O trabalho proposto avalia o potencial de diagnóstico de superfície de ressonância de plasmon de imagem directa e amplificado (SPRI) ensaios, particularmente para a detecção da hormona de crescimento humana recombinante em soro humano cravada, comparando SPRI resulta directamente com comercialmente disponíveis de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) kit.
Métodos sensível e selectivo para a detecção da hormona do crescimento humana (hGH) ao longo de uma vasta gama de concentrações (níveis elevados de 50-100 ng ml – 1 e níveis mínimos de 0,03 ng ml – 1) no sangue circulante são essenciais como níveis variáveis possam indicam fisiologia alterada. Por exemplo, perturbações do crescimento ocorrendo na infância pode ser diagnosticada através da medição dos níveis de hGH no sangue. Além disso, o uso indevido de hGH recombinante no esporte não só coloca uma questão ética também apresenta sérias ameaças para a saúde do abusador. Uma estratégia popular para a medição de hGH uso indevido, baseia-se na detecção da relação de 22 kDa hGH e hGH total, os níveis endógenos de 22 kDa não cair depois de hGH (rhGH) administração recombinante exógena. Superfície de ressonância de plasma de imagem (SPRI) é uma ferramenta analítica que permite o monitoramento e visualização de interações biomoleculares direto (sem rótulo) através da gravação de alterações da ind refraçãoex adjacente à superfície do sensor em tempo real. Em contraste, o método colorimétrico mais frequentemente utilizados, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) utiliza anticorpos de detecção marcado enzimaticamente para medir indirectamente a concentração do analito após a adição de um substrato que induz uma alteração de cor. Para aumentar a sensibilidade de detecção, amplificado SPRI usa um formato de ensaio sanduíche e infravermelho próximo pontos quânticos (QDs) para aumentar a força do sinal. Após a detecção direta da SPRI recombinante rhGH no soro humano espetado, o sinal SPRI é amplificado pela injeção sequencial de anticorpo de detecção revestido com infravermelho próximo QDs (Nano-SPRI). Neste estudo, o potencial de diagnóstico de SPRI directa e amplificado foi avaliada para medir o rhGH cravado no soro humano e comparado directamente com as capacidades de um kit de ELISA comercialmente disponível.
Hormona de crescimento humano (HGH) é um péptido de 191 aminoácidos (22 kDa) produzida pela glândula pituitária e libertado directamente para a corrente sanguínea. As interações entre o eixo hipotálamo crescimento peptídeo liberador do hormônio hormônio (GHRH) e somatotropina induzir secreções pulsátil de hGH. Como resultado, os níveis de hGH pode variar de elevações nas 50-100 ng / ml a baixos na gama de 0,03 ng / ml 1. A deficiência ou o excesso de hGH no corpo pode provocar uma vasta gama de sintomas fisiológicos anormais. Por exemplo, os níveis de excesso de hGH pode levar à diabetes e gigantismo 2 3. Empobrecido níveis de hGH causar baixa de açúcar no sangue em recém-nascidos, e fraca densidade óssea e depressão em adultos 4.
A administração da forma de hGH recombinante (rhGH) melhora a massa muscular magra, enquanto a redução da gordura corporal. Como tal, esta substância se tornou a droga de escolha para atletas profissionais e amadores, uma vez que melhora a força física que confere um advantage em esportes competitivos. rhGH é proibida pela Agência Mundial Antidoping (WADA) 5,6 e muito esforço por pesquisadores internacionais tem sido focada em desenvolvimento de testes que podem detectar a sua presença ou efeito anabólico.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tem sido o método preferido para a determinação da hGH no sangue total 7. Embora, ELISA é uma técnica confiável oferecendo boa sensibilidade e seletividade, é relativamente tempo e mão de obra intensiva. Em adição, a ELISA se baseia na detecção indirecta de hGH através do emprego de etiquetas enzimáticas. Em contraste, a ressonância de plasmon de superfície (SPR) permite a detecção de hGH directamente sem o uso de etiquetas em tempo real. O princípio de detecção de SPR por trás envolve uma superfície de detecção constituído por um prisma que está revestido com uma camada fina de metal (ouro ou prata); quando uma luz monocromática polarizada interage com a superfície metálica, "plasmons de superfície" são gerados. A ligação de um analitoa um receptor de superfície imobilizada na superfície do metal perturba as condições de ressonância, resultando em um mergulho de ressonância deslocada, que pode então ser correlacionado com a concentração do analito. Biosensores baseados em SPR agora estão comercialmente disponíveis que oferecem um real-time, técnica livre etiqueta para monitorar os eventos de ligação biomoleculares e reações bioquímicas 8-10. Mais recentemente, SPRI foi desenvolvido em resposta à necessidade de multiplexação (ou seja, monitorando simultaneamente múltiplos eventos de ligação), o que não era possível em biossensores SPR clássicos. Assim, SPRI tem emergido como uma ferramenta para monitorar vários eventos de ligação simultaneamente. SPRI sistemas atuais são baseados em imagens microscópicas de uma superfície que é excitada com luz em um ângulo de 10 e comprimento de onda específico. A imagem é, então, capturado num dispositivo (CCD) matriz de acoplamento de carga.
Até à data, tem havido poucos ensaios baseados em SPR desenvolvidos para detectar hGH 11-14. Uma estratégia particular, Conhecido como o método de isoforma 15, baseia-se na detecção da relação de 22 kDa hGH e hGH total, os níveis endógenos não-22 kDa cair após a administração exógena de rhGH. Recentemente, de Juan-Franco et ai. Em 11 relataram o desenvolvimento de um imunossensor baseado em SPR para a detecção selectiva da 22 kDa e 20 kDa isoformas da hGH em amostras de soro humano. Os anticorpos monoclonais específicos para cada uma das isoformas foram imobilizadas directamente sobre o sensor ouro permitindo a medição de ambas as isoformas simultaneamente numa única injecção com um limite de detecção de 0,9 ng mL -1. Alternativamente, SPR tem sido utilizado para rastrear anticorpos com especificidade elevada para a hGH 13. Se a concentração do analito alvo desce abaixo do limite do sistema SPRI de detecção (<nM), tem de se recorrer a amplificação do sinal SPRI através da utilização de nanopartículas (Nano-SPRI). Amplificação com base em SPR Tal tem sido bem documentada na literatura 16-19 para vIVERSOS tipos de analitos e superfícies.
Neste trabalho, o potencial de análise de biossensores baseados SPRI e Nano-SPRI foi examinada, em particular para a detecção de rhGH no soro humano cravado, e comparação da sua capacidade de detecção de ELISA directa. Os seguintes parâmetros serão examinados e considerados: tempo de detecção, sensibilidade, perfil cinético, reprodutibilidade e especificidade.
Níveis irregulares de hGH, uma hormona que ocorre naturalmente, tem sido associada a numerosas desordens médicas que afectam o crescimento e desenvolvimento humano. Além disso, a administração exógena de rhGH é normalmente utilizado por atletas, embora seja proibido, tal como um agente de dopagem para aumentar o seu desempenho. Desafios na detecção de resultado utilização indevida rhGH da dificuldade em distinguir exógena hGH de forma endógena. Como tal, a técnica actual aprovado para a detecção de hGH exógena baseia-se na medição da relação entre a hGH de 22 kDa isoforma em relação à isoforma de 20 kDa. Desde as demandas de teste isoform para a medição de múltiplos hGH isoformas simultaneamente dentro de um curto período de tempo em uma ampla gama de concentrações, por isso, considerou-se a plataforma de SPRI como uma combinação perfeita. Além disso, o nível de hGH endógena flutuar a um nível muito baixo (0,03 ng / ml) na corrente sanguínea, por conseguinte, o sistema de detecção deve ser capaz de medir esta gama confortavelmente com alta specificity. Como resultado, nós também investigada neste estudo o potencial de Nano-SPRI como uma ferramenta de diagnóstico para hGH e comparou-o diretamente com SPRI e imunoensaio ELISA clássico.
Com base nos resultados obtidos a partir deste estudo, a principal vantagem do método SPRI e Nano-SPRI é que as concentrações de rhGH pode ser medido de uma forma mais rápida em comparação com o método mais convencional de ELISA. A duração padrão para medição dos níveis de rhGH em uma amostra com o método directo de detecção era de 1 hr ao passo que o nano-SPRI necessário 2 h, devido aos passos adicionais no processo. Em geral, as experiências com SPRI e Nano-SPRI, antes da injecção de uma amostra, um passo de calibração é altamente recomendável. Além disso, a injecção de uma amostra em bruto como resultados de soro humano em algumas interacções não específicas, como resultado, é imperativo para injectar um tampão de lavagem a alta sal só revelam interacções específicas. Também é importante notar que uma etapa de lavagem é absolutamente necessárioapós a introdução de moléculas de bloqueio para a superfície do sensor, para remover moléculas não ligadas. Tal como para os requisitos de tempo de ELISA são muito maiores (~ 16-18 h) para a análise de uma amostra. É necessário um tempo de incubação mais longo como a sensibilidade do ensaio é aumentada especialmente para este estudo, como o foco foi comparar o limite inferior de detecção.
A escolha de uma química de superfície pode variar de uma aplicação para outra e isto poderia ser realizado como uma limitação da técnica da SPRI. Neste estudo, uma ampla gama de ligantes e combinação de produtos químicos e as moléculas de bloqueio foram avaliadas para conseguir a combinação direita, a fim de observar a eficiência de ligação óptima de rhGH à superfície do sensor. Por exemplo, no presente estudo, a combinação de BSA e PEG serviu também para minimizar interacções não específicas. No entanto, num estudo anterior 17, em que o ligando de captura era um aptâmeros, PEG sozinho serviram como o melhor molécula de bloqueio. As variáveisque afectam a eficiência de ligação do analito ao ligando também é dependente do pH, tampão e temperatura. Portanto, com qualquer aplicativo, essas variáveis precisam ser otimizados. Além disso, é crítico para determinar a concentração óptima de mancha do ligando à superfície do chip. Uma experiência de titulação com uma gama de concentrações de ligandos imobilizados é realizado antes de se iniciar o estudo. Quanto ELISA, uma etapa crucial no procedimento foi a decantar o tampão de lavagem dos poços batendo a microplaca como esta garantida nenhum líquido residual é sobra. Remover o tampão de lavagem com pipeta não foi suficiente como qualquer líquido residual interferiu com a leitura do sinal da amostra-alvo.
Em referência à sensibilidade, ELISA (1 ng / ml) é comparável à SPRI (3,61 ng / ml) mas nano-SPRI (9,20 pg / ml) melhora a sensibilidade por três ordens de magnitude, permitindo assim medições nos níveis biológicos inferiores de rhGH 0,03 ng / mL. Como já relatado anteriormente 16,17, o aumento do sinal transmitido pelo NanoEnhancers é atribuída a um efeito de carga em massa e o forte acoplamento que existe entre fluorophores NIR e propagando os plasmons de superfície para nanoestruturas película de ouro. Mesmo assim, Nano-SPRI adiciona um passo extra para o procedimento, este nível de sensibilidade pode alargar as aplicações da tecnologia SPRI em vários pontos de venda.
SPRI proporciona aos cientistas um perfil completo cinética (K D, K e um K d) do anticorpo interação / rhGH Considerando ELISA pode relatar apenas os valores de afinidade. O coeficiente de variação (CV) foi inferior a 10% para SPRI (4,1%) e ELISA (6,5%), sugerindo boa reprodutibilidade. Os valores de afinidade e ELISA SPRI são diferentes porque os anticorpos de captura imobilizadas no chip do sensor são diferentes de anticorpos imobilizados no ELISA de 96 poços da placa. Quanto Nano-SPRI um valor CV elevado (20%) foi observada. Existem vários parâmetros que podem contribuir como uma fonte de Errors para determinação CV. Por exemplo, com o experimento Nano-SPRI uma concentração muito menor de analito a ser medido é, a adição de NanoEnhancers adiciona mais um passo no processo e a experiência foi realizada manualmente. Uma boa correlação entre nano-SPRI e ELISA foi atingida para a detecção de rhGH no soro humano cravado. Finalmente, ELISA pode ser uma técnica de confiança no entanto, o próprio método é demorado, o que torna difícil a sua utilização em situações que requerem a monitorização em tempo real e de multiplexagem, como é o caso com a hGH. Além disso, uma característica mais atraente que não foi investigada neste estudo directamente SPRI que oferece mais de ELISA, é a capacidade de medir simultaneamente centenas de interacções em tempo real. Portanto, no futuro, método Nano-SPRI serão avaliados para detectar biomarcadores múltiplos, simultaneamente, em tempo real (multiplexing) presentes no soro em várias concentrações a fim de examinar o seu potencial como uma ferramenta de diagnóstico clínico viável.
The authors have nothing to disclose.
NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.
Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
Nanostrip | Cyantek | ||
N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
SPR biochip | HORIBA | ||
SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |