En musemodell for Laser-indusert Koroidal neovascularization

Introduction

Aldersrelatert macula degenerasjon (AMD) er en av de viktigste årsakene til blindhet hos personer over 50 år ^1-3. AMD kan klassifiseres i to former: atrofisk ("tørke") AMD og neovaskulært ("våt") AMD. Den førstnevnte er karakterisert ved geografisk atrofi av retinal pigment epitel (RPE), choriocapillaris og fotoreseptorer, mens sistnevnte er karakterisert ved invasjon av unormale fartøyer fra årehinnen i de ytre retinale sjikt forårsaker lekkasje, blødning, og fibrose, og i siste instans fører til blindhet ^1,2. Av de to formene, står neovaskulær AMD for flertallet av synstap ^en. Heldigvis har denne formen mange effektive farmakologiske behandlingsalternativer, mens dens atrofisk motpart har i dag ingen dokumentert medisinsk behandling ^3. Videre fordi neovaskulært skjemaet er lett re-kapitulerte i en dyremodell, har det vært mer allment tilgjengelig for enkel AMD forskning utforsker de underliggende patologiske mekanismer for å utvikle nye behandlingsformer ^4.

Den første dyremodell for eksperimentell koroidal neovaskularisering (CNV) ble utviklet av Ryan et al. i ikke-humane primater ^5. Denne modellen indusert ruptur av Bruch membran via laser fotokoagulasjon, noe som forårsaket en lokal betennelsesreaksjon som resulterer i angiogenese lik den man ser i neovaskulært AMD. Den histopatologiske progresjon av angiogenese post-laser induksjon ble funnet å etterligne neovaskulær AMD, som bekreftet modellens gyldighet ^6. Ikke-menneskelige primater tilby den mest lik anatomi for mennesker, men dessverre er dyre å vedlikeholde, kan ikke være lett genetisk manipulert, og har en langsom tid løpet av sykdomsprogresjon ^7. Contrastingly, gnager modeller er mye mer kostnadseffektivt å vedlikeholde, være kan genetisk manipulert med relativ letthet, og har en mye raskere couRSE av sykdomsprogresjon (eksperimenter kan bli gjennomført på en tidsskala uker versus måneder). Disse forsøk bør kun utføres i pigmenterte gnagere som det er svært vanskelig å visualisere i albino dyr.

Musen laser-indusert CNV modell, først utviklet av Campochiaro gruppen i slutten av ^90-10, har vokst til å bli den dominerende dyremodell i de fleste nyere studier ^11-16. På grunn av den komplekse og fortsatt uklart patogenesen av CNV, har laser-modellen blitt brukt i alle aspekter av våt AMD forskning spenner fra å studere de molekylære mekanismene som driver angiogenese å vurdere nye behandlingsmetoder for fremtidig bruk på mennesker. For eksempel, Sakurai et al. og Espinosa-Heidmann et al. benyttes lasermodell for å undersøke effekten av makrofager på utviklingen av CNV ved hjelp av transgene mus og farmakologiske behandlinger utarming ^{15, 16.} Giani et al. og Hoerster m.fl.. brukte optisk koherens tomografi (OCT) for å avbilde laser-indusert CNV i et forsøk på å karakterisere utviklingen av CNV og sammenligne histopatologiske funn til funnene sett den okt bildebehandling ^12,17. Endelig har studier med intravitreal injeksjon av antiangiogene midler blitt brukt som forutsetninger for menneskelige forsøk og var avgjørende i utviklingen av første generasjon av anti-VEGF midler som brukes i forvaltningen av neovaskulært AMD i dag ^10,18,19.

Alternative modeller for eksperimentell CNV utnytte kirurgiske metoder for å indusere CNV. Denne prosedyren innebærer injisere pro-angiogeniske stoffer (f.eks rekombinante virale vektorer overekspresjon VEGF, subretinal injeksjon av RPE celler og / eller isopor perler) for å etterligne den økte VEGF uttrykk sett i neovaskulært AMD, med mål om å forårsake angiogenese ^8,20. Imidlertid gir denne fremgangsmåte en drastisk lavere forekomst av neovaskularisering; Disse studier viste at i CNVC57 / BL6-mus forekommer i 31% av injeksjonene versus ~ 70% suksessrate sett i laser fotokoagulasjon metoden i samme stamme av mus ^8,14. Av disse grunner, og gitt fordelene ved å bruke gnagere versus ikke-menneskelige primater, har musemodell for laser-indusert CNV blitt standard dyremodell av CNV for de fleste våt AMD læreforsøk ^8.

Musen øyet er en miniscule, delikat vev å jobbe med. Manøvrering av øyet å visualisere netthinnen er vanskelig og krever mye praksis før mestring er oppnådd. Denne oppgaven blir komplisert ved det faktum at det må læres med den dominerende og ikke-dominerende hånd. Videre, etter de fine bevegelser som kreves for å visualisere netthinnen har lært, koordinering mellom begge hender og fotpedalen operere laseren er viktige. I denne artikkelen har vi ønsket å destillere utfordringene med å lære alle de fysiske manipulasjoner involvert i laser-indusert CNV procedure inn en guide som ville hjelpe operatører oppnå rask suksess med denne modellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm (green) argon ophthalmic laser	IRIDEX	GLx	any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lamp	Carl Zeiss	30SL-M	any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanol	Sigma	T48402-25G	used to make anesthetic
tert-amyl alcohol	Sigma	152463-1L	used to make anesthetic
amber glass vials + septa	Wheaton	WH-223696	tribromoethanol storage
tissue wipes	VWR	82003-820	miscellaneous
1% Tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	pupillary dilation
0.5% Tetracaine hydrochloride	Alcon	0065-0741-12	topical anesthesia
artificial tears	Alcon	58768-788-25	hydration
heat therapy pump (for animal warming)	Kent Scientific	HTP-1500	used to maintain animal body temp
warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510EA	maintains animal body temperature
30 G insulin needles	BD	328418	IP anesthesia injection
scale	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	mouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	flatten cornea to visualize mouse retina
xylazine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
ketamine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
Volocity	PerkinElmer		used for volumetric re-construction
ImageJ	National Institutes of Health		used for image analysis