Abstract
Immunfenotypning av perifert blod genom flöde bestämmer cytometry förändringar i frekvens och aktiveringsstatus av perifera leukocyter under sjukdom och behandling. Den har potential att förutsäga terapeutisk effektivitet och identifiera nya terapeutiska mål. Helblod färgning använder omanipulerat blod, vilket minimerar artefakter som kan uppstå under provberedning. Emellertid måste helblod färgning också göras på nyligen uppsamlat blod för att säkerställa integriteten av provet. Dessutom är det bäst att förbereda cocktails antikropp på samma dag för att undvika potentiell instabilitet tandem-färgämnen och förhindra reagens interaktion mellan lysande violett färgämnen. Därför kräver helblod färgning noggrann standardisering att kontrollera för inom och mellan experimentell variabilitet.
Här rapporterar vi utplacering av en automatiserad vätskehanterare utrustad med en två-dimensionell (2D) streckkodsläsare in i en standardprocess för framställning av Antibody cocktails för flödescytometri. Antikroppar överfördes till 2D streckkodade rör anordnade i en 96-brunnsformat och deras innehåll samlas i en databas. Den flytande hanterare kan sedan lokalisera flaskor källantikropps genom att referera namn antikropps i databasen. Vår metod elimineras tråkiga samordning för placering av rör källa antikroppar. Det gav mångsidighet tillåter användaren att enkelt ändra valfritt antal detaljer i antikroppsfördelningsprocessen såsom specifik antikropp att använda, volym och destination genom att modifiera databasen utan att skriva skript i mjukvarumetod för varje analys.
Ett bevis på konceptet experiment uppnått enastående bland och intra- analysprecision, visat genom upprepad framställning av en 11-färg, 17-antikropp flödescytometri analys. Dessa metoder ökat genomströmning för flödescytometri analyser och underlättas daglig framställning av komplexa drinkar antikropps krävs för detaljerad Fenoltypic karakterisering av nytaget antikoagulerat perifert blod.
Introduction
Immunfenotypning av humant perifert blod bestämmer kvantitativa och kvalitativa förändringar i immuncellundergrupper 1. Det ger en inblick i verkningsmekanismer och motstånd, hjälpmedel upptäckten av prediktiva biomarkörer, och underlättar utvecklingen av kombiimmunterapier. Därför är validering och standardisering av immunfenotypning ett område av stort intresse för akademiska forskare, kliniska laboratorier och industrier.
Även immunfenotypning av perifert blod genom flödescytometriska metoder används för närvarande för klinisk behandling av hematologiska maligniteter 2,3 och humant immunbristvirus (HIV) infektion 4,5, tillförlitlig immunfenotypning av perifert blod för immunterapi kräver särskilda överväganden vid validering och standardisering, eftersom det kräver mer omfattande täckning över immuncellundergrupper och aktiverings / hämmande receptorer 1,6-8. Succéssful immunfenotypning kräver noggrann standardisering för att minimera experiment till experiment variationen i samband med instrument inställning och cellfärgningsproceduren 9,10. Medan standardisering av instrumentinställningar för flödescytometri är väl etablerad att ta itu med tidigare oro 9,11,12, är det fortfarande oklart hur man minimera variabiliteten i samband med cellfärgning utan att begränsa omfattningen av immuncellundergrupper och deras aktiveringsstatus.
Eftersom antalet antigener som skall detekteras ökar, ökar också möjligheten för fel och variationer på grund av suboptimal reagensdispensering och korskontaminering. Metoder för phenoptypic analys av antikoagulerat helblod fastställdes i slutet av 1980-talet för användning i kliniska laboratorieanalyser. Samma metoder tillgodose behoven hos forskningslaboratorium för provberedning. Viktigare, drinkar antikropp som används i det kliniska laboratoriet är typiskt mindre komplexa och available pre-titrerades och förblandas från tillverkaren. Endast en enda överföring av den förblandade antikroppscocktail krävs. I inställningen forskning, antikropps cocktails av 10-16-antikroppar är typiska. Varje cocktail måste valideras för stabilitet av laboratoriet eller beredda färska före varje analys. Förbereda flera drinkar antikropps för ett prov kan medföra pipettering av 50-80 individuella antikroppar, en uppgift som är både tråkiga och felbenägen.
Automatisering av cocktail förberedelse har flera fördelar jämfört med manuell cocktail beredning, såsom färre fel, ökad noggrannhet pipettering, och kanske till och med minskad reagens slöseri. Här rapporterar vi det framgångsrika införandet av ett automatiserat vätske hanterare utrustad med en tvådimensionell (2D) streckkodsläsare i cellfärgningsprocessen av immunfenotypning att minimera variabiliteten i samband med provberedning.
Protocol
Insamling och användning av perifert blod i detta protokoll godkändes av Providence Health & Services Institutional Review Board. Alla försökspersoner under förutsättning att deras skriftligt informerat samtycke.
Obs: Följ allmänna försiktighetsåtgärder. Allt blod bör behandlas som om smittsamt och hanteras i enlighet med biosäkerhetsnivå 2 metoder.
Anmärkning: immunfenotypning med perifert helblod utförs genom inkubering antikoagulerat helblod med fluorescerande-taggade monoklonala antikroppar för att detektera cellyteantigener, följt av hypotonisk lys för att avlägsna röda blodkroppar. Cellerna tvättas och provet analyseras genom en flödescytometer. Den metod som beskrivs häri fokuserar på framställning av cocktails antikropp med användning av automatiserade vätskehanterare utrustad med en 2D streckkodsläsare. För det första "Base Cocktail" som identifierar immuncellundergrupper och "Activation Cocktail" som övervakar inducible antigener framställes separat (Tabell 1). Då båda cocktails blandas för att skapa en "master Antibody Cocktail". Se figur 1 för arbetsflödet.
1. Prov
- Samla perifert blod via venpunktion i en natriumheparin antikoagulerat bloduppsamlingsrör, vänd försiktigt flera gånger för att säkerställa korrekt blandning, och håll sedan vid RT. Avvisa prov om koagulerat eller hemolyserat 13.
2. Labware Framställning
- Etikett 2D streckkod rör med mänskligt läsbar etiketter (antikropp namn, vender, katalognummer och satsnummer).
- Överför hela innehållet i flaskor antikropps från vender (anges i tabell 1) till motsvarande 2D streck rör.
Obs: Var mycket försiktig att inte införa bubblor bubblor felaktigt utlöser avkänning vätskenivå (LLS) som resulterar i suboptimal överföring av reagens.
Obs: Se till att varje antikropp VIal har tillräcklig antikropp för körningen. - Läsa 2D-streckkoder för varje rör av 2D streckkodsläsaren.
- Gör ett kalkylblad som innehåller antikropps namn (AB) och streckkod läser (BC) med hjälp av ett kalkylprogram och spara den i en kommaseparerade värden (csv) fil som "AB_BC.csv" (tabell 2).
Obs: Se till att formatera celler som "text" inte "Number" för att hålla den första "0" för streckkodsnummer om någon (t.ex. 0163562544). Lägg till "x, 0000000000" i slutet för att ange slutet av data. - Skruv LLS metallplattor till ramen av däcket i den automatiserade vätske hander att möjliggöra LLS.
3. Programmering för Automated Liquid Handler
Obs: Två metoder kommer att programmeras i mjukvaran för automatisk flytande hanterare: a) En metod för framställning av "Base Cocktail" och "Activation Cocktail" i 3,1), och b) ett förfarande för framställning av "master Antibody Cocktail "genom att kombinera" Base Cocktail "och" Activation Cocktail "i 3,2) (Figur 1).
- Skapa en metod för framställning av den "Base Cocktail" och "Activa Cocktail" (figur 2).
- Med hjälp av kalkylprogram, gör ett kalkylblad som har information om namn antikropps (AB_NAME), destination rör plats (VÄL BASE eller VÄL ACT) och volym (VOL) i il för "Base Cocktail" med P50 tips (BASE_CT_P50: Table 3) eller P200 spetsar (BASE_CT_P200: Tabell 4) och "Activa Cocktail" med P50 spetsar (ACT_CT_P50: Tabell 5) eller P200 spetsar (ACT_CT_P200: Tabell 6). Spara dem som CSV-filer. För "VÄL BASE" och "VÄL-ACT" location, hänvisar till siffror i figur 3.
Obs: VOL = titer x (# av färgning + 2) l. Titrar i tabell 1 är mycket specifika. Operatör bör fastställa en titer för varje antikropp som beskrivs av andra 14. - Klicka på en ikon för att starta programmet för automatisk vätske hanterare på datorn för att skapa en metod för att göra "Base Cocktail" och "Activation Cocktail".
Obs: Följande steg 3.1.3-3.1.7 kommer att definiera laboratorie: röret rack med 2D streckkoder rör (Figur 4). Mätningar tillhandahålls som en referens. Utredarna ska bestämma och justera för varje instrument. - I verktygsfältet under "Project", välj "Labware Type Editor". Högerklicka på ett objekt för en 96 brunnar platta, välj "Copy" och skriv "Matrix_OneML_TubeRack" i ett popup-fönster.
- Dubbelklicka på objektet "Matrix_OneML_TubeRack" för att öppna dialogrutan. Markera "Grundläggande information", ställ 12.775 cm (X) och 8.546 cm (Y) för "Span" och 4,625 cm för "höjd". (Figur 4A).
- Nästa, markera "Movement information ". Ställ Gripper offset 0 (X), 0 (Y), och 0,3 (Z), Gripper Squeeze -0.1cm, Gripper Unsqueeze 2,6 cm, hastighetsgräns 75%, och sedan kontrollera" Använd grip sensor "(Figur 4B).
- Därefter markerar "Well_1". Enligt följande: "Well Offset"; 1,5 cm (X) och 1,13 cm (Y), "Well Count"; 12 (X) och 8 (Y), "Well Mellanrum"; 0,9 (X) och 0,9 (Y), "Maximal volym"; 1500 pl, Format ", Regular," Colum 2 Offset ", 0, och" Default Volume "; 0 (Figur 4C).
- Slutligen, tryck ett "Edit ..." knappen till höger om "Well Configuration" (Figur 4C). I ett popup-fönster, enligt följande: "Shape"; Runda, "Övre Radius"; 0.37 cm, "Lägre Radius"; 0.37 cm och "Höjd"; 3,9 cm. Kontrollera "nedre delen" och ställ in "Shape"; Kon, "Radius"; 0.37 cm och "Höjd"; 0,4 cm (Figur 4D).
Obs: Följande steg 3.1.8-3.1.11 definierar laboratorie: röret rack med mikrofugrör. Mätningar tillhandahålls som en referens. Utredarna ska bestämma och justera för varje instrument. - I verktygsfältet under "Project", välj "Labware Type Editor". Högerklicka på ett objekt för en 24-ställning rack, välj "Copy" och typ "SmallTuberack_microfugetubes".
- Dubbelklicka på objektet "SmallTuberack_microfugetubes" för att öppna dialogrutan. Markera "Grundläggande information", ställ in 12.75 cm (X) och 8,5 cm (Y) för "Span" och 3,95 cm för "höjd".
- Därefter markera "Well_1". Enligt följande: "Well Offset"; 1.621 cm (X) och 1.181 cm (Y), "Well Count"; 6 (X) och 4 (Y), "Well Mellanrum"; 1,9 (X) och 1,9 (Y), "Maximal volym"; 1000 pl, Format ", Regular," Colum 2 Offset ", 0, och" Default Volume "; 0.
- Slutligen, trycken "Redigera ..." knappen till höger om "Well Configuration". I ett popup-fönster, enligt följande: "Shape"; Runda, "Övre Radius"; 0.3345 cm, "Lägre Radius"; 0,274 cm, och "Höjd"; 3.6728 cm. Kontrollera "nedre delen" och ställ in "Shape"; Halvklotet, och "Radius"; 0.1575 cm.
Obs: Följande steg 3.1.12-3.1.35 kommer att förklara hur man programmerar "nya metoden" för att göra "Base Cocktail" och "Activation Cocktail" (Figur 2). - Klicka på "nya metoden" -ikonen och öppet.
- Dra en "OM" ikonen mellan en "Start" och "Finish" -ikonen i den nya metoden (Figur 2). Klicka och markera "OM" -ikonen. Skriv följande för villkor. Create ( "World.EngineObject") simulera
Obs: Detta kommer att förhindra programmet från att utföra felkontroll och aktivera den här metoden ska fungera. Utan detta steg software varnar saknas information dataset som streckkod läser är endast tillgängliga efter steget "VisionMate: Läs streckkoder" som beskrivs i 3.1.20). Eftersom detta steg inaktiverar verifieringssteget i programmet, måste operatören bekräfta det finns tillräckligt med tips och reagens på däck för att utföra denna metod. - Sätt en "Instrumentinställningar" -ikonen mellan "Då" -ikonen och den första ikonen "End" under "OM" -ikonen (Figur 2).
Obs: För alla följande steg, dra ikoner mellan "Else" ikonen och andra "End" ikonen under "OM" ikon så att åtgärder är inkapslade i "Else". - Dra "Instrumentinställningar" -ikonen under "Else" -ikonen i metoden (Figur 2).
- Klicka på "Instrumentinställningar" -ikonen i metoden för att öppna fönstret. Konfigurera labwares genom att dra ikoner för P50 LLS filtrerade tips, P200 LLS filtrerade tips, P1000 tips, "Matrix_OneML_TubeRack", två "SmallTuberack_microfugetubes", och reservoar med motsvarande däck plats från ikonlistan.
- Öppna dialogrutan för "Matrix_OneML_TubeRack" och namn som "AB_BOX". Öppna dialogrutan för "SmallTuberack_microfugetubes" och namnge en som "BASE_CT" för Base Cocktails och den andra som "ACT_CT" för aktivering Cocktails (Figur 5).
- Dra en "Transfer" ikonen till metoden (Figur 2) för att lägga till ett steg för överföring av buffert från reservoaren in mikrofugrör för "Base Cocktail" och "Activation Cocktail". Överföringsvolym = 25 pl x (# av färgning 2) för "Base Cocktail" och = 25 ul x (# av färgning 2) för "Activation Cocktail".
- Lägg steg för att flytta "Matrix_OneML_TubeRack" på 2D streckkodsläsaren. Dra en "VisionMate Move" ikonen till metoden (Figur 2) och ange övergången från den ursprungliga däck ståndpunkt streckkodsläsaren position på däck.
- Dra en "VisionMate: Läs streckkoder" ikonen till metoden (Figur 2). Öppna dialogrutan och välj "VisionMate" som enhet och namnge datamängden som "BC_Read".
- Dra en "User Pause" (Figur 2), välj "Pause hela systemet och visar meddelandet" och skriv en kommentar i fältet för att påminna användare att bekräfta att alla streckkoder läses innan du fortsätter med nästa steg.
Obs: Följande steg 3.1.22-3.1.26 kommer att länka mellan såväl platser och namn antikropp med användning av streckkodsinformationen. Detta kommer att göra det möjligt för den automatiserade vätskehanterare för att hitta en plats för den speciella antikroppen baserad på antikroppen namnet "AB". - Dra en "Rapportering Step" ikonen till metoden (Figur 2).
- Gör en textfil med en text program och spara detsom "BC_Readout" i dokumentmappen på datorn.
- Öppna dialogrutan för "Reporting Step", välj "textfil" för rapporten Style, och välj "BC_Readout" filen genom att surfa.
Obs: Den resulterande "BC_Readout" filen kommer att innehålla information om alla labwares på däck, utom tips som konfigureras i 3.1.16 inklusive information för streckkod läser för 2D streck rör och väl platser i "Matrix_OneML_TubeRack". - Lägg till en "Skapa datauppsättning" steg för att länka streckkoden och väl information. Dra "Skapa datamängden" ikonen till metoden (Figur 2), klicka på den för att öppna dialogrutan, välj "Läs från en fil" och välj "AB_BC.csv" (tabell 2 skapades 2,4), kontrollera "komma- avgränsade "och" filen har en rubrikrad ".
Obs: i förhandsgranskningsfönstret Arkiv namn antikropp (AB) och streckkod läser (BC) ska ses. - I same dialogrutan för "Skapa datamängden" i 3.1.25, välj "VM1" för laboratorie plats och "0" för stack djup, välj "Matcha Prov-ID", och använda fältet "BC" för att matcha med data set "BC_Read". Välj "AB" och "BC" för "datamängder skapas" (Figur 6).
- Dra en "VisionMate Move" ikonen till metoden (Figur 2) och ange övergången från streckkodsläsaren läge "VM1" tillbaka till den ursprungliga däck position på däck.
Obs: Följande steg 3.1.28-3.1.33 kommer att definiera överföringssteg för "Base Cocktail". - Dra en ikon "arbetslista" (Figur 2) och bläddra för att välja arbetslistan filen "Base_CT_P50" (tabell 3) skapas i 3.1.1. Kontrollera "hela Loop arbetslista".
- Dra "Transfer" -ikonen direkt under "Worklist" -ikonen (Figur 2). </ Li>
- Klicka på "Transfer" ikonen för att öppna specifikationen fältet. Välj bara en av sonderna, P50 LLS filtrerade tips, välj "lasta dem" när överföringen är klar, och kontrollera "Ändra tips mellan överföringar". Lägg källa genom att klicka på "Klicka här för att lägga en källa", välj "Matrix_OneML_TubeRack" som en laboratorie och välj plats på däck med namn "AB_BOX".
- I specifikationen fält för "Transfer", "Zoom in" på diagrammet av 96 brunnar genom att högerklicka och välj "AB" omedelbart efter "Använd Data Set" och välj där dess värderingar "är lika med" och "= AB_NAME" . Välj överföringsteknik val.
Obs: Användning av LLS rekommenderas att undvika att få utfälld skräp nära botten. - I specifikationen fält för "Transfer", välj destination genom att klicka på "Klicka här för att lägga till en destination", högerklicka för att zooma in och välj "SmallTuberack_microfugetubes "som en laboratorie, volym som" = VOL ", och plats på däck med namn" BASE_CT ". Efter att zooma ut, högerklicka igen, kontrollera" Ange markering som text ", och kontrollera" Ange mål med uttrycket nedan: "och skriv" = WELL_BASE "som en variabel för en destination däck läge.
- Upprepa 3.1.29-3.1.32 på samma sätt för "Base Cocktail" med P200 tips, genom att välja CSV-fil "Base_CT_P200" (tabell 4) välj sedan P200 LLS filtrerade tips samt lämplig pipett teknik för P200 LLS filtrerade tips.
Obs: Följande steg 3.1.34 och 3.1.35 kommer att definiera överföringssteg för "Activation Cocktail". - Upprepa 3.1.29-3.1.32 på samma sätt för "Aktivering Cocktail" med P50 tips, genom att välja CSV-fil "ACT_CT_P50" (tabell 5) och välja "ACT_CT" som en destination. Högerklicka på destination och kontrollera "Ange markering som Sms: a";. Kontrollera "Ange mål med uttrycket nedan:" och skriv "= WELL_ACT" som en variabel för en destinationsposition.
- Upprepa 3.1.34 på samma sätt för "Aktivering Cocktail" med P200 tips, genom att välja CSV-fil "ACT_CT_P200" (tabell 6) och P200 LLS filtrerade tips.
Obs: Metoden för att göra "Base Cocktail" och "Activation Cocktail" kan stängas efter att ha sparat.
- Med hjälp av kalkylprogram, gör ett kalkylblad som har information om namn antikropps (AB_NAME), destination rör plats (VÄL BASE eller VÄL ACT) och volym (VOL) i il för "Base Cocktail" med P50 tips (BASE_CT_P50: Table 3) eller P200 spetsar (BASE_CT_P200: Tabell 4) och "Activa Cocktail" med P50 spetsar (ACT_CT_P50: Tabell 5) eller P200 spetsar (ACT_CT_P200: Tabell 6). Spara dem som CSV-filer. För "VÄL BASE" och "VÄL-ACT" location, hänvisar till siffror i figur 3.
- Skapa en ny metod för framställning av "master Antibody Cocktail" genom att kombinera "Base Cocktail" och "Activation Cocktail" i 5 ml rundbottnade polystyrenrör (Figur 7).
Obs: Följande steg 3.2.1-3.2.6 definierar laboratorie: röret rack med 5 ml rundbottnad polystyrenrör. Siffror som en referens. Utredarna ska bestämma och justera för instrumentet.- I verktygsfältet under "Project", välj "Labware Type Editor". Right-click på ett objekt för 24-positionen rack, välj "Copy" och skriv "BiocisionCoolRack_XT" i ett popup-fönster.
- Dubbelklicka på objektet "BiocisionCoolRack_XT" för att öppna dialogrutan.
- Markera "Grundläggande information", ställ 12,78 cm (X) och 8,57 cm (Y) för "Span" och 7,93 cm för "höjd".
- Markera "Well_1". Enligt följande: "Well Offset"; 1,55 cm (X) och 1,33 cm (Y), "Well Count"; 6 (X) och 4 (Y), "Well Mellanrum"; 1,95 (X) och 1,97 (Y), "Maximal volym"; 2000 pl, Format ", Regular," Colum 2 Offset ", 0, och" Default Volume "; 0.
- Öppna "Well Configuration" redigera. Enligt följande: "Shape"; Runda, "Övre Radius"; 0.5375 cm, "Lägre Radius"; 0,48 cm och "Höjd"; 7,07 cm. Kontrollera "nedre delen" och ställ in "Shape"; Halvklotet, och "Radius"; 0,45 cm.
Obs: Följande steg3.2.6-3.2.7 kommer att definiera överföringssteg och kan användas i steg 3.2.14. - Skapa en CSV-fil "AB_MACT" (tabell 7) för att göra antikroppar cocktail med följande rubriker: a) "SRC_BASE"; en laboratorie namn för "Base Cocktail", b) "WELL_BASE"; och platser i laboratorie för "Base Cocktail", c) "VOL_BASE"; överföringsvolym för "Base Cocktail" i il, d) "SRC_ACT"; en laboratorie namn för "Activation Cocktail", e) "WELL_ACT"; och platser i laboratorie för "Activation Cocktail", f) "VOL_ACT"; överföringsvolym för "aktivering Cocktail" i il, g) "DEST_MACT"; däck lägesinformation för "master Antibody Cocktail", och h) "WELL_MACT"; väl placera information i provrörsställ för "master Antibody Cocktail".
- Fyll i informationen under rubrikerna skapats i 3.2.6) (tabell 7) enligt följande: a) använda "BASE_CT"enligt SRC_BASE, b) listan väl platsinformation för "WELL_BASE" som visas i figur 3A, c) lista totala volymen av antikroppar (25 | il buffert + summan av alla oädla antikroppstitrar för engångs färgning) under "VOL_BASE", d) använda "ACT_CT" under SRC_ACT, e) lista väl platsinformation för "WELL_BASE" såsom visas i figur 3B, f) lista totala volymen av antikroppar (25 | il buffert + summan av alla titrar aktiverings antikropp för enkel färgning) under "VOL_ACT". Transfer 25 pl buffert för T-Cell FM3. Se tabell 1 för test 1-3, g) använd "SPL_TUBES_1" (se 3.2.10) för "DEST_MACT", och h) lista och platsinformation för "WELL_MACT" som visas i figur 8.
Obs: Följande steg 3.2.8-3.2.15 programmerar metoden för att göra "master Antibody Cocktail" - Öppna en ny metod (Figur 7).
- Dra "Besättningment Setup "ikonen till den nya metoden (Figur 7).
- I beskrivningen gäller "Instrumentinställningar", dra ikoner för P1000 tips, två "SmallTuberack_microfugetubes", och "BiocisionCoolRack_XT" på däck schema. Öppna dialogrutan för de två "SmallTuberack_microfugetubes" och namn som "BASE_CT" och "ACT_CT", respektive, som anges i 3.1.17. Öppna dialogrutan för "BiocisionCoolRack_XT" och namn som "SPL_TUBES_1" som anges i 3.2.7 (Figur 9).
- Lägg till en ny "Group" genom att dra en ikon "grupp" metoden (Figur 7).
- Dra "Transfer Från fil" -ikonen direkt under "grupp" ikonen för att överföra "Base Cocktail" för att göra "master Antibody Cocktail" (Figur 7).
- I specifikationen fält för "Transfer Från fil", välj P1000 tips i bruk, ärutvalda "lasta dem" när överföringen är klar, och kontrollera "Ändra tips mellan överföringar".
- I specifikationen fält för "Transfer Från fil", välj filen "AB_MACT" (tabell 7) genom att bläddra, kontrollera "File har en rubrikrad". Välj "SRC_BASE" för käll labware läge och "WELL_BASE" för väl informationen i källlabb, välj "DEST_MACT" för destinationen laboratorie och "WELL_MACT" för väl informationen i destinationslabb, och välj "VOL_BASE" för volyminformation (Figur 10). Välj lämplig överföringsteknik för P1000 tips.
Obs: LLS kanske inte nödvändigt för denna process. - Lägg till en ny "Transfer Från fil" genom att dra den direkt under "Grupp" för att överföra "Activation Cocktail" som ska blandas med "Base Cocktail" för att göra "master Antibody Cocktail" (Figur 7 </ Strong>). På samma sätt ställa in överföringssteget som i 3.2.13 och 3.2.14. Undantag är följande: a) Välj "SRC_ACT" för käll labware läge, b) "WELL_ACT" för väl informationen i källlabb, och c) "VOL_ACT" för volyminformation.
4. Operating Procedure
- Först dubbelklicka på ikonen programvara för att starta 2D streckkodsläsaren på datorn.
- Därefter, dubbelklicka på ikonen programvara för att starta den automatiska vätske hanterare på datorn.
- Under "Instrument", välj "Hem Alla axlar" Prime sprutor av den automatiserade vätske föraren. Se till att alla sprutor innehåller inga synliga luftbubblor.
Obs: "Home alla axlar" kommer också att ge instrumentet en referenspunkt för att göra efterföljande drag. - Öppna metod för att göra "Base Cocktail" och "Activation Cocktail" (Figur 2) i programvaran för enutomated flytande hanterare.
- Placera mikrofugrör i "SmallTuberack_microfugetubes" för "BASE_CT" och "ACT_CT" i enlighet med antalet av "Base Cocktail" och "Activa Cocktail" som skall göras (Figur 3). Sedan placera dem på däck enligt "Instrumentinställningar" (Figur 5).
- Placera behållaren med buffert på däck enligt "Instrumentinställningar".
- De-cap 2D streck rör innehållande antikropparna med användning av en 8-kanals skruvkork avproppare. Håll lock i exakt ordning på ett lock som håller bricka för att undvika korskontaminering. Placera "Matrix_OneML_TubeRack" på däck enligt "Instrumentinställningar" (Figur 5).
- Plats P50 LLS filtrerade tips, P200 LLS filtrerade tips och P1000 tips på däck enligt "Instrumentinställningar" (Figur 5).
- Starta metod genom att klicka på den gröna trivinkelformade start ikonen. Som uppmanas av popup-fönster, se till att alla objekt på däck matcha "Instrumentinställningar" enligt definitionen i metoden. Placera inga föremål som inte nämns i "Instrumentinställningar" på däck, eftersom det kan krossa pod och / eller grip. Tryck på "OK" för att fortsätta.
- Efter "Matrix_OneML_TubeRack" flyttas till 2D streckkodsläsare och streckkoder läses, kommer en annan popup-fönster frågar om alla streckkoder läses. Fortsätt genom att trycka på "OK" en gång bekräftat.
- Efter avslutad överföring av den automatiserade vätskehanterings, sammanfatta 2D streckkodade rören med hjälp av en 8-kanals skruvkork avproppare, och sätta dem tillbaka till 4 ° C.
- Vortex alla mikrofugrör kraftigt under 20 sekunder, och återlämna dem i provrörsställ.
Obs: Otillräcklig virvelbildning kan resultera i suboptimal färgning av celler. - Stänga förfarande för framställning av "Base Cocktail" och "Activa Cocktail". Öppna sedan metoden för att göra "master Antibody Cocktail".
- Ställ in pre-märkt 5 ml rundbottnad polystyrenrör på "BiocisionCoolRack_XT" (figur 8) och placera den på däck. Etiketter bör ange vad "Base Cocktail" och "Activation Cocktail" blandas, liksom lämplig patient-ID.
- Placera rörställ för "Base Cocktail", "Activation Cocktail", och P1000 tips på däck (figur 9). Starta metoden (fig 7). Som uppmanas av popup-fönster, se till att objekt på däck match Instrumental Inställningar i metoden (Figur 9). Tryck på "OK" för att fortsätta.
- När ovanstående förfarande är gjort, manuellt lägga 50 pl blodprover in i varje 5 ml rundbottnad polystyrenrör som innehåller antikroppen cocktail.
- Vortex provrör inuti en klass II biologiskt säkerhetsskåp och inkubera 15 minuter vid RT i mörker. Take försiktighet för att undvika strimmor blod på sidorna av rören, eftersom detta kommer att resultera i inkonsekventa färgning. Försiktigt bort eventuella strimmor av blod genom svabbar som fuktats med flödestvättbuffert.
- Tillsätt 1 ml RBC lysbuffert manuellt och inkubera 15 minuter vid RT i mörker.
- Tillsätt 2 ml av flödestvättbuffert (0,1% natriumazid, 1% BSA, 10 U / ml heparin i 1x HBSS) och centrifugera i 5 min vid 400 x g. Kassera supernatanten i en klass II biologiskt säkerhetsskåp. Upprepa detta tvättprocess. Återsuspendera färgade celler i 0,5 ml flödestvättbuffert.
- Inrätta en flödescytometer som är utrustad med mjöl laser och lämpliga filter och köra prover med 5 ml rundbottnade polystyrenrör. Använda vanliga cytometer kalibrerings- och fluorescenskompensations metoder för datainsamling 12,15. Samla alla parametrar som anges i "fluorofor" i tabell 1.
Obs: lämpliga kontrollmaterial bör användas i varje körning för att säkerställa korrekt assay prestanda. - Efter att ha kört prover förvärvade exportera data som FCS filer.
- Analysera data med hjälp av lämplig mjukvara. Identifiera cellgrupper T med hjälp av en grind strategi som beskrivs av Human Immunology Project 1.
Representative Results
Målet med helblod immunfenotypning är att erhålla kvantitativ (avgränsningen av immuncellundergrupper) och kvalitativ (detekteringsaktiveringsstatus) information om immunceller. Vi har något modifierad cell immunfenotypning panelen T föreslagits av Human Immunology Project 1 för att förbättra prestanda av vår metod (tabell 1). Vår T-cellpanel syftar till att identifiera naiva, central minne (CM), effektor minne (EM), och T-celler. Kortfattat, vi diskriminera dubletter baserat på FCS-A och FCS-H. Sedan vi gate på lymfocyter baserat på sidospridning och CD45 nivåer. T-celler identifieras sedan genom uttryck av CD3. CD3 + T-celler differentieras till γδ T-celler och aP T-celler. αβ T-celler är vidare indelade i CD4 + och CD8 + T-celler. CD4 + och CD8 + T-celler analyseras sedan för att de undergrupper baserat på expression CD45RA och CCR7: CD45RA - CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + naiv, CD45RA + CCR7 - effektor och CD45RA - CCR7 - EM T-celler 1. Dessutom, vi också övervaka deras uttryck av aktiveringsmarkörer såsom CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1 BB, CD69, NKG2D och OX40 för att få kvalitativ information.
För att demonstrera precisionen hos denna metod, färgade vi perifera helblodsprov från 4 friska donatorer 5 gånger i en dag. Figur 11 visar förhållandet mellan procent T-cell-underpopulation på gated lymfocyter och procent variationskoefficient (% CV). En detaljerad uppdelning av procent T-cell-subpopulationer på gated lymfocyter och% CV för varje delmängd visas i tabell 8. Data från Test 2 och 3 ingår inte i figur 11 och tabell 8 för enkelhets skull. Mindre än 25% CVmellan körning (inter-assay precision) har föreslagits för kriterier för fenotypiska biomarkörer analyser för forskningsändamål 10 acceptans. Alla mätningar mötte detta kriterium utom ICOS + γδ T-celler (26,64-46,39%. Tabell 8) och ICOS + CD8 T-celler (14,64-58,39%. Tabell 8). Dessa värden visas i demonstrationssyfte. Vi inte utnyttja dessa mätningar eftersom ICOS spelar främst en viktig roll i aktiveringen av CD4 T-celler 16. Trenden med högre% CV i populationer som utgör en låg andel för den totala befolkningen observerades av andra 7. I fall utredare är intresserade av att övervaka ovanliga-händelser, antalet celler undersöktes behöver ökas för att övervinna större vaghet 17. Tillsammans våra data visar en framgångsrik användning av automatisering i provberedningen av helblod immunfenotypning.
< img alt = "Bild 1" src = "/ filer / ftp_upload / 53.485 / 53485fig1.jpg" />
Figur 1. Arbetsflöde för immunfenotypning med perifert helblod. Steg för steg arbetsflöde immunophenotypic analys visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Översikt av metoden för att göra "Base Cocktail" och "Activation Cocktail". Stegen i metoden för att göra "Base Cocktail" och "Activation Cocktail" i mjukvaran för automatisk flytande hanterare visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
e 3 "src =" / filer / ftp_upload / 53.485 / 53485fig3.jpg "/>
Figur 3. Layout för provrörsställ med BACE_CT och ACT_CT. (A) visar layout för provrörsställ "BACE_CT". (B) visar layout för provrörsställ "ACT_CT". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Labware definition för provrörsställ med 2D streck rör. Steg för steg process för att definiera provrörsställ med 2D streck rör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
485fig5.jpg "/>
Figur 5. Instrumentinställningar för metoden för att göra "Base Cocktail" och "Activation Cocktail". Den visar däckslayout för metoden för att göra "Base Cocktail" och "Activation Cocktail". Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6. Inställning för "Skapa datamängden". Det visar detaljerad inställning för "Skapa datamängden". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figu re 7. Översikt av metoden för att göra "master Antibody Cocktail". Stegen i metoden för att göra "master Antibody Cocktail" i mjukvaran för automatisk flytande hanterare visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Layout för provrörsställ med 5 ml rundbottnad polystyrenrör. Den visar layout för provrörsställ "SPL_TUBES_1". FM3 betyder fluorescens minus tre (lysande violett 421, fykoerytrin och allofykocyanin). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ftp_upload / 53.485 / 53485fig9.jpg "/>
Figur 9. Instrumentinställningar för metoden för att göra "master Antibody Cocktail". Den visar däckslayout för metoden för att göra "master Antibody Cocktail". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10. Inställning för "Transfer Från fil". Det visar detaljerad inställning för "Transfer Från fil". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11. Låg Vari förmåga i halvautomatisk helblod immunfenotypning. Enstaka CV värden för alla cellpopulationer analyserades från fyra friska donatorer visas som blå öppen cirkel. Regressionskurva återges i den blå linjen. Röd prickade linjerna anger 95% säker på band och girighet prickade linjerna visar 95% förutsägelse band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12. Ett exempel på suboptimal färgning. Färgning utfördes med tillräcklig eller otillräcklig vortexa av mikrofugrör från "BACE_CT" och "ACT_CT". Det finns två gated befolkningar i B. Den mindre befolkning med svag CD45 färgning representerar celler som inte får optimal färgning.g12large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| GRUPP | MARKÖR | fluorofor | Klona | ANTIKROPPNIVÅS (l / färgning) | |
| BASE COCKTAIL | TCELL | CD45 | FITC | 2D1 | 0,4 |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 1 | ||
| CD8 | APC-H7 | SK1 | 0,4 | ||
| CD4 | PerCP-Cy5.5 | SK3 | 2 | ||
| CCR7 | PE-CF594 | 150503 | 1 | ||
| CD45RA | PE-Cy7 | L48 | 1 | ||
| TCRab | BV786 </ Td> | T10B9.1A-31 | 1 | ||
| TCRgd | BV650 | B1 | 5 | ||
| AKTIVERING COCKTAIL-1 | TEST1 | HLA-DR | BV421 | G46-6 | 5 |
| CD278 (ICOS) | PE | DX29 | 5 | ||
| CD38 | APC | HB7 | 1 | ||
| AKTIVERING COCKTAIL-2 | TEST2 | CD279 (PD1) | BV421 | EH12.1 | 2,5 |
| CD357 (GITR) | PE | eBioAITR | 5 | ||
| CD137 (41BB) | APC | 4B4-1 | 10 | ||
| AKTIVERING COCKTAIL-3 | TEST3 | CD69 | BV421 | FN50 | 1 </ Td> |
| CD314 (NKG2D) | PE | 1D11 | 2 | ||
| CD134 (OX40) | APC | ACT35 | 5 |
Tabell 1. En lista antikropp för den modifierade T-cellpanel.
| AB | före Kristus |
| CD45_FITC | 0163562388 |
| CD3_Alexa700 | 0163562110 |
| CD4_PerCP_CY5.5 | 0163562364 |
| CD8_APC-H7 | 0163562363 |
| CCR7_PE-CF594 | 0163562387 |
| CD45RA_PE-Cy7 | 0163562091 |
| TCRab_BV786 | 0163562069 |
| TCRgd_BV650 | 0163562108 |
| 0163562339 | |
| A_CD278 (ICOS) _PE | 0163562082 |
| A_CD38_APC | 0163562317 |
| A_CD279 (PD1) _BV421 | 0163562340 |
| A_CD357 (GITR) _PE | 0163562093 |
| A_CD137 (41BB) _APC | 0163562315 |
| A_CD69_BV421 | 0163562341 |
| A_CD314 (NKG2D) _PE | 0163562314 |
| A_CD134 (OX40) _APC | 0163562316 |
Tabell 2. Antikropps namn med 2D strecknummer.
| GRUPP | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCELL | 1 | 7,2 | |
| TCELL | 1 | CD45_FITC | 7,2 |
| TCELL | 1 | CD3_Alexa700 | 18 |
| TCELL | 1 | CCR7_PE-CF594 | 18 |
| TCELL | 1 | CD45RA_PE-Cy7 | 18 |
| TCELL | 1 | TCRab_BV786 | 18 |
Tabell 3. En fil "BASE_CT_P50" namn antikropps och volyminformation.
| GRUPP | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCELL 1 | CD4_PerCP_CY5.5 | 36 | |
| TCELL | 1 | TCRgd_BV650 | 90 |
Tabell 4. En fil "BASE_CT_P200" namn antikropps och volyminformation.
| GRUPP | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST1 | 7 | A_HLA-DR_BV421 | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD278 (ICOS) _PE | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD38_APC | 6 |
| TEST2 | 13 | A_CD279 (PD1) _BV421 | 15 |
| TEST2 | 13 | A_CD357 (GITR) _PE | 30 |
| TEST3 | 19 | A_CD314 (NKG2D) _PE | 12 |
| TEST3 | 19 | A_CD69_BV421 | 6 |
| TEST3 | 19 | A_CD134 (OX40) _APC | 30 |
Tabell 5. En fil "ACT_ CT_P50" namn antikropps och volyminformation.
| GRUPP | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST2 | 13 | A_CD137 (41BB) _APC | 60 |
Tabell 6. En fil "ACT_CT _P200" namn antikropps och volyminformation.
| GIVARE# | SRC_ BAS | BASE COCKTAIL | VÄL_ BAS | VOL_ BAS | SRC_ACT | akti- VATION COCKTAIL | VÄL_ SPELA TEATER | VOL_ACT | DEST_MACT | VÄL_ MACT | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 1 | ||
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 7 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 13 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 19 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 2 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 8 | ||
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 14 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 20 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 3 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 9 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 15 |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 21 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 4 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 10 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 16 | ||
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 22 | |
Tabell 7. En fil "AB_MACT": Source och information om destinationen för "master Antibody Cocktail".
| Population # i Fig. 1 | jag | ii | iii | iv | v | |
| population namn | CD3 + | ab T-celler | gd T-celler | CD3 + CD4 + | CD3 + CD8 + | |
| % Av lymfocyter </ Td> | Heathly donator # 1 | 79,80 | 75,20 | 2,70 | 49,60 | 22,30 |
| Heathly donator # 2 | 69,40 | 61,90 | 5,85 | 44,40 | 16,20 | |
| Heathly donator # 3 | 75,80 | 69,60 | 4,75 | 42,00 | 23,50 | |
| Heathly donator # 4 | 77,20 | 73,50 | 1,98 | 52,70 | 18,90 | |
| %CV | Heathly donator # 1 | 1,42 | 1,58 | 3,70 | 2,50 | 1,56 |
| Heathly donator # 2 | 2,48 | 2,39 | 5,74 | 2,82 | 2,41 | |
| Heathly donator # 3 | 1,15 | 1,40 | 6,32 | 1,42 | 2,72 | |
| Heathly donator # 4 | 0,81 | 0,94 | 5,45 | 1,20 | 1,44 | |
| Genomsnitt | 1,47 | 1,58 | 5,30 | 1,99 | 2,03 | |
| Standardavvikelse | 0,72 | 0,61 | 1,13 | 0,79 | 0,63 |
Tabell 8. Rådata för% av lymfocyter och% CV för varje delmängd ritas i figur 4. Notera att data för test 2 och 3 inte visas i figur 5 och tabell 8 för att förenkla presentation av data.
Discussion
Immunfenotypning av perifert blod är av avgörande betydelse för att få inblick i enskilda svar på immunterapi. Utmaningen ligger i analys standardisering för att styra experiment till experiment variationen 1,14. En huvudsaklig källa till variabilitet ligger i den mänskliga manipulering av prover. Därför är det tänkbart att partiell eller fullständig automatisering av provbehandling kommer att underlätta en dramatisk minskning av experiment till experiment variationen 1,14. I detta protokoll, rapporterar vi vår framgångsrika försök att minimera analysvariation genom att införa en automatiserad flytande hanterare utrustad med 2D streckkodsläsare för provfärgning i helblod immunfenotypning.
Design, är vår metod mångsidig och kan övervaka andra immunundergrupper genom att lägga till ytterligare "Base Cocktails" för att definiera dem. Sådana undergrupper innefattar T-hjälparceller, T regulatoriska celler, B-celler, NK-celler, dendritiska celler och monocyter (manuskript ipreparat) 18. Vi anpassade konsortiets rekommenderade paneler antikropps genom att införa ytterligare markörer 1. Cellpopulationer identifierades med hjälp av "Base Cocktail" konjugerad till fluorokromer med minimal emission i den lysande violett 421 (BV421), fykoerytrin (PE), och allofykocyanin (APC) detektorer, som vi ville att reservera dessa kanaler för detektering av inducerbara antigener. Den här funktionen säkerställer inte bara den högsta känsligheten för att övervaka aktiveringsstatus av immunceller, men möjliggör också flexibelt boende nya aktiveringsmarkörer som dessa tre fluorokromer oftast konjugerade med antikroppar mot inducerbara markörer. Därför är inte bara lämpar sig för cocktail förberedelse för helblod immunfenotypning vår metod, men är också användbar för färgning andra prover inklusive perifera mononukleära blodceller och celler som återvunnits från uppdelade vävnader (t.ex. tumör).
framgångsrik introproduktion av vår metod kräver särskild uppmärksamhet till steg i labb förberedelse, och programmering och utförande av metoden. Framställning av 2D streckrören innefattar märkning med mänskligt läsbar etiketter och överföring av antikroppar mot de utsedda rören. För att förhindra införandet av fel, rekommenderar vi att göra detta med två personer. Närhelst du ändrar kalkylblad, bör utredarna kontrollera om metoden fungerar. Att välja lämpliga pipetteringsmetoder under programmering säkerställer framgångsrik vätskeöverföring. LLS möjliggör pipettering utan att utfällt skräp från botten av rör antikropps som vi använder antingen P50 eller P200 ledande tips. LLS kan inte vara ett bra alternativ för P1000 tips som LLS är känsligare med P1000 tips och ibland felaktigt utlöses av närvaron av bubblor. Höjder i labb definition bör anpassas för varje instrument som suboptimal vätskeöverföring kan förekomma, till exempel om det inte finns tillräckligt utrymme mellan kanten av tipsoch botten av rören. Som visas i figur 12, om "Base Cocktail" och / eller "Activation Cocktail" inte virvlas väl, kan det resultera i suboptimalt färgning.
Vi tänkte använda frystorkade reagens för cellfärgning som ett alternativ för att minska variationen i samband med reagens dispensering 19. Emellertid polymerkonjugat av lysande violett färgämnen kända för att interagera med varandra vilket orsakar icke-specifika signaler. Som sådan, lägga till mer än två polymerkonjugat (t.ex. BV421 och BV650 etc.) i frystorkade reagens kan orsaka icke-specifik signalering (t.ex. ökning av BV650 bakgrundssignal i BV421 + populationen) 20. Dessutom frystorkade reagens saknar flexibilitet för att inkludera nya färgning. De är oftast dyrare och kräver en bulk beställning. Av dessa skäl har vi valt att använda den automatiserade vätskehanterings utrustad med 2D streckrören. Även om det takes tid att ställa upp och innebär en initial investering att köpa instrumentet, i det långa loppet sådana faktorer kommer att kompenseras av ökad produktivitet och reproducerbarhet analyser. I själva verket, några grupper tidigare rapporterade den framgångsrika integrationen av den automatiserade vätskehanterings i sitt arbetsflöde av immunfenotypning eller liknande applikationer 21,22. Automatiserade lösningar för flödescytometrianalys finns också tillgängliga från kommersiella källor (FACS SPA III, Automated Cocktail Förberedelser Workstation och FlowStainer). Detta indikerar vidare att det finns ett stort behov för automatiserad cocktail förberedelse för immunfenotypning.
Efter mastering denna teknik, föreställer vi att utvecklingen av helautomatiska helblod immunfenotypning ytterligare kommer att minska experiment till experiment variabilitet och kan göra helblod immunfenotypning möjlig även i en multi klinisk prövning inställning 23. Vi har redan börjat använda en lys varh assistent att automatisera lys och tvättstegen. Vi föreställer oss också att automatiserad bestämning av volymen av antikroppen i 2D streck rör och spårning av reagensdispensering i hög grad kommer att förbättra inventering av antikroppar och kvalitetskontroll över vår metod, respektive.
Disclosures
YK, ILG, TLM, WLM, DPH, och KSB: Inga konkurrerande ekonomiska intressen. ANT är anställd av Beckman Coulter, Inc. Publicering av denna video artikeln sponsrad av Beckman Coulter, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 ml Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12 x 24 INCHES RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 ml Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1,025 µl | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µl (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10x Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1x, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
References
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
