Den föreslagna arbetet bedömer den diagnostiska potentialen direkt och förstärkt surface plasmon resonance imaging (SPRI) analyser, särskilt för detektion av rekombinant humant tillväxthormon i spetsiga humant serum, genom att jämföra SPRI resultat direkt med kommersiellt tillgänglig enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) utrustning.
Känsliga och selektiva metoder för upptäckt av humant tillväxthormon (hGH) över ett brett spektrum av koncentrationer (höga halter av 50-100 ng ml – 1 och miniminivåer för 0,03 ng ml – 1) i cirkulerande blodet är viktigt eftersom varierande nivåer kan visar förändrat fysiologi. Till exempel kan tillväxtrubbningar som förekommer i barndomen diagnostiseras genom att mäta nivåerna av hGH i blod. Även missbruk av rekombinant hGH inom idrotten utgör inte bara en etisk fråga det presenterar också allvarliga hälsorisker till förövaren. En populär strategi för att mäta hGH missbruk, förlitar sig på detektion av förhållandet mellan 22 kDa hGH totala hGH, som icke-22 kDa endogena nivåer tappar efter exogen rekombinant hGH (rhGH) administrering. Surface plasmon resonance imaging (SPRI) är ett analytiskt verktyg som möjliggör direkt (label-free) övervakning och visualisering av biomolekylära interaktioner genom att spela in förändringar i brytnings indfd anslutning till sensorytan i realtid. I motsats härtill den mest använda kolorimetrisk metod, enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) använder enzymmärkta antikroppar detektions att indirekt mäta analytkoncentrationen efter tillsats av ett substrat, som inducerar en färgförändring. För att öka detektionskänslighet, använder förstärkt SPRI en sandwichanalys format och nära infraröda kvantprickar (QDs) för att öka signalstyrkan. Efter direkt SPRI detektion av rekombinant rhGH i spetsiga humant serum är spri signalen förstärks av sekventiell injektion av antikroppsdetektion belagd med nära infraröd QDs (Nano-SPRI). I denna studie, bedömdes den diagnostiska potentialen direkt och förstärkt SPRI för mätning av rhGH spetsade i humanserum och jämföras direkt med funktionerna i ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit.
Humant tillväxthormon (hGH) är ett 191 aminosyrapeptid (22 kDa) som produceras av hypofysen och direkt släpps ut i blodomloppet. Interaktioner mellan hypotalamus peptiden tillväxthormonfrigörande hormon (GHRH) och somatotropin inducera pulserande utsöndringar av hGH. Som ett resultat, nivåer av hGH varierar från toppar i 50-100 ng / ml till dalar i 0,03 ng / ml intervallet 1. Brist eller överskott av hGH i kroppen kan framkalla ett brett spektrum av onormala fysiologiska symptom. Till exempel, kan höga nivåer av hGH leda till gigantism 2 och diabetes 3. Utarmat nivåer av hGH orsaka lågt blodsocker hos nyfödda, och svag bentäthet och depression hos vuxna 4.
Administrationen av rekombinant form av hGH (rhGH) förbättrar muskelmassa samtidigt minska kroppsfett. Som sådan, detta ämne blev drogen av valmöjligheten för professionella och amatöridrottare som det förbättrar fysisk styrka som ger en advantage i tävlingsidrott. rhGH är förbjuden enligt World Anti-Doping Agency (WADA) 5,6 och mycket arbete med internationella forskare har fokuserat på att utveckla tester som kan upptäcka sin närvaro eller anabol effekt.
Enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) har varit den föredragna metoden för bestämning av hGH i helblod 7. Även är ELISA en tillförlitlig teknik som erbjuder god känslighet och selektivitet, är det relativt tids- och arbetskrävande. Dessutom ELISA förlitar sig på indirekta detektion av hGH genom att använda enzymatiska taggar. Däremot ytplasmonresonans (SPR) medger detektion av hGH direkt utan användning av etiketter i realtid. Detektionsprincipen bakom SPR innebär en mätyta som består av ett prisma som är belagd med ett tunt metallskikt (guld eller silver); när en monokromatisk polariserat ljus samverkar med metallytan, är "ytplasmoner" genereras. Bindningen av en analyttill en ytreceptor immobiliserad på metallytan stör resonans tillstånd som leder till en skiftad resonans dopp, vilken sedan kan korreleras till analytkoncentrationen. SPR-baserade biosensorer är nu kommersiellt tillgängliga som erbjuder en realtid, etikett fri teknik för att övervaka biomolekylära bindnings händelser och biokemiska reaktioner 8-10. På senare tid har Spri utvecklats som svar på behovet av multiplexering (dvs. övervakning multipla bindnings händelser samtidigt), vilket inte var möjligt i klassisk SPR biosensorer. Således har spri vuxit fram som ett verktyg för att övervaka flera bindningshändelser samtidigt. Nuvarande SPRI system bygger på mikroskopisk avbildning av en yta som exciteras med ljus vid en specifik vinkel och våglängd 10. Bilden fångas sedan på en laddningskopplad anordning (CCD) matris.
Hittills har det funnits några SPR-baserade analyser utvecklats för att upptäcka hGH 11-14. En särskild strategi, Känd som isoform metod 15, förlitar sig på detektion av förhållandet mellan 22 kDa hGH totala hGH, som icke-22-kDa endogena nivåer tappar efter exogen rhGH administration. Nyligen, de et al., Juan-Franco 11 rapporterade om utvecklingen av en SPR-baserad immunosensorn för selektiv detektering av 22 kDa och 20 kDa hGH isoformer i humana serumprover. Monoklonala antikroppar som är specifika för varje isoform immobiliserades direkt på guldsensorn möjliggör mätning av båda isoformerna samtidigt i en enda injektion med en detektionsgräns på 0,9 ng ml -1. Alternativt har SPR använts för att screena antikroppar med hög specificitet för hGH 13. Om koncentrationen av målanalyten understiger SPRI systemets detektionsgränsen (<nM), måste man tillgripa förstärka SPRI signal via utnyttjandet av nanopartiklar (Nano-SPRI). Sådan SPR-baserad förstärkning har väl dokumenterade i litteraturen 16-19 för vOlika typer av analyt och ytor.
I detta arbete har den analytiska potential SPRI och Nano-SPRI baserade biosensorer undersökas, särskilt för detektion av rhGH i spetsiga humant serum, och jämförelse av dess detekteringsförmåga direkt till ELISA. Följande parametrar kommer att ses över och övervägas: upptäckt tid, känslighet, kinetisk profil, reproducerbarhet och specificitet.
Oregelbundna nivåer av hGH, ett naturligt förekommande hormon, har kopplats till många medicinska sjukdomar som påverkar människors tillväxt och utveckling. Dessutom är exogen administrering av rhGH vanligen används av idrottsmän, även om det är förbjudet, som dopingmedel för att förbättra deras prestanda. Utmaningar i att upptäcka rhGH missbruk resultat från svårigheten att särskilja exogena hGH från endogena formen. Som sådan aktuell godkänd teknik för att upptäcka exogent hGH förlitar sig på mätning av förhållandet mellan den 22 kDa hGH-isoformen i förhållande till kDa isoformen 20. Eftersom isoform prov krav på mätning av flera hGH isoformer samtidigt inom en kort tidsperiod i ett brett intervall av koncentrationer, därför, vi ansåg SPRI plattformen som en perfekt match. Dessutom endogent hGH-nivå fluktuera till en mycket låg nivå (0,03 ng / ml) i blodomloppet därför detekteringssystemet måste kunna mäta detta intervall bekvämt med hög specificity. Som ett resultat, vi undersökte också i denna studie potential Nano-SPRI som ett diagnostiskt verktyg för hGH och jämförde det direkt med SPRI och klassiska immun ELISA.
Baserat på resultaten erhållna från denna studie, är den största fördelen med spri och Nano-spri metod som rhGH-koncentrationer kan mätas på ett snabbare sätt i jämförelse med den mer konventionella metoden ELISA. En standardlängden för att mäta rhGH-nivåer i ett prov med den direkta detektionsmetoden var en timme medan Nano-spri krävs två timmar på grund av att de ytterligare stegen i processen. Sammantaget, med Spri och Nano-SPRI experiment, före injektion av ett prov, ett kalibreringssteg rekommenderas starkt. Dessutom injektion av en rå prov som mänskliga serum resulterar i vissa icke-specifika interaktioner som ett resultat är det absolut nödvändigt att injicera en hög salttvättbuffert för att bara avslöja specifika interaktioner. Det är också värt att notera att ett tvättsteg är absolut nödvändigtefter införandet av blockerande molekyler till sensorytan, för att avlägsna obundna molekyler. När det gäller ELISA tidskraven är mycket större (~ 16-18 timmar) för analys av ett prov. Det behövs en längre inkubationstid som känsligheten hos analysen förbättras speciellt för denna studie, som fokus var att jämföra den nedre gränsen för detektion.
Valet av ytkemi kommer att variera från en applikation till en annan och detta kan realiseras som en av begränsning av SPRI teknik. I denna studie har ett brett utbud och en kombination av kemiska linkers och blockerande molekyler bedöms uppnå den rätta kombinationen för att observera optimal bindningseffektivitet av rhGH till sensorytan. Till exempel, i denna studie, kombinationen av BSA och PEG serveras väl i att minimera icke-specifika interaktioner. I en tidigare studie 17, där infångnings liganden var en aptamers, PEG ensam fungerat som den bästa blockeringsmolekylen. Variablernasom påverkar bindningseffektiviteten av analyt till ligand är också beroende av pH, buffert och temperatur. Därför, med alla program, dessa variabler måste optimeras. Dessutom är det viktigt att bestämma den optimala observation koncentrationen av liganden till spånytan. En titrering experiment med ett intervall av koncentrationer av immobiliserade ligander utförs före initiering av studien. När det gäller ELISA, ett avgörande steg i förfarandet var att dekantera tvättbufferten från brunnarna genom att trycka på mikro eftersom detta säker ingen kvarvarande vätska är överblivet material. Ta bort buffert tvätta med pipett var inte tillräckligt eventuella rest vätska stört signal läsning av det riktade urvalet.
Med hänvisning till känslighet, är ELISA (1 ng / ml) jämförbar med SPRI (3,61 ng / ml) men nano-SPRI (9,20 pg / ml) förbättrar känsligheten med tre tiopotenser, vilket möjliggör mätningar på lägre biologiska nivåer av rhGH 0,03 ng / ml. Som vi tidigare rapporterat en6,17 är signalförstärkning som ges av den NanoEnhancers skrivs en massbelastningseffekten och den starka kopplingen som finns mellan NIR fluoroforer och föröknings ytplasmoner för guldfilm nanostrukturer. Även om, Nano-spri ger en extra steg i förfarandet, kan denna nivå av känslighet vidga tillämpningar av SPRI teknik i olika butiker.
SPRI ger forskarna en fullständig kinetisk profil (K D, K a och Kd) av antikropp / rhGH interaktion medan ELISA kan rapportera endast affinitetsvärden. Variationskoefficienten (CV) var lägre än 10% för SPRI (4,1%) och ELISA (6,5%), vilket tyder på god reproducerbarhet. ELISA och spri affinitetsvärden är olika på grund av att infångningsantikroppar immobiliserade på sensorchipet skiljer sig från antikroppar immobiliserade i ELISA 96-brunnsplatta. Som för Nano-spri ett högre CV-värde (20%) observerades. Det finns flera parametrar som kan bidra som en källa till errors för CV beslutsamhet. Till exempel, med Nano-spri experimentet en mycket lägre koncentration av analyt som mäts, tillsats av NanoEnhancers adderar ytterligare ett steg i förfarandet och försöket genomfördes manuellt. En mycket god korrelation mellan nano-spri och ELISA uppnåddes för detekteringen av rhGH i spetsade humanserum. Slutligen kan ELISA vara en pålitlig teknik emellertid själva metoden är tidskrävande, vilket gör det svårt att använda i situationer som kräver realtidsövervakning och multiplexering, eftersom det är fallet med hGH. Dessutom har en mer attraktiv egenskap som inte undersöktes direkt i denna studie att spri erbjuder över ELISA, är förmågan att mäta hundratals interaktioner samtidigt i realtid. Därför i framtiden kommer Nano-Spri metoden utvärderas för att upptäcka flera biomarkörer samtidigt i realtid (Multiplexing) som förekommer i serum vid olika koncentrationer för att undersöka dess potential som en livskraftig klinisk diagnostiskt verktyg.
The authors have nothing to disclose.
NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.
Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
Nanostrip | Cyantek | ||
N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
SPR biochip | HORIBA | ||
SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |