Introduction
연령 관련 황반변 성 (AMD)는 50 ~ 3 세 이상의 개인 실명의 주요 원인 중 하나입니다. AMD는 두 가지 형태로 분류 할 수있다 : 위축성 ( "건조") AMD와 신생 혈관 ( "습식") AMD. 전자는 후자의 누설, 출혈 및 섬유증을 유발하는 외부 망막 층으로 맥락막에서 비정상적인 혈관의 침윤을 특징으로하면서, 망막 색소 상피 (RPE), 맥락막 모세, 감광체의 지리적 위축을 특징으로하고, 궁극적 실명 1,2 선도. 2 가지 형태로, 혈관 신생 AMD는 시력 상실 (1)의 대부분을 차지한다. 그것의 위축 대응은 의학적 치료 (3)을 입증 반면 다행히,이 형태는 다수의 효과적인 약물 관리 옵션이 없습니다. 신생 혈관은 쉽게 형태의 동물 모델에서 다시 항복되었으므로 더욱이, 그것은 기본적 접근에 더 넓게왔다소설 요법 (4)를 개발하기 위해 기본 병리학 적 메커니즘을 탐구 MD의 연구.
실험 맥락막 신생 혈관의 첫 번째 동물 모델은 라이언 등의 알에 의해 개발되었다. 인간이 아닌 영장류 5. 신생 혈관 AMD에서 본 것과 유사한 결과 혈관 로컬 염증 반응을 야기 광응고술 통해 부르크 막 파열이 모델 유도. 혈관 신생 후 레이저 유도의 조직 병리학 적 진행은 모델의 유효성 6 확인 신생 혈관 AMD를 모방 밝혀졌다. 비 - 인간 영장류는 인간과 가장 유사한 해부학을 제공하지만, 불행하게도, 유전자를 쉽게 조작 할 수 없으며, 유지 보수가 비싸고, 질병 진행 7 느린 시간 경과가있다. 이에 대해서, 설치류 모델은 훨씬 더 비용 효율적인 유지하기 위해 유전자 상대적으로 쉽게 조작 될 수 있고, 빠른 COU 많지질병 진행의 RSE (실험 대 주 개월의 시간 스케일로 수행 될 수있다). 이 알비노 동물 시각화하는 것은 매우 어렵다 이러한 실험은 착색 설치류에서 수행되어야한다.
처음 후반 90의 10 Campochiaro 그룹에 의해 개발 된 마우스 레이저 유도 CNV 모델은, 최근의 연구 11-16의 대부분의 지배적 인 동물 모델로 성장하고있다. 인해 CNV의 복잡하고 여전히 불분명 병인에, 레이저 모델은 장래의 사용을 위해 인간의 새로운 치료 방법을 평가하는 혈관 구동 분자 메커니즘을 연구에서부터 습식 AMD 연구의 모든면에 적용되어왔다. 예를 들어, 사쿠라이 등. 및 노사-Heidmann 등. 트랜스 제닉 마우스와 약리 플리먼트 (15, 16)을 사용하여 CNV의 개발에 대한 대 식세포의 효과를 조사하기 위하여 레이저 모델을 사용했다. GIANI 외. 및 Hoerster 등. 이미지에 사용되는 광 간섭 단층 촬영 (OCT) 레이저 유도 맥락막 신생 혈관의 진행을 특성화하고 OCT 이미징 12,17에 본 연구 결과에 병리 조직 학적 소견을 비교하기위한 노력의 일환으로 맥락막 신생 혈관. 마지막으로, 항 - 혈관 신생 제의 유리체 강내 주입과 관련된 연구는 인간의 임상 시험을위한 전제 조건으로 사용하고 신생 혈관 AMD 오늘 10,18,19의 관리에 사용되는 항 VEGF 제 1 세대의 개발에 매우 중요했다되었다.
실험 CNV의 대체 모델은 맥락막 신생 혈관을 유도하는 수술 방법을 사용합니다. 이 절차는 친 혈관 생성 물질을 주입하는 것을 포함 (VEGF 과발현 예 재조합 바이러스 벡터를, RPE 세포 및 / 또는 폴리스티렌 비드의 망막 하 주사) 혈관 8,20를 일으킬 목적으로, 신생 혈관 AMD에서 본 증가 VEGF 발현을 모방. 그러나이 방법은 신생 혈관의 대폭 낮은 발생률을 산출; 이러한 연구에서 그 CNV 나타났다C57 / BL6 마우스는 마우스 8, 14의 동일한 변형률에서 레이저 광응고술 방법에서 본 ~ 70 %의 성공률에 비해 주사의 31 %에서 발생한다. 이러한 이유로, 비 - 인간 영장류 대 설치류를 사용하는 장점을 주어, 레이저 - 유도 된 CNV의 마우스 모델은 대부분의 신생 혈관 AMD 연구 실험 8 CNV의 표준 동물 모델이되었다.
마우스의 눈은 작업 할 소문자, 섬세한 조직이다. 망막을 시각화 할 수있는 눈의 기동은 어렵고 숙달이 달성 될 때까지 많은 연습을 필요로한다. 이 작업이 우세 및 비 우세 손으로 학습해야한다는 사실에 의해 복잡하게된다. 망막을 시각화하는 세밀한 움직임을 알게 된 후에 또, 양손 및 레이저를 동작 풋 페달 사이의 조정은 중요하다. 본 논문에서는 레이저 유도 CNV의 PROC에 포함 된 물리적 조작의 모든 학습의 도전을 증류 모색운영자는이 모델 빠른 성공을 달성하는 데 유용한 가이드에 edure.
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Protocol
모든 동물은 실험 동물의 관리 및 사용 2013 에디션의 가이드에 따라 처리되며, 비전 및 안과 (ARVO) 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 문에 연구 협회 및 기관 동물에 의해 승인 관리 및 노스 웨스턴 대학에 대한 사용위원회.
참고 : 다음 절차는 하나의 연산자를 완전히 수행 할 수 있습니다; 따라서 작업으로 분할하지만, 훨씬 더 효율적 개의 연산자를 행한다.
1. 레이저 및 사전 레이저 역을 준비
- 쉽게 접근 할 수있는 레이저와 슬릿 램프를 배치합니다. 레이저의 전원을 켜고 설정 매개 변수를 미리 결정 (예 : 75 μm의 스폿 사이즈, 100 mW의 전력을 100 밀리 초 시간).
주의 : 확인 운영자는 모든 동물과 레이저 안전 개인용 보호 장비는 적절한 레이저 안전 표지판 절차 룸의 외부에 표시됩니다 착용.- 모든 실험 동물을 사용하기 전에, 교정, 비 실험 마우스를 사용하여 최적 매개 변수를 찾을 수 있습니다. 레이저 매개 변수는 사용 된 레이저에 의존 할 것이다. 이상적인 매개 변수가 초점이 때 지속적으로 "거품"형성을 일으키는 가장 낮은 레이저 출력 설정에 의해 정의된다. 적절한 "거품"형성 병변의 예를 들어 비디오를 참조하십시오.
- 마취, 따뜻한 동물, 조직 와이프, 모든 안약 (Tropicamide, tetracaine에, 인공 눈물) 연산자로 이동할 쉽게 있도록 사전 레이저 스테이션을 준비합니다.
- 그 동물이 따뜻한 확인하는 것은 마취 유도 저체온증을 방지하기 위해 최초의 마우스에 마취제를 주입하기 전에 온도 (37 ° C)를 해결하기 위해 예열.
- 이 열을 유지하고 레이저 절차가 시작되면 따뜻한 상태를 유지할 수 있도록 따뜻한 마우스 단계를 놓습니다.
2. 마우스를 마취하고 사전 레이저 준비
- 분사하기 전에마취를 보내고,이 더 기형 또는 각막 투명도 (예 : 백내장을) 감소 이상이 없는지 확인하기 위해 거시적으로 눈을 검사합니다.
- 마우스의 무게를.
- 기록 체중, 성별, 동물 ID 번호.
- 20g의 마우스 0.20 mL의 자일 라진 / 케타민 칵테일 주입 중량을 사용하여 마취 적당량 계산은, 10 밀리그램 / kg 자일 라진 OR tribromoethanol 250 밀리그램 / kg (예를 들어 100 ㎎ / ㎏의 케타민 히드로 클로라이드 기관이 소정 기준에 기초하여 사용될 tribromoethanol의 0.25 mL)을 첨가 하였다. 수학적인 에러를 감소시키기 위하여 1g의 단위 중량 당 미리 계산 된 용량의 테이블을 갖는다.
- 목덜미 마우스와 주사 마취는 복강 단계 2.4에서 계산을 기반으로.
- 따뜻한 동물에 마우스를 놓고 마우스가 완전히 발가락 핀치 (약 3-5 분)을 통해 페달 반사를 확인하여 마취 될 때까지 기다립니다.
- 닦아 조직을 롤과 aspirat을 방지하기 위해 마우스의 코 지역을 보호액체 롤 - 오프의 이온. 롤 옆에 마우스와 국소 마취에 대한 각각의 눈에 tetracaine에 염산염의 드롭 (약 30 μL)를 배치합니다. 솔루션을 적용하려면 2 분을 기다립니다.
- 동공 팽창에 대한 국소 Tropicamide 한 방울과 단계를 반복 2.7. 또한, 팽창에 대한 페닐 하이드로 클로라이드 (2.5 %)를 사용합니다.
- 솔루션을 적용하려면 2 분을 기다립니다; 이 시간 동안 따뜻한에 동물을 유지합니다.
- 적절한 시간이 경과 한 후, 신속하게 마우스 무대에 마우스를 놓고 슬릿 램프의 턱 받침대의 단계를 놓습니다.
- 가장 낮은 빛의 밝기에 슬릿 램프를 켜고 동공 팽창의 정도를 확인합니다. 학생이 적절하게 (약 2.5-3 mm)를 넓혀되지 않은 경우, 따뜻한 동물에 마우스를 반환하고 기다립니다. 또한, Tropicamide의 또 다른 드롭을 관리 할 수 있습니다. 눈이 충분히 팽창되면, 레이저 절차로 이동합니다.
3. 레이저 절차
참고 : 다른 페이지를 확인ersons 방에 레이저 보호 슬릿 램프 눈 조각에서 떨어져있을 때, 보호 안경을 착용
- 이 이상적으로 시신경의 시각화 (3.1.2 참조) 위치하도록, 마우스 무대에서 마우스의 위치를 조정합니다.
- 이 수평으로 놓여 있으므로 다른의 한쪽에 머리와 꼬리, 램프 빔을 슬릿에 수직 홀더에 마우스의 방향. 이상적인 마우스 위치는 커버 슬립이 적용되면 훨씬 쉽게 시신경 시각화를 만들 것입니다.
- 그것은 가까운 레이저 운영자에 머리 ~ 170 °의 각도로 약간 마우스를 켭니다.
- 이 안정적이고 어디 작업자의 손이 미세 조작을위한 충분한 공간이있는 것입니다 위치에 여전히 램프 슬릿, 아직 할 수로 그 마우스가 가까이 있는지 확인하십시오.
- 마우스가 이상적으로 배치 된 후, 25mm X 25mm 유리 커버 슬립에 인공 눈물 용액 한 방울을 놓는다.
- 마우스의 OPP에 인공 눈물 용액 한 방울을 배치osite 눈 -이 보장합니다 눈은 수화 도움 지연 백내장 형성된다.
- 엄지와 포인터 손가락 사이에 커버 슬립의 모서리를 잡고; 위치는되도록 유리는 두 손가락의 끝 사이에 압착된다.
- 부드럽게 지원과 손 안정화를위한 동물의 몸 주위에 나머지 세 손가락을 감싸. 손 위치되도록 유리 커버 슬립이 쉽게 마우스의 눈에 위치 될 수있다.
- 손목이 손 떨림을 줄이기 위해 회사 표면에 안정되어 있는지 확인합니다.
- 안정된 위치가 획득되면, 조심스럽게 마우스의 눈 위에 (여전히 부착 된 인공 눈물 방울) 유리 커버 슬립을 누릅니다.
- 커버 슬립은 레이저 광의 산란이나 반사를 방지하기 위하여, 레이저 빔에 가능한 한 수직으로 위치 확인. 커버 슬립은 각막을 평탄화하기위한 콘택트 렌즈로서 작용한다.
- 토글 UNT 초점 슬릿 램프를 통해 무료 손으로 봐김정일 망막이 가시화 될 수있다. 망막은 시각 위치에 따라 빛 - 노란색 / 붉은 색이있을 것이다, 별개의, 빨간 혈관이 표시됩니다.
- 천천히 조심스럽게 시신경을 시각화 할 때까지 마우스 헤드 및 / 또는 커버 슬립을 조작 할 수 있습니다. 시신경은 그것에서 방사 복수의 용기와 색상에 노란색이 될 것입니다.
- 운영자가 시신경의 시각화를 확인하면, 빔을 초점 레이저를 켭니다.
- 레이저 빔이 온되면, 원하는 위치 (시신경으로부터 약 1 디스크 직경) 레이저 빔을 집속 기동.
- 안저의 망막 색소 상피에 레이저 빔을 초점을 맞 춥니 다. 적절한 초점이 선명하고 깨끗한 레이저 빔을함으로써 달성된다. 빔을 목표로하는 슬릿 램프 초점 또는 재 위치 유리 커버 슬립 토글, 타원형 또는 초점이 보이는 경우.
- 조준 된 빔은 RPE에 집중되면, 레이저의 발 트리거를 사용하여 레이저 투여를 시작.
- 안내를 방지하기 위해 망막 혈관을 방지하기 위해 반드시 그가morrhage.
- 바로 레이저 투여 후 거품의 모양을 살펴보십시오. 레이저 총의 윤곽이 분명하고 어떤 방식으로 흐릿한되지해야합니다.
- 레이저 총은 거품 형성을 초래하지 않는 경우, 또는 영향 지역 (대 성공적인 영향을 명확하고 선명하게 정의 경계 잘못 정의 된 원형 테두리 흐린 모양) 헷갈리는 보이는, 또는 출혈이 레이저 투여 후 볼 경우,하지 마십시오 미래 분석이 병변을 포함한다.
- 반복 원하는 모든 맥락막 신생 혈관의 위치에 대한 3.10-3.12 (보통 3에서, 6, 9, 및 시신경 주위에 12시 위치) 단계를 반복합니다. 레이저 입회식이 시신경으로부터 약 같은 거리에 적용하는 경우, 재조명이 필요는 없습니다. 그러나, 망막에 존재할 수있는 빔을 재조명하는 연속 레이저 주관청 간의 필요할 수 있습니다 마우스 눈과 작은 변화의 강한 곡률에.
- 노트북의 위치와 전자의 결과의 기록ACH 레이저 샷 관리 및 결과 (성공, 흐릿한, 출혈, 등.) 눈에 대한 각 투여 샷. 사용하지 않을 때는 대기 모드에서 레이저를 배치해야합니다.
- 필요한 경우 안정화 및 새로운 coverslip에 대한 반대 손을 사용하여, 마우스의 다른 눈에 대한 3.1-3.14를 반복합니다.
- 원하는 모든 레이저 주사 투여 한 후, 레이저를 끄고 슬릿 램프.
- 마취에서 회복을위한 따뜻한에 커버 슬립과 장소 마우스를 폐기하십시오. 거시적으로 상해에 대해서는 눈을 검사하고 수화 눈을 유지하고 잠재적으로 미래 백내장 개발을 방지하기 위해 인공 눈물 액 한 방울을 배치합니다. 마우스가 마취에서 회복되면, 케이지로 돌아갑니다.
| AVERTIN | AVERTIN | AVERTIN | XYL / KET | XYL / KET | |
| 마우스 중량 (g) | 투여 량 (㎎ / ㎏) | 마취 용량 (㎖) | 투여 량 (㎎ / ㎏) | 마취 용량 (㎖) | |
| (15) | (250) | (20) | 0.1875 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.15 |
| (16) | (250) | (20) | 0.2 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.16 |
| (17) | (250) | (20) | 0.2125 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.17 |
| (18) | (250) | (20) | 0.225 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.18 |
| (19) | (250) | (20) | 0.2375 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.19 |
| (20) | (250) | (20) | 0.25 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.2 |
| (21) | (250) | (20) | 0.2625 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.21 |
| (22) | (250) | (20) | 0.275 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.22 |
| (23) | (250) | (20) | 0.2875 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.23 |
| (24) | (250) | (20) | 0.3 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.24 |
| (25) | (250) | (20) | 0.3125 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.25 |
| (26) | (250) | (20) | 0.325 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.26 |
| (27) | (250) | 0.3375 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.27 | |
| (28) | (250) | (20) | 0.35 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.28 |
| (29) | (250) | (20) | 0.3625 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.29 |
| (30) | (250) | (20) | 0.375 | 100 mg을 / 케타민을 kg; 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 | 0.3 |
표 1 : XyIKet 복용량 차트.
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Representative Results
맥락막 신생 혈관 병변의 정량화는 맥락막 신생 혈관에 라벨을 면역 형광 염색법을 사용하여 평면에 장착 된 맥락막의 분석을 통해 수행 할 수 있습니다. 조직 준비의 두 가지 가장 자주 사용되는 방법은 바로 내피 세포 마커와 동물의 희생, 또는 사후 면역 염색하기 전에 관류를 통해 수행 FITC-덱스 트란 라벨입니다. 두 방법 모두에서 상세히 13,14,21 전술 한 각각 각 1 및도 2의 실시 예를 도시한다. 공 촛점 현미경 이미지 획득, 어느 영역 (2 차원으로) 또는 볼륨 후 (3 차원)을 산출 할 수 있으며, 소프트웨어 또는 ImageJ에 Volocity 가시화. 정량화 외에도 간섭 단층 촬영은 생체 내에서 CNV 병변을 시각화 할 수있다. 얻어진 CNV와 망막의 단면 영상의 예는도 3에 도시된다.
LT = "그림 1"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 53502 / 53502fig1.jpg"/>
그림 1 :. 맥락막 신생 혈관 관류 염색 및 면적 (2D) 계산 예 (25X) (A) FITC 덱스 트란은 맥락막 신생 혈관 병변을 관류. 임계 값을 통해 (B) ImageJ에 지역 정량 방법. 마우스 스트레인 :. C57BL / 6J 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 맥락막 신생 혈관 면역 염색 및 볼륨 (3D) 계산 예 (25X) (A) 동종 렉틴 GS-IB4 스테인드 맥락막 신생 혈관 병변.. 얼굴보기 엔 맥락막 신생 혈관 병변의 (B)의 3 차원 복원. (C) 3 차원 복원 측면보기 (B와 C 하나의 타일 폭 = 35 μm의). 마우스 스트레인 : C57BL / 6J.g2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. OCT 횡단면 맥락막 신생 혈관의 시각화 () 월 맥락막 신생 혈관 병변의 얼굴보기 엔. (B) 맥락막 신생 혈관과 망막의 10월 단면 B-스캔은 노란색으로 동그라미. 마우스 스트레인 :. C57BL / 6J 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
성공적인 레이저 유도 한 후 레이저 배달 및 결과 맥락막 신생 혈관 병변의 개발에 영향을 미칠 수있는 여러 요인이있다. 이러한 요소에 대한 제어 및 가장 신뢰할 수있는 결과를 위해 표준화되어야한다. 이들 인자의 대부분은 마우스 적절한 선택 (유전자형, 연령, 성별), 마취제 선택, 레이저를 설정한다.
사용 된 특정 마우스 CNV 모델 개발 과정에 상당한 영향을 미칠 수있다. 가장 널리 사용되는 유전자형은 C57BL / 6 마우스이다. 동물로부터 수득 된 벤더 얻어진 CNV의 크기에 영향을 미칠 수있다. 불량 등은. 다른 두 업체 4보다 훨씬 더 큰 맥락막 신생 혈관을 개발하는 타 코닉에서 마우스와 잭슨, 찰스 강, 그리고 타 코닉 실험실에서 C57BL / 6 마우스의 최종 맥락막 신생 혈관 병변의 크기가 유의 한 차이를 보여 주었다. 따라서, 한 회사에서 구매와 같은 공급 업체의 모든 마우스를 사용하여 외부의 차이를 최소화하는 데 도움이 될 것입니다CNV 병변 크기. 연령 및 성별의 마우스는 실험을 설계 할 때 고려해야 할 중요한 인자로 밝혀졌다. 여성 마우스는 같은 나이의 남성 쥐보다 더 많은 CNV를 개발하고, 남녀 모두의 이전 마우스는 젊은 쥐 22, 23보다 더 맥락막 신생 혈관을 개발한다. 실험 매개 변수에 따라, 운영자는 마음에 이러한 요소를 유지해야합니다. 운영자가 기계적 및 약물 개발의 목적을 명료하게 레이저 CNV 절차를 사용하는 경우 예를 들어, 다른 연령대에서 남녀는 성별과하지 않은 것들에 고유 한 메커니즘을 정의하는 데 사용되어야한다.
적절한 마취 특히 학습 과정에서,이 절차에 대한 중요한 단계이다. 대부분의 IACUC 승인 요법은 절차를 숙달 된 후에 각각의 눈에 4-5 레이저 샷을 제공 할 수있는 충분한 시간보다 적어도 15 ~ 30 분 동안 마취를 유도 할 수있다. 그러나, 너무 많은 시간이 경과하면, 마취 가역 렌즈 혼탁, 다시 발생할 수 있습니다실험 CNV (24) 광학적으로 불 투과성 눈을 ndering. 마취를 유도하는 데 사용되는 두 가지 프로토콜은 자일 라진 / 케타민 칵테일 또는 tribromoethanol (TBE)를 복강 전달됩니다. 일부 리포트 모두, 백내장 형성의 관점에서 자일 라진 / 케타민으로 TBE의 장점을 단정 비록 조작자가 신속하게 (14)이 작동하지 않는 경우 결국 흐린 렌즈의 개발을 초래한다. 백내장 개발 전에 시간을 연장하는 한 가지 방법은 인공 눈물 (25)의 적용을 통해, 상세한 프로토콜에서 언급 한 바와 같이, 눈의 수분을 유지하는 것이다. 이 방법에 관계없이 사용되는 마취제 물질, 백내장 형성을 지연하고 그 오퍼레이터에게 절차를 완료하기 위해 더 많은 시간을 제공한다.
레이저 설정 CNV의 안정적인 유도에 중요한 요인이 될 수있다. 교정 레이저 전력과 지속 시간은 실험 동물의 절차를 수행하기 전에 예비 중요한 단계이다. 레이저 샷거품 형성없이 유발 출혈 또는 초점이 맞지 않는이 CNV 개발 프로세스를 방해 같이 계산에서 제외한다. 복수의 용기는 확산 출혈 파열을 야기하는 경우, 전체의 눈은 제외한다. 이상적으로, 지속적으로 명확한 경계와 거품 형성과 병변의 원인이 브루흐의 막을 파열 최저 전력 및 레이저의 짧은 기간은 4를 사용하여야한다. 다른 전원 설정을 실험 프로토콜 과도한 조직 손상 및 맥락막 신생 혈관 형성 (4), 14,17의 이후에 더 낮은 요금에 그 증가 된 전력 및 기간의 우위를 증명하고있다. 또한, 레이저 손상의 위치는 CNV 발달에 영향을 미칠 수있다. 영향은 멀리 23 <1 DD 또는 2 이상의 DD를 전달보다 상당히 큰 지역 맥락막 신생 혈관의 볼륨을 산출 광학 디스크에서 약 1 디스크 직경 (DD)를 전달했다. 후 레이저 분석에 따라, 병변의 위치 또는 중요하지 않을 수 있습니다. 예를 들면,간섭 단층 화상 모든 병변 얻어지는 경우, 시신경 주위의 중심 위치는 매우 중요하다. 병변 평 마운트를 통해 분석 할 경우 이에 대해서, 병변의 위치는 중요하지 않다. 마지막으로, 마지막 촬영이 서로 또는 다른 두 병변이 함께 "성장"수에 너무 가까이 배치되지 않도록.
CNV 분석은 실험적으로 신생 혈관의 AMD를 연구하는 강력한 방법이다. 레이저 유도에 의한 혈관 신생은 인간의 AMD 환자에서 관찰되는 혈관 신생에 위치와 전체적인 모양에서 유사하다. 그러나, 지금까지 완벽한 모델이다. 인간의 눈과 달리 마우스 황반 정의되어 있지 않으며, 레이저 - 유도 된 CNV 모델에서 보이는 급성 손상과 관련된 혈관 근본적 AMD 7,8,14의 유 전적으로 영향 만성 병태 다르다. 마우스 망막 환경 건강 및 혈관 생성은 레이저 충격,보다 오히려 유전 / K에 의한 외상에 대한 반응으로서 발생할인간의 AMD와 같이 지역학 요인과 나이,. 이에 대해서, AMD에서 인간의 망막 환경은 VEGF 발현과 맥락막 신생 혈관 (3) 원인 다른 사이토 카인의 이상 동안 만성 염증의 상태에있다. 분명,이 두 환경에서 신생 혈관 개발은 현저하게 다르다.
결론적으로, 레이저 - 유도 된 CNV 프로토콜은 초기에 수행 어렵지만 마스터 궁극적 보람이다. 마우스 및 커버 슬립을 유지뿐만 아니라 시신경을 시각화 커버 슬립 마우스 헤드를 조작하기 위해 필요한 미세 손재주은 연산자의 하나의 손을 사용하여 잘 수행 될 필요 특히 이후 인내와 연습이 필요 운동이다. 그러나, 기술은 알게되면 그것은 실험 CNV 구현하는 효율적인 방법 일 수 있으며, 신생 혈관 AMD 연구의 대부분의 측면에 적용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% Tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% Tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 G insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
References
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