Abstract
フローサイトメトリーによる末梢血の免疫表現型は、疾患や治療中の末梢白血球の周波数と活性化状態の変化を決定します。これは、治療効果を予測し、新たな治療標的を同定する可能性を有します。全血染色は、試料調製中に発生するアーチファクトを最小限に未操作の血液を利用します。しかし、全血染色はまた、サンプルの完全性を保証するために、新鮮に採取した血液で行う必要があります。さらに、それはタンデム色素の潜在的な不安定性を回避し、鮮やかな紫色の色素間の試薬の相互作用を防止するために、同じ日に抗体カクテルを用意するのが最善です。したがって、全血染色は、イントラ及びインター実験的変動を制御するために慎重な標準化が必要です。
ここでは、不格好なやつを製造する標準的なプロセスに二次元（2D）バーコードリーダを備えた自動液体ハンドラーの展開を報告フローサイトメトリーのためのyのカクテルをお楽しみいただけます。抗体は、データベースにまとめ、96ウェルフォーマットと内容に配置された2次元バーコードのチューブに移しました。液体ハンドラは、データベース内の抗体の名前を参照することにより、ソース抗体のバイアルを見つけることができます。我々の方法は、ソース抗体管の位置決めのための面倒な調整を排除しました。これは、ユーザーが容易にアッセイするためのソフトウェア方法でスクリプトを書き換えることなく、データベースを変更することにより、このような特定の使用に対する抗体、ボリューム、および宛先として抗体分配プロセスにおける詳細の任意の数を変更することを可能にする汎用性を提供しました。
コンセプト実験の証明がサイトメトリーアッセイ11色、17-抗体フローの複製準備によって実証され、優れたインターとイントラアッセイ精度を達成しました。これらの方法論は、フローサイトメトリーアッセイのための全体的なスループットを増加し、詳細なフェノために必要な複雑な抗体カクテルの毎日の準備を容易に新鮮に採取し、抗凝固末梢血のtypicキャラクタリゼーション。
Introduction
ヒト末梢血の免疫表現は、免疫細胞サブセット1の量的および質的な変化を決定します。これは、アクションと抵抗、予測バイオマーカーの補助発見のメカニズムへの洞察を提供し、組み合わせ免疫療法の開発を容易にします。したがって、免疫表現の検証および標準化は学術研究者、臨床検査室、および産業にかなりの関心の領域です。
フローサイトメトリー法により、末梢血の免疫表現型は、現在、血液悪性腫瘍2,3およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染4,5、免疫療法の要求のために、末梢血の信頼性免疫表現そのため、検証および標準化における特定の考慮事項の臨床管理のために使用されているが免疫細胞サブセットおよび活性化/抑制性受容体1,6-8をより広範なカバレッジを必要とします。 Successful免疫表現は、機器のセットアップおよび細胞染色手順9,10に関連した実験間の変動を最小限にするために慎重な標準化が必要です。フローサイトメトリーのための機器設定の標準化は、元の関心9,11,12に対処するために十分に確立されているが、それは、免疫細胞サブセット、およびそれらの活性化状態のカバレッジを制限することなく、細胞染色に関連するばらつきを最小限に抑えるためにどのように不明なままです。
抗原の数は増加を検出することができるように、そのようにあまりにも次善の試薬の分注と交差汚染に起因する誤差と変動の機会を行います。抗凝固処理全血のphenoptypic分析のための方法は、臨床アッセイにおける使用のため1980年代後半に設立されました。これらの同じ方法は、試料調製のための研究室のニーズに応えます。重要なことは、臨床検査室で使用される抗体カクテルは、一般的にあまり複雑でAVAですメーカーからilable予め力価およびプレミックス。プレミックス抗体カクテルの唯一のシングル転送が必要です。研究の設定では、10月16日の抗体の抗体カクテルが典型的です。各カクテルは、実験室によって安定性を検証または各アッセイの前に新たに調製されなければなりません。サンプルに対して複数の抗体カクテルを準備する50-80個々の抗体のピペット操作、面倒でエラーが発生しやすいの両方で作業を伴う可能性があります。
カクテルの準備の自動化は、このようなエラーが少なく、手動カクテル製剤に比べていくつかの利点は、ピペット操作の正確さを増加させ、そしておそらくは試薬浪費を減少しています。ここでは、調製物をサンプリングするために関連するばらつきを最小限に抑えるために免疫表現型の細胞染色プロセスに二次元（2D）バーコードリーダーを装備した自動液体ハンドラーの導入に成功を報告します。
Protocol
このプロトコルにおける末梢血の収集と使用は、プロビデンスヘルス＆サービス治験審査委員会によって承認されました。すべての人間の被験者は、彼らの書面によるインフォームドコンセントを提供しました。
注：ユニバーサル上の注意に従ってください。すべての人間の血液は感染性およびバイオセーフティレベル2の慣行に従って処理かのように扱われるべきです。
注：末梢全血を用いて免疫表現型は、赤血球を除去するために、低張溶解、続いて細胞表面抗原を検出するための蛍光タグ化モノクローナル抗体で抗凝固処理全血をインキュベートすることによって行われます。細胞を洗浄し、試料をフローサイトメーターで分析します。本明細書に記載される方法は、2Dバーコードリーダーを搭載した自動化液体ハンドラーを用いて抗体カクテルの準備に焦点を当てています。まず、免疫細胞サブセットを識別する「ベースカクテル」とiを監視する「アクティベーションカクテル」nducible抗原は、別々に（ 表1）を調製します。その後、両方のカクテルは、「マスター抗体カクテル」を作成するために混合されます。ワークフローの図1を参照してください。
1.試料
- 室温で保持し、その後、ヘパリンナトリウム抗凝固処理血液収集チューブ内の静脈穿刺を介して末梢血を収集し、適切な混合を確実にするために穏やかに数回反転させ、そして。凝固または13溶血場合は、検体を拒否します。
2.実験器具の準備
- ラベル2Dバーコードの人間が読み取り可能なラベル付きチューブ（抗体名、ベンダー、カタログ番号、ロット番号）。
- 2次元バーコード管を対応する（ 表1に記載されている）ベンダーからの抗体のバイアルの内容全体を転送します。
注：誤って試薬の次善の転送につながる液面検知（LLS）をトリガ気泡として気泡を導入しないように、細心の注意を払ってください。
注：することを確認し、各抗体のviアルは、実行のために十分な抗体を持っています。 - 2次元バーコードリーダーにより各チューブのための2次元バーコードを読み取ります。
- 表計算ソフトを用いて抗体名前（AB）とバーコードの読み取りを含むスプレッドシート（BC）を作成し、「AB_BC.csv」（ 表2）のようにカンマで区切られた値（CSV）ファイルを、それを保存します。
注：任意の（ 例えば 、0163562544）場合は、バーコード番号の最初の「0」を維持するために、「テキスト」ではない「番号」としてセルの書式を設定することを確認します。データの終わりを指定するには、末尾に "X、0000000000"を追加します。 - 自動液体ハンドラでデッキのフレームにネジLLS金属プレートはLLSを有効にします。
自動液体ハンドラー3.プログラミング
注：2つの方法が自動液体ハンドラー用のソフトウェアでプログラムされます：「ベースのカクテル」および3.1の「アクティベーションカクテル」）を作るためのa）の方法、および「マスターAntiboを作るためのb）の方法ベースのカクテル」と「3.2におけるアクティベーションカクテル」）（ 図1）」を組み合わせることにより、「DYカクテル。
- 「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」（ 図2）を作成するためのメソッドを作成します。
- 表 ：P50チップ（BASE_CT_P50と「ベースカクテル"のためのマイクロリットル中の抗体名（AB_NAME）、先管場所（WELL-BASEまたはWELL-ACT）、およびボリューム（VOL）のための情報を持っているスプレッドシートを作成、表計算ソフトを使用して、 3）またはP200のヒント（BASE_CT_P200： 表4）とP50チップ（ACT_CT_P50で「アクティベーションカクテル"： 表5）またはP200のヒント（ACT_CT_P200： 表6）。 CSVファイルとして保存します。 「WELL-BASE」と「WELL-ACT「位置については、 図3の番号を参照してください。
注：VOL =力価X（染色+ 2の＃）μlの。 表1の力価がたくさん固有のものです。オペレータは、報復を決定する必要があります各抗体のためのER他人14によって記載されているように。 - 「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」を作るための方法を作成するために、コンピュータに自動液体ハンドラー用のソフトウェアを起動するアイコンをクリックします。
注：以下の手順を3.1.3-3.1.7ラボウェアを定義します：2次元バーコード管（ 図4）を有する管ラックを。測定は、参照として提供されます。研究者らは決定し、各楽器のために調整する必要があります。 - 「プロジェクト」の下のツールバーで、「実験器具タイプ・エディター」を選択します。 「コピー」を選択し、96ウェル平板のオブジェクトを右クリックし、ポップアップウィンドウで「Matrix_OneML_TubeRack」と入力します。
- ダイアログボックスを開くには、オブジェクト「Matrix_OneML_TubeRack」をダブルクリックします。ハイライト「基本情報」は、「スパン」と「高さ」のための4.625センチメートルための12.775センチメートル（X）と8.546センチメートル（Y）を設定します。 （ 図4A）。
- 次に、ハイライト」MOVEM"その後。セットグリッパーは、0（Y）を0（X）をオフセット、および0.3（Z）、グリッパーは-0.1cmスクイズ、グリッパーUnsqueeze 2.6センチメートル、制限速度75％、およびチェック「ENT情報」グリッパーセンサーを使用します（ 図図4（b））。
- そして、「Well_1」を強調表示します。以下のように設定します。「まあオフセット」。 1.5センチメートル（X）および1.13センチメートル（Y）、「まあカウント」。 12（X）及び8（Y）、「まあ間隔」。 0.9（X）および0.9（Y）、「最大音量」。 1500μlを、フォーマット";レギュラー、「オフセットコラム2"; 0、および「デフォルトのボリューム"; 0（ 図4C）。
- 最後に、「まあ設定」（ 図4C）の右にある「編集...」ボタンを押してください。以下のようなポップアップウィンドウで、設定：「シェイプ」。ラウンド、「アッパー半径」。 0.37センチメートル、「低級半径」。 0.37 cmであり、「高さ」。 3.9センチメートル。 「底部分」と設定された「シェイプ」を確認してください。コーン、「半径」。 0.37 cmであり、「高さ」。 0.4センチメートル（ 図4D）。
注：マイクロチューブとチューブのラック：次の手順は3.1.8-3.1.11実験器具を定義します。測定は、参照として提供されます。研究者らは決定し、各楽器のために調整する必要があります。 - 「プロジェクト」の下のツールバーで、「実験器具タイプ・エディター」を選択します。 、24位のラックのオブジェクトを右クリックして「コピー」を選択し、「SmallTuberack_microfugetubes」と入力します。
- ダイアログボックスを開くには、オブジェクト「SmallTuberack_microfugetubes」をダブルクリックします。ハイライト「基本情報」は、「スパン」と「高さ」のための3.95センチメートルための12.75センチメートル（X）および8.5センチメートル（Y）を設定します。
- 次に、「Well_1」を強調表示します。以下のように設定します。「まあオフセット」。 1.621センチメートル（X）と1.181センチメートル（Y）、「まあカウント」。 6（X）と4（Y）、「まあ間隔」。 1.9（X）および1.9（Y）、「最大音量」。千μlを、フォーマット ";レギュラー、「オフセットコラム2"; 0、および「デフォルトのボリューム "; 0。
- 最後に、プレス「まあ設定」の右にある「編集...」ボタンをクリックします。以下のようなポップアップウィンドウで、設定：「シェイプ」。ラウンド、「アッパー半径」。 0.3345センチメートル、「低級半径」。 0.274 cmであり、「高さ」。 3.6728センチメートル。 「底部分」と設定された「シェイプ」を確認してください。半球、および「半径」。 0.1575センチメートル。
注：以下の手順は3.1.12-3.1.35」ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」（ 図2）を作るための「新規メソッド」をプログラムする方法を説明します。 - 「新規メソッド」アイコン、[開く]をクリックします。
- 新しい方法で「開始」と「終了」アイコン（ 図2）との間で「IF」のアイコンをドラッグします。 「IF」アイコンをクリックして強調表示します。条件のために次のように入力します。のCreateObject（ "World.EngineObject"）シミュレートします。
注：これはエラーチェックを行ってからソフトウェアを防止し、動作するように、この方法が有効になります。このステップがなければ、S3.1.20で説明）：バーコードはステップ」バーコードを読み取りVisionMate」の後にのみ使用可能です読み込むようoftwareは、データセットのために不足している情報に警告します。このステップは、ソフトウェアで検証ステップを無効にしているので、オペレータは、この方法を実行するためのデッキ上に十分なヒントや試薬があります確認する必要があります。 - 「その後」のアイコンと「IF」アイコン（ 図2）の下のアイコンを「終了」最初の間の「装置のセットアップ」アイコンを挿入します。
注：以下のすべての手順については、「エルス」アイコンと「IF」のアイコンの下の2番目の「終了」アイコン間のドラッグ・アイコンは、手順は、「エルス」にカプセル化されるように。 - この方法で「エルス」アイコン（ 図2）の下に、「装置のセットアップ」アイコンをドラッグします。
- ウィンドウを開くための方法で、「装置のセットアップ」アイコンをクリックします。 P50 LLSフィルタリングヒントのアイコンをドラッグしてlabwaresを設定し、P200 LLSフィルタリングヒント、P1アイコンリストから対応するデッキ位置に000のヒント、「Matrix_OneML_TubeRack "、2" SmallTuberack_microfugetubes」、及びリザーバ。
- 「AB_BOX "として" Matrix_OneML_TubeRack」と名のダイアログボックスを開きます。ベースカクテルとアクティベーションカクテルのための「ACT_CT」などの他のための「BASE_CT」（図5）のように「SmallTuberack_microfugetubes」のためのダイアログボックスを開き、名前1。
- 「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル"のためのマイクロチューブにリザーバからバッファを転送するためのステップを追加する方法（ 図2）に「転送」アイコンをドラッグします。 「アクティベーションカクテル "のための"ベースのカクテル "と= 25μlのX（2を染色＃）の転送容量= 25μlのX（2を染色＃）。
- 2次元バーコードリーダーの上に「Matrix_OneML_TubeRack」を移動するための手順を追加します。 （メソッドにFiが 「VisionMate移動」アイコンをドラッグしますグレ2）と甲板上のバーコードリーダーの位置に初期デッキ位置からの移動を指定します。
- 「VisionMateを：バーコード読み取り」にドラッグする方法（ 図2）にアイコンを。ダイアログボックスを開き、デバイスとして「VisionMate "を選択し、「BC_Read」として設定データに名前を付けます。
- 「ユーザーの一時停止」（ 図2）をドラッグして、「システム全体を一時停止し、このメッセージを表示する」と次のステップに進む前に、すべてのバーコードが読み取られることを確認するユーザーを思い出させるためにフィールドにコメントを入力]を選択します。
注：以下の手順3.1.22-3.1.26はよく場所やバーコード情報を用いて抗体名の間にリンクされます。これは、抗体名「AB」に基づいて、特定の抗体の場所を見つけるために、自動液体ハンドラを有効にします。 - 方法（ 図2）に「報告手順」のアイコンをドラッグします。
- テキストプログラムを使ってテキストファイルを作成し、それを保存コンピュータ上のドキュメントフォルダ内の「BC_Readout」など。
- 「レポートステップ」用のダイアログボックスを開き、レポートスタイルのための「テキストファイル」を選択し、ブラウジングを通じて「BC_Readout」ファイルを選択します。
注：3.1.16に設定され得られた「BC_Readout」ファイルは、バーコードの情報を含むヒントを除く甲板上のすべてのlabwaresの情報が含まれています2次元バーコードチューブと「Matrix_OneML_TubeRack」の井戸の位置については、読み取ります。 - バーコードとよく情報をリンクするための「データ・セットの作成」ステップを追加します。メソッドに「作成データセット」のアイコンをドラッグします（ 図2）、「ファイルから読み込み」を選択し、「AB_BC.csv」を選択し、ダイアログボックスを開くには、それをクリックします（2.4で作成した表2）、「カンマをチェック区切り記号付き」と「ファイル」は、ヘッダ行を持っています。
注：ファイルのプレビューウィンドウでは、抗体名前（AB）とバーコードが見られるべきである（BC）を読み出します。 - S IN、スタックの深さのための実験器具の場所と "0"のために「VM1」を選択し、3.1.25で「データ・セットの作成」」のサンプルIDを一致させる」を選択し、データと一致するフィールド「BC」を使用するための雨ダイアログボックス「BC_Read」に設定します。 「AB」と「データを作成する設定」の「BC」（ 図6）を選択します。
- 方法（ 図2）に「VisionMate移動」アイコンをドラッグして、バックデッキの初期デッキ位置にバーコードリーダの位置「VM1」からの移動を指定します。
注：以下の手順は3.1.28-3.1.33」ベースのカクテル」用の転写工程を定義します。 - 「ワークリスト」アイコン（ 図2）をドラッグして、3.1.1で作成したワークリストファイル"Base_CT_P50」（ 表3）を参照して選択します。 「ループ全体のワークリスト」を確認してください。
- 「ワークリスト」アイコンの下に直接「転送」アイコンをドラッグします（ 図2）。</李>
- 仕様・フィールドを開き、「転送」アイコンをクリックします。ちょうど1のプローブのを選択し、ヒントをフィルタリングP50のLLS、転送が行われたときに、「それらをアンロード」、および「転送間のヒントを変更する」にチェックを選択します。名前「AB_BOX "によってデッキで、「ソースを追加するには、ここをクリックしてください"をクリックして、ソースを追加実験器具として「Matrix_OneML_TubeRack」を選択し、選択した場所。
- 右クリックして「転送」のための指定フィールド、96ウエルの図の「ズームイン」で、すぐに「使用データセット」の後に「AB」を選択し、その値はと "= AB_NAME" "等しい"場所を選択。選択肢の転写技術を選択します。
注：LLSの使用は非常に底部付近に沈殿した破片を避けることをお勧めします。 - 「転送」、クリックして選択宛先の指定欄で「送信先を追加するには、ここをクリックしてください」、右にズームする]をクリックし、「SmallTuberack_を選択= VOL」、と名前で甲板上の場所「BASE_CT」実験機器、などのボリュームとして「microfugetubes」。ズームアウトした後、再び右クリックしてチェック「テキストとして選択の指定」をチェックし「発現を持つターゲットを指定しますが、下記の宛先デッキ位置のための変数として "とタイプ" = WELL_BASE "。
- その後P200 LLSフィルタリングのヒントを選ぶだけでなく、P200 LLSフィルタリングのヒントのための適切なピペット技術「Base_CT_P200を「csvファイルを選択することにより、P200のヒントと「ベースカクテル」、（ 表4）についても同様3.1.29-3.1.32を繰り返します。
注：以下の手順3.1.34および3.1.35「アクティベーションカクテル」用の転写工程を定義します。 - csvファイル"ACT_CT_P50」（ 表5）を選択し、送信先として「ACT_CT」を選択することにより、P50のヒントと「アクティベーションカクテル」についても同様3.1.29-3.1.32を繰り返します。右先をクリックし、「テキストとして選択を指定する」にチェック;。チェック "以下の式でターゲットを指定します」と先の位置のための変数として、「= WELL_ACT」と入力します。
- csvファイル"ACT_CT_P200」（ 表6）とP200 LLSフィルタリングのヒントを選択することにより、同様にP200のヒントと「アクティベーションカクテル」の3.1.34を繰り返します。
注：「ベースカクテル」および「活性化カクテル」を作製するための方法は、保存後に閉じることができます。
- 表 ：P50チップ（BASE_CT_P50と「ベースカクテル"のためのマイクロリットル中の抗体名（AB_NAME）、先管場所（WELL-BASEまたはWELL-ACT）、およびボリューム（VOL）のための情報を持っているスプレッドシートを作成、表計算ソフトを使用して、 3）またはP200のヒント（BASE_CT_P200： 表4）とP50チップ（ACT_CT_P50で「アクティベーションカクテル"： 表5）またはP200のヒント（ACT_CT_P200： 表6）。 CSVファイルとして保存します。 「WELL-BASE」と「WELL-ACT「位置については、 図3の番号を参照してください。
- 5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブ（ 図7）に「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」を組み合わせることにより、「マスター抗体カクテル」を作るための新しい方法を作成します。
注：5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブとチューブのラック：次の手順は、3.2.1-3.2.6実験器具を定義します。数字は参考のために提供されています。研究者らは決定し、楽器のために調整する必要があります。- 「プロジェクト」の下のツールバーで、「実験器具タイプ・エディター」を選択します。右のcl24位のラックのオブジェクトに嫌なは、「コピー」を選択し、ポップアップウィンドウで「BiocisionCoolRack_XT」と入力します。
- ダイアログボックスを開くには、オブジェクト「BiocisionCoolRack_XT」をダブルクリックします。
- ハイライト「基本情報」は、「スパン」と「高さ」のための7.93センチメートルための12.78センチメートル（X）および8.57センチメートル（Y）を設定します。
- 「Well_1」を強調表示します。以下のように設定します。「まあオフセット」。 1.55センチメートル（X）および1.33センチメートル（Y）、「まあカウント」。 6（X）と4（Y）、「まあ間隔」。 1.95（X）および1.97（Y）、「最大音量」。 2000μlで、フォーマット ";レギュラー、「オフセットコラム2"; 0、および「デフォルトのボリューム "; 0。
- 編集する「まあ設定」を開きます。 「シェイプ」;以下のように設定しますラウンド、「アッパー半径」。 0.5375センチメートル、「低級半径」。 0.48 cmであり、「高さ」。 7.07センチメートル。 「底部分」と設定された「シェイプ」を確認してください。半球、および「半径」。 0.45センチメートル。
注：次の手順3.2.6-3.2.7は、転送手順を定義し、ステップ3.2.14で使用されます。 - 次のヘッダーを有する抗体カクテルを作るためのcsvファイル"AB_MACT」（ 表7）を作成します。a）「SRC_BASE」。 「ベースのカクテル」、b）の「WELL_BASE」のための実験機器名。よく「ベースカクテル "のための実験機器内の場所は、c）の「VOL_BASE」。 μL、d）の「SRC_ACT」の「ベースカクテル "のための転送量。 「アクティベーションカクテル」、e）の「WELL_ACT」のための実験機器名。よく「アクティベーションカクテル」、f）は「VOL_ACT」のための実験機器内の場所。 μlの中で「アクティベーションカクテル」、g）の「DEST_MACT」のための転送量。 「マスター抗体カクテル "のデッキ位置情報、及びh）「WELL_MACT」。よく「マスター抗体カクテル」用のチューブラック内の情報を配置します。
- 以下のように（ 表7））3.2.6で作成したヘッダーの下に情報を記入します。a）「BASE_CT」を使用図3（a）に示すように、「WELL_BASE」のためのSRC_BASE下、b）はリストウェル位置情報、c）の抗体のリスト全体積（「VOL_BASE」の下で、単一の染色のためのすべてのベース抗体価）のバッファ+合計25μlの、D）を使用します図3B、抗体のF）リスト合計体積（「VOL_ACT」の下で、単一の染色のために、すべての活性化抗体価）のバッファ+合計25μlのに示すように、「WELL_BASE」のためのSRC_ACT、e）のリストも位置情報に基づく「ACT_CT」。転送T細胞FM3用バッファ25μlの。 図8に示すように、「WELL_MACT」の「DEST_MACT」の「SPL_TUBES_1」（3.2.10を参照）、およびh）リストウェル位置情報を使用してテスト1-3、g）について、表1を参照してください 。
注：以下の手順は3.2.8-3.2.15「マスター抗体カクテル」を作るための方法をプログラムします - 新しい方法（ 図7）を開きます。
- 「命令バイトをドラッグします新しいメソッドにument設定」アイコン（ 図7）。
- デッキダイアグラム上に「装置のセットアップ」P1000のヒントについては、ドラッグ・アイコン、2「SmallTuberack_microfugetubes」、および「BiocisionCoolRack_XT」の指定フィールドで。 3.1.17で指定されるように、それぞれ、「BASE_CT」と「ACT_CT」として2」SmallTuberack_microfugetubes」と名のダイアログボックスを開きます。 （ 図9）3.2.7で指定されているように、「SPL_TUBES_1」として「BiocisionCoolRack_XT」のためのダイアログボックスを開き、名前。
- 方法（ 図7）に「グループ」アイコンをドラッグして、新しい「グループ」を追加します。
- 「マスター抗体カクテル」（ 図7）を作るための「ベースのカクテルを「転送する「グループ」アイコンの下に直接「転送ファイルから"アイコンをドラッグします。
- 「ファイルからの転送 "の仕様フィールドで、使用中のP1000のヒントを選択し、S転送が行われたときに、「それらをアンロード」、および「転送間のヒントを変更する」にチェックを選びます。
- 「ファイルからの転送"の仕様フィールドで、ファイルを選択し、「AB_MACT」（ 表7）ブラウジングによって、チェック"ファイルは、ヘッダー行を持っています」。ソース実験器具でも情報源の実験器具の位置と「WELL_BASE」の「SRC_BASE」を選択し、先の実験器具と宛先実験器具ではよく情報については、「WELL_MACT」の「DEST_MACT」を選択し、ボリュームについては、「VOL_BASE」を選択します（図10）。 P1000のヒントのための適切な転写技術を選択しました。
注：LLSは、このプロセスのために必要ではないかもしれません。 - 「マスター抗体カクテル」を作るための「ベースカクテル」（ 図7 <と混合される、「アクティベーションカクテル」を転送するために「グループ」のすぐ下にドラッグして別の「ファイルからの転送」を追加/強いです>）。同様に3.2.13と3.2.14のように転写工程を設定します。例外は次のとおりです。a）のソース実験器具の位置、b）はソース実験器具ではよく情報については、「WELL_ACT」、およびc）ボリュームについては、「VOL_ACT」の「SRC_ACT」を選択します。
4.操作手順
- まず、コンピュータ上の2次元バーコードリーダーを起動するためのソフトウェアのアイコンをダブルクリックします。
- 次に、コンピュータに自動液体ハンドラを起動するためのソフトウェアのアイコンをダブルクリックします。
- 「インストゥルメント」の下で、自動液体ハンドラーのプライムシリンジに「ホームすべての軸」を選択します。すべての注射器は可視気泡を含んでいないことを確認してください。
注：「ホームすべての軸は「また楽器にその後の動きを作るための基準点を与えます。 - A用のソフトウェアで「ベースカクテル」と「アクティベーションカクテル」（ 図2）を製造するための方法を開きます。utomated液体ハンドラー。
- 「BASE_CT」と作られている「ベースカクテル」と「アクティベーションカクテル」の数に応じて「ACT_CT」の「SmallTuberack_microfugetubes」（ 図3）にマイクロチューブを置きます。そして、「装置のセットアップ」（ 図5）によると、デッキの上に置きます。
- 「装置のセットアップ」に従って、デッキに緩衝液で貯蔵器を置きます。
- 脱キャップ8チャンネルスクリューキャップデキャッパを用いて抗体を含む2次元バーコードチューブ。交差汚染を避けるために、キャップ保持トレイ上の正確な順序でキャップをしてください。 「装置のセットアップ」（ 図5）によると、デッキの「Matrix_OneML_TubeRack」を配置します。
- 「装置のセットアップ」（ 図5）によると、デッキの上に置いてP50のLLSフィルタリングヒント、P200 LLSフィルタリングヒント、およびP1000のヒント。
- グリーントライをクリックして、メソッドを起動します。角状のスタートアイコン。ポップアップウィンドウが表示ように、この方法で定義された甲板上のすべての項目が「装置のセットアップ」に一致していることを確認します。これはポッドおよび/またはグリッパーをつぶす可能性があるので、デッキの「装置のセットアップ」に記載されていない物を置かないでください。続行するには「OK」を押します。
- 「Matrix_OneML_TubeRackが「2Dバーコードリーダー上に移動され、バーコードが読み取られた後、別のポップアップウィンドウは、すべてのバーコードを読み取るかどうかを尋ねます。確認したら「OK」を押すと進みます。
- 自動液体ハンドラーによる転送が完了すると、8チャンネルのスクリューキャップデキャッパを使用して、2次元バーコードのチューブをおさらいし、バック4°Cにそれらを置きます。
- 渦すべてのマイクロチューブを激しく20秒間、およびチューブのラックにそれらを返します。
注意：不十分なボルテックスは、細胞の次善の染色をもたらす可能性があります。 - 「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」を作るための方法を閉じます。そして、「マスター抗体カクテル」を作るための方法を開きます。
- 「BiocisionCoolRack_XT」（ 図8）で予め標識5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブを設定し、デッキの上に置きます。ラベルは、どのような "ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」混合されるだけでなく、適切な患者IDを示す必要があります。
- 「ベースのカクテル」、「アクティベーションカクテル」、およびデッキのP1000のヒントのための場所チューブラック（ 図9）。方法（ 図7）を起動します。ポップアップウィンドウの指示に従い、必ずこの方法でデッキ一致インストゥルメンタルセットアップ上の項目（ 図9）ことを確認してください。続行するには「OK」を押します。
- 上記のプロセスが完了したら、手動で抗体カクテルを含む各5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブに血液検体の50μlを添加します。
- クラスII生物学的安全キャビネット内の渦のサンプル管とは、暗所で室温で15分間インキュベートします。タークこれは矛盾した染色になりますように、チューブの側面に血液をストリーキング回避する電子ケア。慎重に流れ、洗浄緩衝液で湿らせた綿棒によって血液の任意のスジを除去します。
- RBC溶解緩衝液1mlを手動で追加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。
- 400×gで5分間のフロー洗浄緩衝液（0.1％アジ化ナトリウム、1％BSA、1×HBSS中で10 U / mlのヘパリン）及び遠心分離機を2mlを加えます。クラスII生物学的安全キャビネット内上清を捨てます。この洗浄工程を繰り返します。再懸濁フローの洗浄緩衝液0.5ミリリットルで染色された細胞。
- 設定することをフローサイトメーターは、小麦粉レーザと適切なフィルター、および5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブを使用して実行標本が装備されています。データ収集12,15のための標準的なサイトメーターのキャリブレーションおよび蛍光補正方法を使用します。 表1に「フルオロフォア」に記載されているすべてのパラメータを収集します。
注：適切な制御材料は、適切なお尻を確保するために、各実行で使用する必要がありますAYパフォーマンス。 - サンプルを実行した後、エクスポートがFCSファイルとしてデータを取得しました。
- 適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。ヒト免疫プロジェクト1で概説ゲート戦略を使用して、T細胞サブセットを識別します。
Representative Results
全血免疫表現の目的は、定量（免疫細胞サブセットの描写）と免疫細胞の定性的（活性化状態の検出）情報を得ることです。我々は少し私たちの方法（ 表1）の全体的なパフォーマンスを改善するために、ヒト免疫プロジェクト 1によって提案されたT細胞免疫表現パネルを変更しました。我々のT細胞パネルはナイーブ、セントラル記憶（CM）、エフェクター記憶（EM）、及びエフェクターT細胞を同定することを目的とします。簡単に言えば、我々はFCS-AとFCS-Hに基づくダブレットを判別します。側方散乱およびCD45のレベルに基づいて、リンパ球上のその後、我々はゲート。 T細胞は、その後、CD3の発現により同定されます。 CD3 + T細胞は、γδT細胞とαβT細胞に分化されます。 αβT細胞は、さらに、CD4 +およびCD8 + T細胞に分けられます。 CD4 +およびCD8 + T細胞は次にexpressioに基づいてサブセットを分析しますCD45RAおよびCCR7のN： - CCR7 + CM、CD45RA + CCR7 +ナイーブ、CD45RA + CCR7 - CD45RAエフェクター、及びCD45RA - CCR7 - EM T細胞1。さらに、我々はまた、定性的な情報を得るために、このようなCD38、HLA-DR、ICOS、PD-1、GITR、4-1BB、CD69、NKG2D、およびOX40などの活性化マーカーの発現をモニターします。
この方法の精度を実証するために、我々は、一日に4人の健康なドナーからの5回、末梢全血試料を染色した。 図11は、ゲート制御リンパ球および分散率（％CV）のパーセント係数の割合のT細胞亜集団との関係を示す図 。ゲートされたリンパ球および％にパーセントのT細胞亜集団の詳細な内訳各サブセットのためのCV を表8に示されている。データテスト2および3からは、簡単にするため、図11 および表8に含まれていません。 25％未満のCVラン（アッセイ間の精度）との間で研究用途10のための表現型バイオマーカーアッセイのための受け入れ基準のために示唆されています。すべての測定は、ICOS +γδT細胞（26.64から46.39パーセント。 表8）、ICOS + CD8 T細胞（14.64から58.39パーセント。 表8）を除いて、この基準を満たしていました。これらの値は、デモンストレーション目的のために示されています。 ICOSは、主にCD4 T細胞16の活性化に重要な役割を果たしているので、我々はこれらの測定値を利用しません。総人口に対する低い割合を含んで集団におけるより高い％CVの傾向は、他の7で観察しました。ケースでは研究者は稀な事象を監視することに興味がある、細胞の数は、より不正確17を克服するために増加させる必要性を検討しました。一緒に、我々のデータは、全血免疫表現のサンプル調製における自動化の導入を成功を示します。
< imgのalt = "図1" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 53485 / 53485fig1.jpg" />
末梢全血と免疫表現については、図1のワークフロー。免疫表現アッセイのステップワークフローによってステップ。示されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」を作製するための方法の概要。」ベースのカクテル」と自動液体ハンドラーのためのソフトウェアで、「アクティベーションカクテル」を製造するための方法におけるステップが示されている。 表示するには、こちらをクリックしてください。この図の拡大版。
E 3 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 53485 / 53485fig3.jpg "/>
BACE_CTとACT_CTとチューブラック図3.レイアウト。（A）チューブラック「BACE_CT」のレイアウトを示しています。 （B）チューブラック"ACT_CT"のレイアウトを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. 2次元バーコード管と管ラック用の実験器具の定義。2次元バーコードチューブとチューブのラックを定義するステッププロセスによってステップ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
485fig5.jpg "/>
「ベースのカクテル」と「アクティベーションカクテル」を作製するための方法については、図 5 インストゥルメントの設定。これは、「ベースカクテル」と「アクティベーションカクテル」を製造するための方法のためのデッキレイアウトを示している。 このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。
「データ・セットを作成する」ための 図6. セットアップが。それは、「作成データセット」の詳細な設定を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Figu 「マスター抗体カクテルを"作るための方法の7.概要再。自動液体処理用のソフトウェアで、「マスター抗体カクテル」を製造するための方法におけるステップが示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブとチューブのラックの 図8. レイアウト。それは、チューブラック「SPL_TUBES_1」のレイアウトを示しています。 FM3は、蛍光マイナス3（鮮やかな紫421、フィコエリトリン、およびアロフィコシアニン）を意味する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ftp_upload / 53485 / 53485fig9.jpg "/>
図9.「 マスター抗体カクテルを"製造するための方法のための機器のセットアップは。それは、「マスター抗体カクテルを"製造するための方法のためのデッキレイアウトを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
「ファイルからの転送」10.セットアップ図 。それは、「ファイルからの転送」の詳細な設定を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図11.ローバリ半自動化された全血免疫表現で能力。4人の健康なドナーから分析したすべての細胞集団のシングルCV値は青白丸として示されています。回帰曲線は青色の線で示されています。レッドラインは95％自信を持ってバンドを示し、貪欲点線は95％予測バンドを示す。点在この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図12次善の染色。染色の例は 、「BACE_CT」および「ACT_CT」からマイクロチューブの適切なまたは不適切なボルテックスを用いて行きました。 B内の2つのゲートされた集団があります。弱いCD45染色でマイナーな人口は、最適な染色を得ることはありません細胞を表します。g12large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| グループ | マーカー | フルオロフォア | クローン | TITER（μL/染色） | |
| BASEカクテル | TCELL | CD45 | FITC | 2D1 | 0.4 |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 1 | ||
| CD8 | APC-H7 | SK1 | 0.4 | ||
| CD4 | PerCPを-CY5.5 | SK3 | 2 | ||
| CCR7 | PE-CF594 | 150503 | 1 | ||
| CD45RA | PE-Cy7の | L48 | 1 | ||
| TCRab | BV786 </ TD> | T10B9.1A-31 | 1 | ||
| TCRgd | BV650 | B1 | 5 | ||
| アクティベーションCOCKTAIL-1 | TEST1 | HLA-DR | BV421 | G46-6 | 5 |
| CD278（ICOS） | PE | DX29 | 5 | ||
| CD38 | APC | HB7 | 1 | ||
| アクティベーションCOCKTAIL-2 | TEST2 | CD279（PD1） | BV421 | EH12.1 | 2.5 |
| CD357（GITR） | PE | eBioAITR | 5 | ||
| CD137（41BB） | APC | 4B4-1 | 10 | ||
| アクティベーションCOCKTAIL-3 | TEST3 | CD69 | BV421 | FN50 | 1 </ TD> |
| CD314（NKG2D） | PE | 1D11 | 2 | ||
| CD134（OX40） | APC | ACT35 | 5 |
表1. 変更されたT細胞パネルに対する抗体リスト。
| AB | 紀元前 |
| CD45_FITC | 0163562388 |
| CD3_Alexa700 | 0163562110 |
| CD4_PerCP_CY5.5 | 0163562364 |
| CD8_APC-H7 | 0163562363 |
| CCR7_PE-CF594 | 0163562387 |
| CD45RA_PE-Cy7の | 0163562091 |
| TCRab_BV786 | 0163562069 |
| TCRgd_BV650 | 0163562108 |
| 0163562339 | |
| A_CD278（ICOS）_PE | 0163562082 |
| A_CD38_APC | 0163562317 |
| A_CD279（PD1）_BV421 | 0163562340 |
| A_CD357（GITR）_PE | 0163562093 |
| A_CD137（41BB）_APC | 0163562315 |
| A_CD69_BV421 | 0163562341 |
| A_CD314（NKG2D）_PE | 0163562314 |
| A_CD134（OX40）_APC | 0163562316 |
2次元バーコード番号と、表2の抗体名。
| グループ | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCELL | 1 | 7.2 | |
| TCELL | 1 | CD45_FITC | 7.2 |
| TCELL | 1 | CD3_Alexa700 | 18 |
| TCELL | 1 | CCR7_PE-CF594 | 18 |
| TCELL | 1 | CD45RA_PE-Cy7の | 18 |
| TCELL | 1 | TCRab_BV786 | 18 |
表3.ファイル "BASE_CT_P50」：抗体名前とボリューム情報。
| グループ | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCELL 1 | CD4_PerCP_CY5.5 | 36 | |
| TCELL | 1 | TCRgd_BV650 | 90 |
表4. ファイル"BASE_CT_P200」：抗体名前とボリューム情報。
| グループ | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST1 | 7 | A_HLA-DR_BV421 | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD278（ICOS）_PE | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD38_APC | 6 |
| TEST2 | 13 | A_CD279（PD1）_BV421 | 15 |
| TEST2 | 13 | A_CD357（GITR）_PE | 30 |
| TEST3 | 19 | A_CD314（NKG2D）_PE | 12 |
| TEST3 | 19 | A_CD69_BV421 | 6 |
| TEST3 | 19 | A_CD134（OX40）_APC | 30 |
表5. ファイル「ACT_ CT_P50」：抗体名前とボリューム情報。
| グループ | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST2 | 13 | A_CD137（41BB）_APC | 60 |
表6. ファイル「ACT_CT _P200」：抗体名前とボリューム情報。
| ドナー＃ | SRC_ ベース | BASEカクテル | WELL_ ベース | VOL_ ベース | SRC_ACT | アクティベー VATION カクテル | WELL_ 法 | VOL_ACT | DEST_MACT | WELL_ MACT | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 1 | ||
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 7 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 13 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 19 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 2 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 8 | ||
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 14 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 20 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 3 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 9 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 15 |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 21 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 4 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 10 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 16 | ||
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 22 | |
表7. ファイル「AB_MACT "：" マスター抗体カクテル」のソースと宛先情報。
| 図中の人口＃。 1 | 私 | 二 | 三 | 4 | V | |
| 人口名 | CD3 + | AB T細胞 | GD T細胞 | CD3 + CD4 + | CD3 + CD8 + | |
| リンパ球の％</ TD> | Heathlyドナー＃1 | 79.80 | 75.20 | 2.70 | 49.60 | 22.30 |
| Heathlyドナー＃2 | 69.40 | 61.90 | 5.85 | 44.40 | 16.20 | |
| Heathlyドナー＃3 | 75.80 | 69.60 | 4.75 | 42.00 | 23.50 | |
| Heathlyドナー＃4 | 77.20 | 73.50 | 1.98 | 52.70 | 18.90 | |
| ％履歴書 | Heathlyドナー＃1 | 1.42 | 1.58 | 3.70 | 2.50 | 1.56 |
| Heathlyドナー＃2 | 2.48 | 2.39 | 5.74 | 2.82 | 2.41 | |
| Heathlyドナー＃3 | 1.15 | 1.40 | 6.32 | 1.42 | 2.72 | |
| Heathlyドナー＃4 | 0.81 | 0.94 | 5.45 | 1.20 | 1.44 | |
| 平均 | 1.47 | 1.58 | 5.30 | 1.99 | 2.03 | |
| 標準偏差 | 0.72 | 0.61 | 1.13 | 0.79 | 0.63 |
試験2および3のデータは、データの提示を簡単にするために、図5および表 8に示されていないことが図4ノートにプロットし、各サブセットのためのリンパ球および％CV％の表8. RAWデータ 。
Discussion
末梢血の免疫表現は、免疫療法に個々の応答への洞察を得るために非常に重要です。課題は、実験間変動1,14を制御するためのアッセイの標準化です。変動の一つの主な情報源は、サンプルの人為的操作です。したがって、サンプル処理の部分的または完全な自動化は、実験対実験変動1,14の劇的な減少を容易にすることが考えられます。このプロトコルでは、全血免疫表現のサンプルの染色のための2次元バーコードリーダーを装備した自動液体ハンドラーを導入することによって、アッセイの変動性を最小化するために我々の成功した取り組みを報告します。
設計では、我々の方法は、汎用性があり、それらを定義するために追加の「ベースカクテル」を追加することにより、他の免疫サブセットを監視することができます。このようなサブセットは、ヘルパーT細胞、制御性T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、および単球（原稿内を含みます準備）18。私たちは1追加のマーカーを導入することにより、コンソーシアムの推奨抗体のパネルを適応しました。我々は、誘導性抗原の検出のためにこれらのチャネルを予約したいような細胞集団は、ブリリアントバイオレット421（BV421）に最小限の発光と蛍光色素にコンジュゲート」ベースカクテル」、フィコエリトリン（PE）、およびアロフィコシアニン（APC）検出器を用いて同定しました。この機能は、免疫細胞の活性化状態を監視するための最高の感度を確保だけでなく、これらの3の蛍光色素が最も頻繁に誘導マーカーに対する抗体とコンジュゲートされているように、新しい活性化マーカーの柔軟なご宿泊を可能にするだけでなく。したがって、我々の方法だけでなく、全血免疫表現のためのカクテルを調製するのに適しているだけでなく、細分化組織 （例えば、腫瘍）から回収された末梢血単核球細胞を含む他のサンプルを染色するのに有用です。
成功イントロ本手法のductionは、実験器具の準備、およびプログラミングやメソッドの実行の手順に特別な注意が必要です。 2次元バーコード管の調製は、人間が読み取り可能なラベルと指定されたチューブへの抗体の転送での標識を含んでいます。エラーの発生を防止するために、我々は2人でこれを行うことをお勧めします。スプレッドシートを変更するたびに、研究者らは、この方法が正しく動作するかどうかを確認する必要があります。プログラミング時に適切なピペット操作方法を選択すると、成功した液体移送を保証します。 LLSは、我々はP50やP200導電チップのいずれかを使用するための抗体、チューブの底から沈殿した破片を得ることなくピペット操作を可能にします。 LLSは、P1000のヒントと、より敏感であり、時には誤って気泡の存在によって誘発されるようLLSは、P1000のヒントのための良い選択肢ではないかもしれません。次善の液体移動が発生する可能性として先端の縁との間に十分なスペースがない場合ラボウェア定義の高さは、例えば、各機器のために調整されるべきですチューブの底。 図12に示すように、「ベースカクテル」および/ または「活性化カクテル」が十分にボルテックスしていない場合、それは次善の染色をもたらすことができます。
私たちは19を試薬分注に関連する変動を低減するための別のアプローチとして、細胞染色のために、凍結乾燥試薬を用いて考えました。しかし、鮮やかな紫色色素のポリマー複合体は、非特異的シグナルを引き起こす相互作用することが知られています。このように、凍結乾燥試薬で二つ以上のポリマー複合体（ 例えば、BV421とBV650 など）は 、非特異的シグナル伝達を引き起こす可能性がある追加（ 例えば、BV421 +集団内のBV650のバックグラウンドシグナルの増加）20。また、凍結乾燥試薬は、新たな染色を含むための柔軟性を欠いています。彼らは通常、より高価であり、大量注文が必要です。これらの理由から、我々は、2次元バーコード管を装備した自動液体ハンドラーを使用することにしました。それトンが、akes時間を設定し、そのような要因は、生産性の向上およびアッセイの再現性によって補償されます長期的には、楽器を購入するために先行投資を必要とします。実際には、いくつかのグループは、以前に免疫表現または類似のアプリケーション21,22の彼らのワークフローに自動液体ハンドラー統合の成功を報告しました。フローサイトメトリー分析のための自動化ソリューションは、商業的供給源（FACS SPA III、自動化されたカクテルの準備ワークステーション、およびFlowStainer）から入手可能です。これは、さらに免疫表現のための自動化されたカクテルの準備のための大きい必要性があることを示します。
この技術を習得した後、我々は完全に自動化された全血免疫表現の開発はさらに実験間の変動を減少させ、さらには23を設定する多施設臨床試験における全血免疫表現が可能になるかもしれないことを想定しています。我々はすでに溶解した使用し始めています溶解および洗浄工程を自動化するための時間助手。また、2次元バーコード管における抗体の量と試薬の分注の追跡の自動化された決意が大きく、それぞれ、抗体の在庫と私たちの方法に比べて品質管理を向上させることを想定しています。
Disclosures
YK、ILG、TLM、WLM、DPH、およびKSB：いいえ競合する金融利害。 ANTは、このビデオ記事のベックマン・コールター社出版の従業員は、ベックマン・コールター社が主催しているされています
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 ml Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12 x 24 INCHES RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 ml Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1,025 µl | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µl (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10x Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1x, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
References
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
