Abstract
Immuunfenotypering van perifeer bloed door stroming cytometrie bepaald veranderingen in de frequentie en activeringsstatus van perifere leukocyten bij ziekte en behandeling. Het heeft de potentie om de therapeutische werkzaamheid te voorspellen en identificeren van nieuwe therapeutische targets. Volbloed kleuring gebruikt ongemanipuleerde bloed, die artefacten die kunnen optreden tijdens de voorbehandeling minimaliseert. Echter, moet volbloed kleuring worden uitgevoerd op vers afgenomen bloed om de integriteit van het monster te verzekeren. Daarnaast is het het beste om antilichaam cocktails bereiden op dezelfde dag om potentiële instabiliteit van tandem-kleurstoffen te voorkomen en te voorkomen dat reagens interactie tussen briljante violette kleurstoffen. Daarom volbloed kleuring vereist een zorgvuldige standaardisatie te controleren voor intra- en inter-experimentele variabiliteit.
Hier melden wij inzetten van een automatische vloeistofhandler voorzien van een tweedimensionale (2D) barcode lezer in een standaard werkwijze voor het maken Antibody cocktails voor flowcytometrie. Antilichamen werden overgebracht in 2D barcodes buizen aangebracht in een 96 putjes en de inhoud verzameld in een database. De vloeistof handler kon ga naar de bron antilichaam flesjes door te verwijzen naar antilichaam namen in de database. Onze methode geëlimineerd vervelend coördinatie voor het positioneren van de bron antilichaam buizen. Het ontvangen flexibiliteit zodat de gebruiker een aantal gegevens in het antilichaam uitloopprocedure gemakkelijk veranderen zoals specifieke antilichamen te gebruiken, volume en bestemming door aanpassing van de symbolen zonder het scripting herschrijven in de software methode voor elke assay.
Een proof of concept experiment behaalde uitstekende inter en intra-assay precisie, gedemonstreerd door repliceren de bereiding van een 11-kleuren, 17-antilichaam flowcytometrie test. Deze methodologieën grotere totale verwerkingscapaciteit voor flowcytometrie assays en vergemakkelijkt dagelijkse bereiding van het complex antilichaam cocktails die voor de gedetailleerde phenotypic karakterisering van vers verzameld anticoagulanteerd perifere bloed.
Introduction
Immuunfenotypering van menselijk perifeer bloed bepaalt kwantitatieve en kwalitatieve veranderingen in immuuncelsubklassen 1. Het geeft inzicht in de mechanismen van de actie en de weerstand, helpt ontdekking van predictieve biomarkers, en faciliteert de ontwikkeling van de combinatie van immuuntherapie. Daarom is de validatie en standaardisatie van immuunfenotypering is een gebied van groot belang voor academische onderzoekers, klinische laboratoria en industrieën.
Hoewel immunofenotypering van perifeer bloed door flowcytometrische technieken die momenteel wordt gebruikt voor klinische behandeling van hematologische maligniteiten 2,3 en humaan immunodeficiëntie virus (HIV) 4,5, betrouwbare immunofenotypering van perifeer bloed voor immunotherapie eisen specifieke overwegingen bij de validatie en standaardisatie omdat het vereist meer uitgebreide dekking dan immuun cel subsets en activatie / remmende receptoren 1,6-8. successful immunofenotypering vereist een zorgvuldige standaardisatie om experiment tot experiment variabiliteit met betrekking tot instrument setup en de cel kleuring procedure 9,10 minimaliseren. Terwijl de standaardisering van het instrument instellingen voor flowcytometrie is goed ingeburgerd bij de voormalige zorg 9,11,12 te pakken, blijft het onduidelijk hoe de variabiliteit in verband met cel kleuring een minimum te beperken, zonder beperking van de dekking van het immuunsysteem cel subsets en hun activatie-status.
Aangezien het aantal antigenen te detecteren toeneemt, neemt ook de kans op fouten en variabiliteit vanwege suboptimale reagens afgifte en kruisbesmetting. Methoden voor de analyse phenoptypic anticoagulanteerd volbloed werden vastgesteld in de late 1980's voor gebruik in klinische laboratoriumbepalingen. Deze zelfde methodes aan de behoeften van het onderzoekslaboratorium voor de monstervoorbereiding. Belangrijker is het antilichaam cocktails in de klinische laboratoria doorgaans minder complex en available pre-titer en voorgemengde van de fabrikant. Slechts een enkele overdracht van de voorgemengde antilichaam cocktail nodig. In het onderzoek instelling antilichaam cocktails van 10-16 antilichamen typisch. Elke cocktail moet worden gevalideerd voor stabiliteit door het laboratorium of verse vóór elke test voorbereid. Het voorbereiden van meerdere antilichaam cocktails voor een monster kan het pipetteren van 50-80 afzonderlijke antilichamen, een taak die zowel vervelend en foutgevoelig met zich meebrengen.
Automatisering van cocktail voorbereiding heeft een aantal voordelen ten opzichte van handmatige cocktail bereiding, zoals minder fouten, verhoogde nauwkeurigheid van pipetteren, en misschien zelfs afgenomen reagens verspilling. Hier rapporteren wij de succesvolle introductie van een automatische vloeistofhandler voorzien van een tweedimensionale (2D) barcodelezer in de cel-kleuring Werkwijze immuunfenotypering variabiliteit met betrekking tot bereiding van het monster te minimaliseren.
Protocol
Verzamelen en gebruiken van het perifere bloed in dit protocol werd goedgekeurd door de Voorzienigheid Health & Services Institutional Review Board. Alle proefpersonen mits hun schriftelijke toestemming.
Opmerking: Volg de Universele voorzorgsmaatregelen. Alle menselijk bloed moeten worden behandeld als besmettelijk en behandeld in overeenstemming met Biosafety Level 2 praktijken.
Noot: Immuunfenotypering met perifeer volbloed wordt uitgevoerd door incuberen van antistolling volbloed met fluorescent-gelabelde monoklonale antilichamen tegen celoppervlak antigenen, gevolgd door hypotone lysis detecteren rode bloedcellen te verwijderen. Cellen worden gewassen en het monster wordt geanalyseerd met een stroomcytometer. De hierin beschreven werkwijze is gericht op de bereiding van antilichaam cocktails van de geautomatiseerde vloeistofmanipulator voorzien van een 2D barcodelezer. Ten eerste, de "Base Cocktail" dat immuuncelsubklassen identificeert en de "Activation Cocktail" dat ik bewaaktnducible antigenen afzonderlijk bereid (Tabel 1). Dan beide cocktails worden gemengd tot een "Master Antibody Cocktail" te creëren. Zie figuur 1 voor de workflow.
1. Specimen
- Verzamel perifeer bloed via venapunctie in een natrium heparine ontstold bloedafnamebuis, omkeren voorzichtig een paar keer om een goede menging te verzekeren, en houd dan bij kamertemperatuur. Weigeren specimen als geklonterd of gehemolyseerd 13.
2. Labware Voorbereiding
- Label 2D barcode buizen met de mens leesbare labels (antilichaam naam, vender, catalogusnummer en lotnummer).
- Transfer gehele inhoud van antilichaam flacons uit de vender (in tabel 1 hieronder) aan overeenkomstige 2D barcode buizen.
Let op: Neem de extreme voorzichtigheid aan bubbels niet te introduceren als valselijk bubbels triggeren vloeistofniveau sensing (LLS), die resulteert in een suboptimale overdracht van reagens.
Opmerking: Zorg ervoor dat elk antilichaam vial voldoende antilichaam voor de run. - Lees de 2D barcode voor elke buis door de 2D barcode-lezer.
- Maak een spreadsheet dat het antilichaam namen (AB) en barcode leest bevat (BC) met behulp van een spreadsheet-software en opslaan in een door komma's gescheiden waarden (csv-bestand) als "AB_BC.csv" (tabel 2).
Opmerking: Zorg ervoor dat de cellen opmaken als "Tekst" niet "Nummer" met het oog op de eerste "0" te houden voor de barcode nummers eventuele (bijvoorbeeld 0163562544). Add "x, 0000000000" aan het begin tot het einde van de gegevens op te geven. - Schroef LLS metalen platen aan het frame van het dek in de geautomatiseerde vloeistof hander aan LLS te schakelen.
3. Programming voor de geautomatiseerde Liquid Handler
Opmerking: Twee werkwijzen zullen in de software voor de geautomatiseerde vloeistofmanipulator geprogrammeerd: a) een werkwijze voor het "Base Cocktail" en "Activation Cocktail" bij 3,1), en b) een werkwijze voor het "Master AntiboDY Cocktail "Door de" Base Cocktail "en" Activation Cocktail "in 3,2) (figuur 1).
- Een werkwijze voor het maken van de "Base Cocktail" en "Activation Cocktail" (figuur 2).
- Met behulp van de spreadsheet-software, maak een spreadsheet die informatie voor antilichaam namen (AB_NAME), bestemming buis locatie (WELL-BASE of WELL-ACT) en volume (VOL) in ul voor "Base Cocktail" met P50 tips (BASE_CT_P50 heeft: Table 3) of P200 tips (BASE_CT_P200: Tabel 4) en "Activation Cocktail" met P50 tips (ACT_CT_P50: Tabel 5) of P200 tips (ACT_CT_P200: Tabel 6). Opslaan als csv-bestanden. Voor "WELL-BASE" en "WELL-ACT" locatie, verwijzen naar nummers in figuur 3.
Let op: VOL = titer x (# van kleuring + 2) pl. Titers in Tabel 1 zijn partijspecifieke. Exploitant moet een tiet bepalener voor elk antilichaam zoals beschreven door anderen 14. - Klik op een pictogram om de software te starten voor de geautomatiseerde vloeibare handler op de computer om een methode te creëren voor het maken van "Base Cocktail" en "Activation Cocktail".
Let op: De volgende stappen 3.1.3-3.1.7 het laboratorium zal bepalen: de buis rek met 2D barcode buizen (figuur 4). De metingen worden als referentie. Onderzoekers moeten bepalen en aan te passen voor elk instrument. - In de werkbalk onder "Project", selecteer "De laboratorium Type Editor". Klik met de rechtermuisknop op een object voor een 96 goed vlakke plaat, selecteer "Copy" en type "Matrix_OneML_TubeRack" in een pop-up venster.
- Dubbelklik op het object "Matrix_OneML_TubeRack" om het dialoogvenster te openen. Highlight "Basisinformatie", stelt 12,775 cm (X) en 8,546 cm (Y) voor "Span" en 4,625 cm voor "Hoogte". (Figuur 4A).
- Vervolgens hoogtepunt "Movement informatie ". Stel Gripper offset 0 (X), 0 (Y) en 0,3 (Z), Gripper Squeeze -0.1cm, Gripper Unsqueeze 2,6 cm, Speed Limit 75%, en controleer vervolgens" Gebruik de grijper sensor "(Figuur 4B).
- Wijs dan "Well_1". Stel als volgt: "Wel Offset"; 1,5 cm (X) en 1,13 cm (Y): "Nou Count"; 12 (X) en 8 (Y): "Nou Spacing"; 0.9 (X) en 0,9 (Y), "Maximaal volume"; 1500 ui, Format ", Regular," Colum 2 Offset ", 0, en" Default Volume "; 0 (Figuur 4C).
- Druk tenslotte op een "Edit ..." knop aan de rechterkant van "Well Configuration" (Figuur 4C). In een pop-up venster, stelt u als volgt: "Vorm"; Ronde, "Upper Radius"; 0,37 cm, "Lower Radius"; 0,37 cm en "hoogte"; 3.9 cm. Check "Bottom Section" en zet "Shape"; Cone, "Radius"; 0,37 cm en "hoogte"; 0,4 cm (figuur 4D).
Let op: de buis rek met microcentrifugebuizen: De volgende stappen 3.1.8-3.1.11 zal het laboratorium te definiëren. De metingen worden als referentie. Onderzoekers moeten bepalen en aan te passen voor elk instrument. - In de werkbalk onder "Project", selecteer "De laboratorium Type Editor". Klik met de rechtermuisknop op een object voor een 24-positie rek, selecteer "Copy" en typ "SmallTuberack_microfugetubes".
- Dubbelklik op het object "SmallTuberack_microfugetubes" om het dialoogvenster te openen. Highlight "Basisinformatie", stel 12,75 cm (X) en 8,5 cm (Y) voor "Span" en 3,95 cm voor "Hoogte".
- Vervolgens markeert "Well_1". Stel als volgt: "Wel Offset"; 1,621 cm (X) en 1,181 cm (Y): "Nou Count"; 6 (X) en 4 (Y): "Nou Spacing"; 1.9 (X) en 1,9 (Y), "Maximaal volume"; 1.000 III, Format ", Regular," Colum 2 Offset ", 0, en" Default Volume "; 0.
- Tot slot, drukt u opeen "Edit ..." knop aan de rechterkant van 'Nou Configuration ". In een pop-up venster, stelt u als volgt: "Vorm"; Ronde, "Upper Radius"; 0,3345 cm, "Lower Radius"; 0,274 cm, en "Height"; 3,6728 cm. Check "Bottom Section" en zet "Shape"; Halfrond, en "Radius"; 0,1575 cm.
Opmerking: De volgende stappen 3.1.12-3.1.35 zal uitleggen hoe de "nieuwe methode" te programmeren voor het maken van de "Base Cocktail" en "Activation Cocktail" (figuur 2). - Klik op het pictogram "nieuwe methode" en open.
- Sleep een "IF" icoon tussen een en het pictogram "Start" "Finish" in de nieuwe methode (figuur 2). Klik en markeer de "IF" icoon. Typ het volgende voor Voorwaarde:. CreateObject ( "World.EngineObject") simuleren
Opmerking: Dit zal de software te voorkomen dat het uitvoeren van foutcontrole en deze methode kunnen werken. Zonder deze stap, de software zal ontbrekende informatie te waarschuwen voor dataset als barcode leest zijn alleen beschikbaar na de stap "VisionMate: Lees barcodes" in 3.1.20 beschreven). Aangezien deze stap de verificatie stap in de software uitgeschakeld, moet exploitant bevestigen er genoeg tips en reagens op het dek om deze werkwijze uit te voeren. - Plaats een icoon "Instrument-setup" tussen de "Dan" icoon en het eerste pictogram "End" in het "IF" icoon (figuur 2).
NB: Voor alle volgende stappen, pictogrammen sleept tussen de "Else" icoon en de tweede "End" icoon onder de "IF" icoon zodat stappen zijn ingekapseld in de "Anders". - Sleep het pictogram "Instrument-setup" onder de "Else" icoon in de methode (figuur 2).
- Klik op het pictogram "Instrument-setup" in de methode om het venster te openen. Configureren labwares door iconen voor P50 LLS gefilterd tips te slepen, P200 LLS gefilterd tips, P1000 tips, "Matrix_OneML_TubeRack", twee "SmallTuberack_microfugetubes", en het reservoir aan desbetreffende deck locatie via het pictogram lijst.
- Open het dialoogvenster voor de "Matrix_OneML_TubeRack" en de naam als "AB_BOX". Open het dialoogvenster voor de "SmallTuberack_microfugetubes" en de naam van een als "BASE_CT" voor Base Cocktails en de andere als "ACT_CT" voor Activation Cocktails (Figuur 5).
- Sleep een "overdracht" naar de werkwijze (figuur 2) een stap voor het overbrengen buffer uit het reservoir in microcentrifuge buisjes voor "Base Cocktail" en "Activation Cocktail" toevoegen. Transfer volume = 25 pi x (# van kleuring 2) voor "Base Cocktail 'en = 25 pi x (# van kleuring 2) voor" Activation Cocktail ".
- stappen toe te voegen voor het verplaatsen van de "Matrix_OneML_TubeRack" op de 2D-barcode-lezer. Sleep een icoon "VisionMate Move" om de methode (Fifiguur 2) en geef de overgang van de initiële dek positie om de barcode-lezer positie op het dek.
- Sleep een "VisionMate: Lees barcodes" icoon de werkwijze (figuur 2). Open het dialoogvenster en kies "VisionMate" als het apparaat en de naam van de in te stellen als "BC_Read" data.
- Sleep een "User Pauze" (figuur 2), selecteert u "Pauze het hele systeem en dit bericht" en typ een opmerking in het veld om gebruikers te herinneren aan wordt bevestigd dat alle barcodes worden gelezen voordat u doorgaat naar de volgende stap.
Opmerking: De volgende stappen 3.1.22-3.1.26 zal verbinden tussen goed locaties en antilichaam namen met behulp van barcode-informatie. Dit zal de automatische vloeistofhandler staat om een locatie van het betreffende antilichaam op basis van de naam antilichaam "AB" vinden. - Sleep een "Reporting Step" de werkwijze (figuur 2).
- Maak een tekstbestand met behulp van een tekst programma en op te slaanals "BC_Readout" in de map document op de computer.
- Open het dialoogvenster voor "Rapportage Step", kies "Tekst File" voor Report Style, en selecteer de "BC_Readout" bestand door middel van browsen.
Opmerking: De resulterende "BC_Readout" bestand zal informatie voor alle labwares op het dek, behalve tips bevatten zoals geconfigureerd in 3.1.16 met inbegrip van informatie voor de barcode leest voor 2D barcode buizen en goed locaties in de "Matrix_OneML_TubeRack". - Voeg een "Create Data Set" stap om barcode en goed informatie te koppelen. Sleep het icoon "Create Data Set" om de methode (figuur 2), klik erop om het dialoogvenster te openen, kiest u "Lees uit een bestand" en selecteer "AB_BC.csv" (tabel 2 gemaakt in 2.4), controleer "komma Afgescheiden "en" Het bestand heeft een kopregel ".
Let op: In het File preview-venster, antilichaam namen (AB) en barcode leest (BC) moet worden gezien. - In de same dialoogvenster voor "Create Data Set" in 3.1.25, selecteer "VM1" voor de laboratorium locatie en "0" voor stack diepte, selecteer "Pas de Sample-ID", en het gebruik van het veld "BC" aan te passen met de Data Stel "BC_Read". Selecteer "AB" en "BC" voor "gegevensverzamelingen moeten worden gecreërd" (Figuur 6).
- Sleep een icoon "VisionMate Move" de methode (figuur 2) en geef de verhuizing van de barcodelezer positie "VM1" terug naar de oorspronkelijke positie dek op het dek.
Opmerking: De volgende stappen 3.1.28-3.1.33 zal overdracht stap voor "Base Cocktail" te definiëren. - Sleep een icoon "werkvoorraad" (figuur 2) en blader naar de werklijst bestand "Base_CT_P50" (tabel 3) die in 3.1.1 te selecteren. Check "Loop hele werklijst".
- Sleep het icoon "Transfer" direct onder het symbool "Worklist" (figuur 2). </ Li>
- Klik op het pictogram "Transfer" om het veld specificatie openen. Selecteer slechts één van de probes, P50 LLS gefilterd tips, selecteer "uitladen" wanneer de overdracht wordt gedaan, en controleer of "Change tips tussen transfers". bron toe te voegen door te klikken op "Klik hier om een bron toe te voegen" als een laboratorium, en selecteer de locatie op het dek bij naam "AB_BOX", selecteer "Matrix_OneML_TubeRack".
- In het veld specificatie voor "Transfer", "Zoom in" op het schema van 96 putten door rechts te klikken en kies "AB" onmiddellijk na "Use Data Set" en selecteren waar haar waarden "gelijk zijn aan" en "= AB_NAME" . Kies overdracht techniek van keuze.
Let op: Het gebruik van LLS wordt ten zeerste aanbevolen om te voorkomen dat neergeslagen puin in de buurt van bodem. - In het veld specificatie voor "Transfer", selecteer bestemming door te klikken op "Klik hier om een bestemming toe te voegen", klik met de rechtermuisknop om in te zoomen en selecteer "SmallTuberack_microfugetubes "als een laboratorium, volume als" = VOL ", en de locatie op het dek bij naam" BASE_CT ". Na het uit te zoomen, klik met de rechtermuisknop nogmaals, check" Geef Selection als tekst ", en vink" Geef de doelen met de uitdrukking hieronder: "en typ" = WELL_BASE "als een variabele voor een bestemming deck positie.
- Herhaal 3.1.29-3.1.32 evenzo voor "Base Cocktail" met P200 tips, door het CSV-bestand "Base_CT_P200" (tabel 4) te selecteren en kies vervolgens P200 LLS gefilterd tips alsmede passende pipet techniek voor P200 LLS gefilterd tips.
Let op: De volgende stappen 3.1.34 en 3.1.35 zal de overdracht stap voor "Activation Cocktail" te definiëren. - Herhaal 3.1.29-3.1.32 evenzo voor "Activation Cocktail" met P50 tips, door het selecteren van het CSV-bestand "ACT_CT_P50" (tabel 5) en te kiezen voor "ACT_CT" als bestemming. Klik met de rechtermuisknop op de bestemming en vink "Geef Selection als tekst";. Check "Geef de doelen met de volgende uitdrukking:" en typ "= WELL_ACT" als een variabele voor een bestemming positie.
- Herhaal 3.1.34 evenzo voor "Activation Cocktail" met P200 tips, door het CSV-bestand "ACT_CT_P200" (tabel 6) en P200 LLS gefilterd tips selecteren.
Opmerking: De methode voor het maken van "Base Cocktail" en "Activation Cocktail" kunnen na het opslaan worden gesloten.
- Met behulp van de spreadsheet-software, maak een spreadsheet die informatie voor antilichaam namen (AB_NAME), bestemming buis locatie (WELL-BASE of WELL-ACT) en volume (VOL) in ul voor "Base Cocktail" met P50 tips (BASE_CT_P50 heeft: Table 3) of P200 tips (BASE_CT_P200: Tabel 4) en "Activation Cocktail" met P50 tips (ACT_CT_P50: Tabel 5) of P200 tips (ACT_CT_P200: Tabel 6). Opslaan als csv-bestanden. Voor "WELL-BASE" en "WELL-ACT" locatie, verwijzen naar nummers in figuur 3.
- Maak een nieuwe methode voor het maken van "Master Antibody Cocktail" door het combineren van "Base Cocktail" en "Activation Cocktail" in 5 ml ronde bodem polystyreen buizen (Figuur 7).
Let op: de buis rek met 5 ml ronde bodem polystyreen buizen: De volgende stappen 3.2.1-3.2.6 zal het laboratorium te definiëren. Getallen zijn bedoeld voor referentie. Onderzoekers moeten bepalen en aan te passen voor het instrument.- In de werkbalk onder "Project", selecteer "De laboratorium Type Editor". Rechts-click op een object voor de 24-positie rek, selecteer "Copy" en type "BiocisionCoolRack_XT" in een pop-up venster.
- Dubbelklik op het object "BiocisionCoolRack_XT" om het dialoogvenster te openen.
- Highlight "Basisinformatie", stel 12,78 cm (X) en 8,57 cm (Y) voor "Span" en 7,93 cm voor "Hoogte".
- Highlight "Well_1". Stel als volgt: "Wel Offset"; 1,55 cm (X) en 1,33 cm (Y): "Nou Count"; 6 (X) en 4 (Y): "Nou Spacing"; 1,95 (X) en 1,97 (Y), "Maximaal volume"; 2000 ui, Format ", Regular," Colum 2 Offset ", 0, en" Default Volume "; 0.
- Open 'Nou Configuration "te bewerken. Stel als volgt: "Vorm"; Ronde, "Upper Radius"; 0,5375 cm, "Lower Radius"; 0,48 cm en "hoogte"; 7.07 cm. Check "Bottom Section" en zet "Shape"; Halfrond, en "Radius"; 0.45 cm.
Opmerking: De volgende stappen3.2.6-3.2.7 zal overdracht stappen te definiëren en worden gebruikt in stap 3.2.14. - Maak een CSV-bestand "AB_MACT" (tabel 7) voor het maken van antilichaam cocktail met de volgende koppen: a) "SRC_BASE"; een laboratorium naam voor "Base Cocktail", b) "WELL_BASE"; goed locaties in het laboratorium voor "Base Cocktail", c) "VOL_BASE"; transfervolume voor "Base Cocktail 'in pi, d)" SRC_ACT "; een laboratorium naam voor "Activation Cocktail", e) "WELL_ACT"; goed locaties in het laboratorium voor "Activation Cocktail", f) "VOL_ACT"; transfervolume voor "Activering Cocktail 'in pi, g)" DEST_MACT "; dek positie-informatie voor "Master Antibody Cocktail", en h) "WELL_MACT"; goed positie-informatie in de buis rek voor "Master Antibody Cocktail".
- Vul informatie onder headers gemaakt in 3.2.6) (tabel 7) als volgt: a) "BASE_CT" gebruikenonder SRC_BASE, b) lijst en locatiegegevens voor "WELL_BASE" zoals weergegeven in figuur 3A, c) lijst totaalvolume van antilichamen (25 pl buffer + som van base antilichaamtiters voor enige kleuring) onder "VOL_BASE", d) gebruikt "ACT_CT" onder SRC_ACT, e) lijst en locatiegegevens voor "WELL_BASE" zoals weergegeven in figuur 3B, f) lijst totaalvolume van antilichamen (25 pl buffer + som van activatie antilichaamtiters voor enige kleuring) onder "VOL_ACT". Overdracht 25 ui buffer voor T-cel FM3. Zie Tabel 1 voor testen 1-3, g) gebruik "SPL_TUBES_1" (zie 3.2.10) voor "DEST_MACT" en h) lijst en locatiegegevens voor "WELL_MACT" zoals weergegeven in figuur 8.
Let op: De volgende stappen 3.2.8-3.2.15 zal de methode te programmeren voor het maken van "Master Antibody Cocktail" - Open een nieuwe methode (figuur 7).
- Sleep de "Instrment Setup "icoon om de nieuwe methode (Figuur 7).
- Op het gebied specificatie van "Instrument-setup", drag iconen voor P1000 tips, twee "SmallTuberack_microfugetubes" en "BiocisionCoolRack_XT" op het dek diagram. Open het dialoogvenster voor de twee "SmallTuberack_microfugetubes" en de naam als "BASE_CT" en "ACT_CT", respectievelijk, zoals aangegeven in 3.1.17. Open het dialoogvenster voor "BiocisionCoolRack_XT" en naam "SPL_TUBES_1" zoals bedoeld in 3.2.7 (figuur 9).
- Een nieuwe "groep" van een icoon "groep" slepen de werkwijze (Figuur 7).
- Sleep de "Transfer Uit bestand" icoon direct onder het symbool "Groep" naar "Base Cocktail" dragen voor het maken van "Master Antibody Cocktail" (Figuur 7).
- In het veld specificatie voor "Transfer Uit bestand", selecteert u de P1000 tips in gebruik is, select "uitladen" wanneer de overdracht wordt gedaan, en controleer of "Change tips tussen transfers".
- In het veld specificatie voor "Transfer Van File", selecteer het bestand "AB_MACT" (tabel 7) door te bladeren, check "File heeft een kopregel". Selecteer "SRC_BASE" voor source laboratorium positie en "WELL_BASE" voor zowel informatie in de bron laboratorium, selecteer "DEST_MACT" voor de bestemming laboratorium en "WELL_MACT" voor zowel informatie op de plaats van bestemming laboratorium, en selecteer "VOL_BASE" voor volume informatie (Figuur 10). Koos passende overdracht techniek voor P1000 tips.
Opmerking: LLS niet nodig zijn voor dit proces. - Voeg nog een "Transfer Uit bestand" door hem direct onder "Groep" naar de "Activation Cocktail" dat moet worden gemengd met de "Base Cocktail" voor het maken van "Master Antibody Cocktail" overbrengen slepen (Figuur 7 </ Strong>). Op dezelfde manier het opzetten van de overdracht stap als in 3.2.13 en 3.2.14. Uitzonderingen zijn als volgt: a) Selecteer "SRC_ACT" voor source laboratorium positie, b) "WELL_ACT" voor zowel informatie in de bron laboratorium, en c) "VOL_ACT" voor volume informatie.
4. Operating Procedure
- Ten eerste, dubbelklikt u op het pictogram software om de 2D barcode-lezer te lanceren op de computer.
- Dubbelklik vervolgens op het pictogram van software om de geautomatiseerde vloeibare handler te starten op de computer.
- Onder "Instrument", selecteer "Home Alle Assen" naar prime spuiten van de geautomatiseerde vloeibare handler. Zorg ervoor dat alle spuiten bevatten geen zichtbare luchtbellen.
Let op: "Thuis alle assen" zal ook het instrument een referentiepunt van waaruit de latere bewegingen te maken. - Open de werkwijze voor het maken van de "Base Cocktail" en "Activation Cocktail" (figuur 2) in de software voor eenutomated vloeistof handler.
- Plaats de microcentrifugebuizen in "SmallTuberack_microfugetubes" voor "BASE_CT" en "ACT_CT" overeenkomstig het aantal "Base Cocktail" en "Activation Cocktail" worden gemaakt (Figuur 3). Leg ze dan op het dek op basis van de "Instrument-setup" (Figuur 5).
- Plaats het reservoir met buffer op het dek op basis van de "Instrument-setup".
- De-cap 2D barcode buisjes die de antilichamen met behulp van een 8-kanaals schroefdop decapper. Houd caps in precies dezelfde volgorde op een cap bedrijf lade om kruisbesmetting te voorkomen. Leg het "Matrix_OneML_TubeRack" op de mat als "Instrument Setup" (Figuur 5).
- Plaats P50 LLS gefilterd tips, P200 LLS gefilterd tips en P1000 tips op het dek op basis van de "Instrument-setup" (Figuur 5).
- Start de methode door te klikken op de groene triangle-vormige start icoon. Zoals gevraagd door de popup-venster, zorg ervoor dat alle items op het dek overeenkomen met de "Instrument-setup", zoals gedefinieerd in de methode. Gebruik geen voorwerpen die niet in de "Instrument-setup" op het dek staan vermeld niet te plaatsen, omdat dit de pod en / of de grijper kan verpletteren. Druk op "OK" om verder te gaan.
- Na de "Matrix_OneML_TubeRack" op de 2D-barcode-lezer wordt verplaatst en barcodes worden gelezen, zal een ander popup venster vraagt of alle barcodes worden gelezen. Ga verder door te drukken op "OK" eens bevestigd.
- Na voltooiing van de overdracht door de geautomatiseerde vloeibare handler, recapituleren de 2D-barcodes buizen met behulp van een 8-kanaals schroefdop decapper, en zet ze terug tot 4 ° C.
- Vortex alle microfuge buizen krachtig gedurende 20 sec, en terug te geven in de buis rekken.
Opmerking: Onvoldoende vortexen kan leiden tot suboptimale kleuring van cellen. - Sluit de werkwijze voor het maken van "Base Cocktail" en "Activation Cocktail". Open vervolgens de methode voor het maken van "Master Antibody Cocktail".
- Opgericht gelabelde 5 ml ronde bodem polystyreen buizen op de "BiocisionCoolRack_XT" (figuur 8) en plaats het op het dek. Etiketten moeten geven welke "Base Cocktail" en "Activation Cocktail" worden gemengd, evenals de juiste patiënt ID.
- Plaats tube racks voor "Base Cocktail", "Activering Cocktail 'en P1000 tips op het dek (zie figuur 9). Start de werkwijze (Figuur 7). Zoals gevraagd door de popup-venster, zorg ervoor dat de punten op het dek wedstrijd Instrumental Setup in de methode (Figuur 9). Druk op "OK" om verder te gaan.
- Als de bovenstaande werkwijze gebeurt handmatig 50 gl bloed specimens voegen in elk 5 ml ronde bodem polystyreen buis die het antilichaam cocktail bevat.
- Vortex monsterbuizen in een Klasse II biologische veiligheid kabinet en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Take waakt dat bloed strepen op de zijkanten van de buizen, omdat dit zal resulteren in inconsistente kleuring. Verwijder voorzichtig strepen van bloed met wattenstaafjes bevochtigd met stroom wasbuffer.
- Voeg 1 ml RBC lysis buffer handmatig en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Voeg 2 ml stroming wasbuffer (0,1% natriumazide, 1% BSA, 10 U / ml heparine in 1x HBSS) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g. Gooi supernatant in een Klasse II biologische veiligheidskabinet. Herhaal dit wasproces. Resuspendeer gekleurde cellen in 0,5 ml van stroom wasbuffer.
- Stel een stromingscytometer die is uitgerust met bloem lasers en bijbehorende filters en werking specimens middels 5 ml ronde bodem polystyreen buizen. Gebruik standaard cytometer kalibratie en fluorescentie compensatie methoden voor het verzamelen van gegevens 12,15. Verzamel alle parameters in "fluorofoor" in tabel 1.
Let op: een passende controle materialen dienen in elke run worden gebruikt om een goede kont te verzekerenay prestaties. - Na het uitvoeren van steekproeven, de uitvoer verkregen gegevens als FCS-bestanden.
- Analyseer gegevens met behulp van de juiste software. Identificeer T-cel subsets met behulp van een gating strategie geschetst door de Human Immunology Project 1.
Representative Results
Het doel van volbloed immuunfenotypering is kwantitatief (de afbakening van immuuncelsubklassen) en kwalitatieve (activering status van detectie) informatie over de immuuncellen te verkrijgen. We hebben enigszins gewijzigde door het Human Immunology Project 1 voorgesteld prestaties van onze werkwijze (Tabel 1) verbetering T cel immunofenotypering paneel. Onze T cellenpaneel wil naïeve, centrale geheugen (CM), effector geheugen (EM) en effector-T-cellen te identificeren. Samengevat, onderscheiden we doubletten gebaseerd op FCS-A en FCS-H. Toen we gate op lymfocyten op basis van zijwaartse verstrooiing en CD45 niveaus. T cellen worden vervolgens geïdentificeerd door expressie van CD3. CD3 + T-cellen zijn gedifferentieerd in γδ T-cellen en T-cellen αβ. αβ T-cellen worden verder onderverdeeld in CD4 + en CD8 + T-cellen. CD4 + en CD8 + T-cellen worden vervolgens geanalyseerd op hun subsets op basis expression van CD45RA en CCR7: CD45RA - CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + Naïve, CD45RA + CCR7 - effector en CD45RA - CCR7 - EM T-cellen 1. Daarnaast hebben we de expressie van activeringsmerkers, zoals CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1BB, CD69, NKG2D en OX40 bewaken ook kwalitatieve informatie te verkrijgen.
De nauwkeurigheid van deze methode demonstreren we bevlekt perifeer volbloed monsters van 4 gezonde donoren 5 maal per dag. Figuur 11 toont de relatie tussen percentage van T-cel subpopulatie op gated lymfocyten en het percentage variatiecoëfficiënt (% CV). Een gedetailleerd overzicht van het percentage van T-cel subpopulaties op gated lymfocyten en CV% voor elke subset is weergegeven in tabel 8. Gegevens uit proeven 2 en 3 zijn niet in figuur 11 en tabel 8 eenvoud. Minder dan 25% CVtussen run (inter-assay precisie) is voorgesteld voor de acceptatiecriteria voor fenotypische biomarker tests voor onderzoeksdoeleinden 10. Alle metingen met deze criteria behalve ICOS γδ + T-cellen (26,64-46,39%. Tabel 8) en ICOS CD8 + T-cellen (14,64-58,39%. Tabel 8). Deze waarden worden getoond voor demonstratiedoeleinden. We hebben geen gebruik maken van deze metingen omdat ICOS speelt vooral een belang voor de activatie van CD4 T-cellen 16. De trend van hogere% CV in populaties die een laag percentage van de totale bevolking omvat werd waargenomen door anderen 7. In geïnteresseerd zijn in het toezicht op zeldzame gebeurtenissen geval onderzoekers zijn, het aantal cellen onderzocht nodig heeft om tot een grotere onnauwkeurigheid 17 overwonnen worden verhoogd. Samen onze gegevens blijkt de succesvolle inzet van automatisering in de bereiding van de monsters van volbloed immuunfenotypering.
< img alt = "Figuur 1" src = "/ files / ftp_upload / 53485 / 53485fig1.jpg" />
Figuur 1. Workflow voor immunofenotypering met perifeer volbloed. Stap voor stap workflow van immunophenotypic assay wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Overzicht van de methode voor het maken van "Base Cocktail" en "Activation Cocktail". Stappen in de methode voor het maken van "Base Cocktail" en "Activation Cocktail" in de software voor de geautomatiseerde vloeibare handler worden getoond. Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.
e 3 "src =" / files / ftp_upload / 53485 / 53485fig3.jpg "/>
Figuur 3. Lay-out voor de buis rek met BACE_CT en ACT_CT. (A) toont de lay-out voor de buis rek "BACE_CT". (B) toont de lay-out voor de buis rek "ACT_CT". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Labware definitie van de buis rek met 2D barcode buizen. Stap voor stap proces van het definiëren van de buis rek met 2D barcode buizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
485fig5.jpg "/>
Figuur 5. Instrument setup voor de methode voor het maken van "Base Cocktail" en "Activation Cocktail". Het toont het dek lay-out voor de methode voor het maken van "Base Cocktail" en "Activation Cocktail". Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Figuur 6. Setup voor "Create Data Set". Het toont gedetailleerde instelling voor "Create Data Set". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figu re 7. Overzicht van de methode voor het maken van "Master Antibody Cocktail". Stappen in de methode voor het maken van "Master Antibody Cocktail" in de software voor de geautomatiseerde vloeibare handler wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. Lay-out voor de buis rek met 5 ml ronde bodem polystyreen buizen. Het toont de lay-out voor de buis rek "SPL_TUBES_1". FM3 betekent fluorescentie min 3 (briljante violet 421, fycoerythrine en allofycocyanine). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ftp_upload / 53485 / 53485fig9.jpg "/>
Figuur 9. Instrument setup voor de methode voor het maken van "Master Antibody Cocktail". Het toont het dek lay-out voor de methode voor het maken van "Master Antibody Cocktail". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10. Setup voor "Transfer Uit bestand". Het toont gedetailleerde instelling voor "Transfer Uit bestand". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11. Low vari vermogen in het semi-automatische volbloed immunofenotypering. Single CV waarden van alle celpopulaties geanalyseerd van vier gezonde donoren worden weergegeven als blauwe open cirkel. Regressie kromme wordt weergegeven in de blauwe lijn. Rood gestippelde lijnen geven 95% zeker bands en hebzucht gestippelde lijnen geven 95% voorspelling bands. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12. Een voorbeeld van suboptimale kleuring. Kleuring werd met voldoende of onvoldoende vortexen van microfuge buizen uit "BACE_CT" en "ACT_CT". Er zijn twee gated populaties in B. De minor bevolking met een zwakke CD45 kleuring vertegenwoordigt cellen die niet optimaal vlekken krijg.g12large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| GROEP | MARKER | fluorofoor | Clone | Titer (gl / vlekken) | |
| BASE COCKTAIL | TCELL | CD45 | FITC | 2D1 | 0.4 |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 1 | ||
| CD8 | APC-H7 | SK1 | 0.4 | ||
| CD4 | PerCP-Cy5.5 | SK3 | 2 | ||
| CCR7 | PE-CF594 | 150.503 | 1 | ||
| CD45RA | PE-Cy7 | L48 | 1 | ||
| TCRab | BV786 </ Td> | T10B9.1A-31 | 1 | ||
| TCRgd | BV650 | B1 | 5 | ||
| ACTIVERING COCKTAIL-1 | TEST1 | HLA-DR | BV421 | G46-6 | 5 |
| CD278 (ICOS) | PE | DX29 | 5 | ||
| CD38 | APC | HB7 | 1 | ||
| ACTIVERING COCKTAIL-2 | TEST2 | CD279 (PD1) | BV421 | EH12.1 | 2.5 |
| CD357 (GITR) | PE | eBioAITR | 5 | ||
| CD137 (41BB) | APC | 4B4-1 | 10 | ||
| ACTIVERING COCKTAIL-3 | test3 | CD69 | BV421 | FN50 | 1 </ Td> |
| CD314 (NKG2D) | PE | 1D11 | 2 | ||
| CD134 (OX40) | APC | ACT35 | 5 |
Tabel 1. Een antilichaam lijst voor de gemodificeerde T-cel panel.
| AB | BC |
| CD45_FITC | 0163562388 |
| CD3_Alexa700 | 0163562110 |
| CD4_PerCP_CY5.5 | 0163562364 |
| CD8_APC-H7 | 0163562363 |
| CCR7_PE-CF594 | 0163562387 |
| CD45RA_PE-Cy7 | 0163562091 |
| TCRab_BV786 | 0163562069 |
| TCRgd_BV650 | 0163562108 |
| 0163562339 | |
| A_CD278 (ICOS) _PE | 0163562082 |
| A_CD38_APC | 0163562317 |
| A_CD279 (PD1) _BV421 | 0163562340 |
| A_CD357 (GITR) _PE | 0163562093 |
| A_CD137 (41BB) _APC | 0163562315 |
| A_CD69_BV421 | 0163562341 |
| A_CD314 (NKG2D) _PE | 0163562314 |
| A_CD134 (OX40) _APC | 0163562316 |
Tabel 2. Antilichaam namen met 2D barcode nummers.
| GROEP | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCELL | 1 | 7.2 | |
| TCELL | 1 | CD45_FITC | 7.2 |
| TCELL | 1 | CD3_Alexa700 | 18 |
| TCELL | 1 | CCR7_PE-CF594 | 18 |
| TCELL | 1 | CD45RA_PE-Cy7 | 18 |
| TCELL | 1 | TCRab_BV786 | 18 |
Tabel 3. Een bestand "BASE_CT_P50": antilichaam namen en volume informatie.
| GROEP | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCELL 1 | CD4_PerCP_CY5.5 | 36 | |
| TCELL | 1 | TCRgd_BV650 | 90 |
Tabel 4. Een bestand "BASE_CT_P200": antilichaam namen en volume informatie.
| GROEP | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST1 | 7 | A_HLA-DR_BV421 | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD278 (ICOS) _PE | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD38_APC | 6 |
| TEST2 | 13 | A_CD279 (PD1) _BV421 | 15 |
| TEST2 | 13 | A_CD357 (GITR) _PE | 30 |
| test3 | 19 | A_CD314 (NKG2D) _PE | 12 |
| test3 | 19 | A_CD69_BV421 | 6 |
| test3 | 19 | A_CD134 (OX40) _APC | 30 |
Tabel 5. Een bestand "ACT_ CT_P50": antilichaam namen en volume informatie.
| GROEP | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST2 | 13 | A_CD137 (41BB) _APC | 60 |
Tabel 6. Een bestand "ACT_CT _P200": antilichaam namen en volume informatie.
| DONOR # | SRC_ BASEREN | BASE COCKTAIL | GOED_ BASEREN | VOL_ BASEREN | SRC_ACT | inge- vatie COCKTAIL | GOED_ HANDELEN | VOL_ACT | DEST_MACT | GOED_ MACT | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 1 | ||
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 7 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 13 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | test3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 19 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 2 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 8 | ||
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 14 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | test3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 20 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 3 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 9 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 15 |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | test3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 21 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 4 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 10 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 16 | ||
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | test3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 22 | |
Tabel 7. Een bestand "AB_MACT": Source en bestemmingsinformatie voor "Master Antibody Cocktail".
| Bevolking # in Fig. 1 | ik | ii | iii | iv | v | |
| naam van de bevolking | CD3 + | ab T cellen | gd T-cellen | CD3 + CD4 + | CD3 + CD8 + | |
| % Van lymfocyten </ Td> | Heathly donor # 1 | 79.80 | 75.20 | 2.70 | 49.60 | 22.30 |
| Heathly donor # 2 | 69.40 | 61.90 | 5.85 | 44.40 | 16.20 | |
| Heathly donor # 3 | 75,80 | 69.60 | 4.75 | 42.00 | 23.50 | |
| Heathly donor # 4 | 77,20 | 73.50 | 1.98 | 52.70 | 18.90 | |
| %CV | Heathly donor # 1 | 1.42 | 1.58 | 3.70 | 2.50 | 1.56 |
| Heathly donor # 2 | 2.48 | 2.39 | 5.74 | 2.82 | 2.41 | |
| Heathly donor # 3 | 1.15 | 1.40 | 6.32 | 1.42 | 2.72 | |
| Heathly donor # 4 | 0.81 | 0.94 | 5.45 | 1.20 | 1.44 | |
| Gemiddelde | 1.47 | 1.58 | 5.30 | 1.99 | 2.03 | |
| Standaardafwijking | 0.72 | 0.61 | 1.13 | 0.79 | 0.63 |
Tabel 8. Ruwe gegevens% lymfocyten en% CV voor elke subset uitgezet in figuur 4. Merk op dat data voor testen 2 en 3 niet in figuur 5 en tabel 8 zijn getoond gegevenspresentatie vereenvoudigen.
Discussion
Immuunfenotypering van perifere bloed is van cruciaal belang voor het verkrijgen van inzicht in de individuele reacties op immunotherapie. De uitdaging ligt in het assay normalisatie experiment-to-experiment variabiliteit 1,14 beheersen. Een belangrijke bron van variabiliteit ligt in de menselijke manipulatie van monsters. Daarom is het denkbaar dat gedeeltelijk of volledig automatiseren monsterverwerking een drastische vermindering van experiment tot experiment variabiliteit 1,14 vergemakkelijkt. In dit protocol, melden we onze succesvolle inspanningen om assay variabiliteit te minimaliseren door de invoering van een geautomatiseerde vloeibare handler uitgerust met 2D barcode-lezer voor het monster kleuring in volbloed immunofenotypering.
In het ontwerp, onze methode is veelzijdig en kan andere immuunsysteem subsets te controleren door het toevoegen van extra "Base Cocktails" om ze te definiëren. Dergelijke bepaald om T-helpercellen, T-regulerende cellen, B-cellen, NK-cellen, dendritische cellen en monocyten (manuscript invoorbereiding) 18. We aangepast van het consortium aanbevolen antilichaam panelen door de invoering van extra 1 markers. Celpopulaties werden geïdentificeerd met "Base Cocktail" geconjugeerd aan fluorochromen met minimale emissie naar de briljante violette 421 (BV421), fycoerythrine (PE) en allofycocyanine (APC) detectoren, als we wilden deze kanalen te reserveren voor het detecteren van induceerbare antigenen. Deze functie zorgt niet alleen de hoogste gevoeligheid voor activeringsstatus van immuuncellen volgen maar maakt ook flexibele accommodatie nieuwe activatie merkers bij deze drie fluorochromen meest worden geconjugeerd met antilichamen tegen induceerbare merkers. Daarom is onze werkwijze niet alleen geschikt voor cocktail bereiding van bloed immunofenotypering maar is ook bruikbaar voor het kleuren van andere monsters zoals perifeer bloed mononucleaire cellen en cellen gewonnen uit gedifferentieerde weefsels (bijvoorbeeld tumor).
succesvolle introproductie van onze methode vergt speciale aandacht voor de stappen in laboratorium voorbereiding en programmering en uitvoering van de methode. Bereiding van de 2D-barcode buizen omvat labeling met leesbare labels en overdragen van de antilichamen aan de aangewezen buizen. Om de introductie van fouten te voorkomen, raden wij u dit te doen met twee mensen. Wanneer het veranderen van spreadsheets, moeten de onderzoekers nagaan of de methode goed werkt. Het kiezen van de juiste pipetteren methoden tijdens het programmeren zorgt voor succesvolle vloeistof-overdracht. LLS pipetteren maakt zonder dat neergeslagen vuil van de bodem van antilichaam buizen, waarvoor wij zowel P50 en P200 geleidende spuittips. LLS is misschien niet een goede optie voor P1000 tips als LLS is gevoeliger met P1000 tips en soms ten onrechte veroorzaakt door de aanwezigheid van bellen. Hoogtes labware definitie moet worden aangepast voor elk instrument optimaal vloeistoftransport kan optreden, bijvoorbeeld als er onvoldoende ruimte tussen de rand tipsen de onderste buizen. Zoals getoond in figuur 12, als de "Base Cocktail" en / of "Activation Cocktail" niet goed gewerveld, kan dit leiden tot suboptimale kleuring.
We dachten dat over het gebruik van gevriesdroogde reagentia voor cel kleuring als een alternatieve benadering van de variabiliteit in verband met reagens afgeven van 19 verminderen. Echter, polymeerconjugaten briljante violette kleurstoffen is bekend met elkaar waardoor niet-specifieke signalen. Als zodanig toevoegen van meer dan twee polymeer conjugaten (bijvoorbeeld BV421 en BV650 etc.) in gevriesdroogde reagentia kunnen niet-specifieke signalering veroorzaken (bijvoorbeeld toename van BV650 achtergrondsignaal in BV421 + populatie) 20. Bovendien gevriesdroogde reagentia missen flexibiliteit met nieuwe kleuring. Ze zijn meestal duurder en vereisen een massa-orders. Om die redenen hebben we ervoor gekozen om de geautomatiseerde vloeibare handler uitgerust met de 2D barcode buizen gebruiken. Hoewel het takes tijd op te zetten en brengt een investering vooraf om het instrument te kopen, op de lange termijn factoren zal worden gecompenseerd door de verhoogde productiviteit en reproduceerbaarheid van assays. Sterker nog, een paar groepen eerder gemeld de succesvolle integratie van de geautomatiseerde vloeibare handler in hun workflow van immuunfenotypering of soortgelijke toepassingen 21,22. Geautomatiseerde oplossingen voor flowcytometrie analyse zijn ook verkrijgbaar bij commerciële bronnen (FACS SPA III, Automated Cocktail Voorbereiding Workstation en FlowStainer). Dit wijst er verder een grote behoefte aan geautomatiseerde cocktail voorbereiding immunofenotypering.
Na beheersen deze techniek visualiseren we dat de ontwikkeling van volautomatische volbloed immunofenotypering verder zal verminderen experiment tot experiment variabiliteit en misschien volbloed immunofenotypering mogelijk zelfs in een multicenter klinische trial instellen 23 maken. We zijn al begonnen met behulp van een Lyse wash assistent van de lysis en wassen stappen te automatiseren. Wij voorzien dat automatische bepaling van de hoeveelheid van antilichaam in de 2D-barcode buizen en het volgen van afgifte reagens sterk verbetert inventaris van antilichamen en de kwaliteitscontrole van onze werkwijze, respectievelijk.
Disclosures
YK, ILG, TLM, WLM, DPH, en KSB: Geen concurrerende financiële belangen. ANT is een werknemer van Beckman Coulter, Inc Publicatie van deze video artikel gesponsord door Beckman Coulter
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 ml Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12 x 24 INCHES RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 ml Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1,025 µl | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µl (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10x Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1x, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
References
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S.
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
