिए, हम दो लोगों के साथ यह कर सलाह देते हैं। जब भी स्प्रेडशीट बदल रहा है, जांचकर्ताओं को सत्यापित करना चाहिए विधि ठीक से काम करता है। programing के दौरान उचित pipetting तरीकों का चयन सफल तरल हस्तांतरण सुनिश्चित करता है। LLS एंटीबॉडी ट्यूब, जिसके लिए हम या तो P50 या P200 प्रवाहकीय युक्तियों का उपयोग मलबे के नीचे से उपजी हो रही बिना pipetting सक्षम बनाता है। LLS P1000 खरीदारों के लिए एक अच्छा विकल्प नहीं हो सकता है के रूप में LLS P1000 सुझावों के साथ और अधिक संवेदनशील है और कभी कभी झूठा बुलबुले की उपस्थिति से शुरू हो गया। Labware परिभाषा हाइट्स, प्रत्येक साधन के रूप में सबऑप्टिमल तरल हस्तांतरण हो सकता है के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, अगर वहाँ सुझावों की बढ़त के बीच पर्याप्त जगह नहीं हैऔर ट्यूबों के नीचे। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 12, अगर "बेस कॉकटेल" और / या "एक्टिवेशन कॉकटेल" अच्छी तरह से vortexed नहीं कर रहे हैं, यह सबऑप्टिमल धुंधला में परिणाम हो सकता है।

हम एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में सेल धुंधला के लिए lyophilized अभिकर्मकों का उपयोग अभिकर्मक वितरण 19 के साथ संबंधित परिवर्तनशीलता को कम करने के बारे में सोचा। हालांकि, शानदार बैंगनी रंगों के बहुलक conjugates एक-दूसरे के कारण गैर विशिष्ट संकेतों के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है। जैसे, उनका कहना है दो से अधिक बहुलक conjugates (जैसे, BV421 और BV650 आदि) lyophilized अभिकर्मकों में गैर विशिष्ट संकेतन कारण हो सकता है (जैसे, BV421 + जनसंख्या में BV650 पृष्ठभूमि संकेत की वृद्धि) 20। इसके अलावा, lyophilized अभिकर्मकों नई धुंधला सहित के लिए लचीलापन की कमी है। वे आम तौर पर अधिक महंगे हैं और एक थोक आदेश की आवश्यकता होती है। उन कारणों के लिए, हम 2 डी बारकोड ट्यूब से लैस स्वचालित तरल हैंडलर का उपयोग करने के लिए चुना है। हालांकि यह टीakes समय की स्थापना की और एक अग्रिम निवेश पर जोर देता साधन खरीद करने के लिए लंबे समय में इस तरह के कारकों में उत्पादकता वृद्धि और assays के reproducibility द्वारा लिए मुआवजा दिया जाएगा, में करने के लिए। वास्तव में, कुछ समूहों ने पहले immunophenotyping या इसी तरह के अनुप्रयोगों 21,22 के अपने कार्यप्रवाह में स्वचालित तरल हैंडलर के सफल एकीकरण की सूचना दी। प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए स्वचालित समाधान भी वाणिज्यिक स्रोतों (FACS स्पा तृतीय, स्वचालित कॉकटेल तैयारी कार्य केंद्र, और FlowStainer) से उपलब्ध हैं। यह आगे इंगित करता है immunophenotyping के लिए स्वचालित कॉकटेल तैयार करने के लिए एक बड़ी जरूरत है।

इस तकनीक के माहिर के बाद, हम कल्पना है कि पूरी तरह से स्वचालित पूरे रक्त immunophenotyping के विकास के लिए आगे प्रयोग करने वाली परिवर्तनशीलता प्रयोग कम हो जाएगा और पूरे रक्त immunophenotyping भी 23 की स्थापना एक multicenter चिकित्सीय परीक्षण में संभव बना सकता है। हम पहले से ही उपयोग कर एक lyse था शुरू कर दिया हैज सहायक सेल और धोने कदम स्वचालित करने के लिए। हम यह भी कल्पना है कि 2 डी बारकोड ट्यूबों में एंटीबॉडी की मात्रा और अभिकर्मक वितरण की ट्रैकिंग के स्वचालित दृढ़ संकल्प बहुत क्रमश एंटीबॉडी की सूची और हमारे विधि से अधिक गुणवत्ता नियंत्रण में सुधार होगा।

Disclosures

वाईके, ILG, टीएलएम, WLM, DPH, और KSB: नहीं प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की। चींटी Beckman कल्टर के एक कर्मचारी है, इस वीडियो लेख के प्रकाशन इंक Beckman कल्टर, इंक द्वारा प्रायोजित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD LSRFortessa BD Biosciences Flow cytometer
NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation  Beckman Coulter A31839 Laboratory Automation Workstation 
Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 ml Microfuge Tubes (case of 25) Beckman Coulter 373696 Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. 
LLS kit Beckman Coulter 719262 Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing
24-Position Tube Rack Beckman Coulter 373661 Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood
BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12 x 24 INCHES RED LabMart M111416 Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation
VisionMate High Speed 2D Barcode Reader Thermo Scientific AB-1850 2D barcode reader
8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper Thermo Scientific 4105MAT For de-capping and capping 2D barcode tubes 
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-335 For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation
CoolRack XT CFT24 biocision BCS-534 To hold sample tubes.
1.0 ml Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks Thermo Scientific 3741AMB 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies
Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1,025 µl Beckman Coulter 987925 Tips for Laboratory Automation Workstation 
Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µl (Case of 10 racks) Beckman Coulter B01091 Tips for Laboratory Automation Workstation 
Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) Beckman Coulter 394627 Tips for Laboratory Automation Workstation 
BD FACS Lysing Solution 10x Concentrate BD Biosciences 349202 RBC lysis
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes Fisher Scientific 14-959-5 Sample tubes
Anti-CD45 FITC BD Biosciences 347463 Effector T cell panel (base)
Anti-CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0038-42 Effector T cell panel (base)
Anti-CD4 PerCPCy5.5 BD Biosciences 341654 Effector T cell panel (base)
Anti-TCRgd BV650 BD Biosciences 564156 Effector T cell panel (base)
Anti-TCRab BV786 BD Biosciences 563825 Effector T cell panel (base)
Anti-CD8 APC-H7 BD Biosciences 560179 Effector T cell panel (base)
Anti-CCR7 PE-CF594 BD Biosciences 562381 Effector T cell panel (base)
Anti-CD45RA PE-Cy7 BD Biosciences 337167 Effector T cell panel (base)
Anti-HLA-DR BV421 BD Biosciences 562804 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD278(ICOS) PE BD Biosciences 557802 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD38 APC BD Biosciences 340439 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD279(PD1) BV421 BD Biosciences 562516 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD357(GITR) PE eBioscience 12-5875-42 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD137(41BB) APC BD Biosciences 550890 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD69 BV421 BD Biosciences 562884 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD314(NKG2D) PE BD Biosciences 557940 Effector T cell panel (activation)
Anti-CD134(OX40) APC BioLegend 350008 Effector T cell panel (activation)
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper Fisher Scientific 02-689-6 For collecting blood
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade EMD Millipore 126593 For flow wash buffer
Sodium Azide Sigma-Aldrich S8032 For flow wash buffer
Heparin, sodium salt Affimetrix 16920 For flow wash buffer
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1x, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red GE Healthcare Life Sciences SH30588.02 For flow wash buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
  2. Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
  3. Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
  4. Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
  5. Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
  6. Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
  7. Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
  8. Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
  9. Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
  10. O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
  11. Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
  12. Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  13. Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
  14. Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
  15. Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
  16. Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
  17. Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
  18. Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
  19. Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
  20. BD biosciences. Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
  21. Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
  22. Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
  23. Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 108 पूरे रक्त मानव स्वचालन प्रवाह cytometry immunophenotyping प्रतिरक्षा निगरानी ​​टी कोशिकाओं सक्रियण इम्यूनोलॉजी 2 डी बारकोड स्वचालित तरल हैंडलर प्रतिरक्षा
मानव परिधीय रक्त की Immunophenotypic विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करने के लिए एक अर्ध-स्वचालित दृष्टिकोण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koguchi, Y., Gonzalez, I. L.,… More

Koguchi, Y., Gonzalez, I. L., Meeuwsen, T. L., Miller, W. L., Haley, D. P., Tanibata-Branham, A. N., Bahjat, K. S. A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (108), e53485, doi:10.3791/53485 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter