Teklif edilen iş (spri) deneyleri, özellikle de çivili insan serumu yeniden birleştirici insan büyüme hormonu saptanması için, ticari olarak temin edilebilen spri enzim-bağlı immünosorbent deneyi ile doğrudan sonuç karşılaştırarak doğrudan amplifiye yüzey plazmon rezonans görüntüleme diyagnostik potansiyele değerlendirir (ELISA) seti.
Herbiri geniş bir derişimler aralığında insan büyüme hormonu (hGH) tespiti için hassas ve seçici yöntemleri (yüksek düzeyde 50-100 ng ml – 1 ng ve 0.03 ml minimum seviyeleri – 1) kan dolaşımında, değişken seviyeleri gereklidir may değiştirilmiş fizyolojiyi göstermektedir. Örneğin, çocukluk döneminde ortaya çıkan büyüme bozuklukları kandaki iBH'nin düzeylerini ölçerek teşhis edilebilir. Ayrıca, spor rekombinant iBH'nin kötüye sadece, aynı zamanda istismarda ciddi sağlık tehditleri sunan bir etik sorun teşkil etmektedir. Olmayan 22 kDa endojen düzeyleri eksojen rekombinant hGH (rhGH) uygulandıktan sonra damla olarak hGH kötüye ölçülmesi için bir strateji, toplam İBH 22 kDa hGH oranının tespitine dayanır. Yüzey plazmon rezonans görüntüleme (Spri) refraktif ind değişiklikleri kaydederek direkt (etiket içermeyen) izleme ve biyomoleküler etkileşimleri görselleştirme sağlar analitik bir araçtırgerçek zamanlı olarak sensör yüzeyine bitişik örn. Bunun aksine, en sık kullanılan kolorimetrik yöntem olup, enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) dolaylı bir renk değişikliği oluşturan bir alt tabaka ilavesinden sonra analit konsantrasyonunun ölçülmesi için, enzim etiketli algılama antikorlar kullanır. Saptama hassasiyetini artırmak için, çoğaltılmış spri sinyal gücünü artırmak için bir sandviç deneyi formatı ve kızıl ötesine yakın kuantum noktalar (QDS) kullanır. Çivili insan serumu rekombinant rhGH doğrudan spri saptandıktan sonra spri sinyal yakın kızılötesi QDS (Nano spri) ile kaplanmış algılama antikoru arasında sıralı enjeksiyon ile amplifiye edilir. Bu çalışmada, doğrudan ve amplifiye spri tanıma potansiyeli rhGH insan serumunda tutturuldu ve şirketinden ticari olarak temin edilebilir bir ELISA kiti yetenekleri ile karşılaştırıldığında ölçmek için değerlendirildi.
İnsan büyüme hormonu (hGH), hipofiz bezi tarafından üretilen doğrudan kan akışına salınır, 191 amino asitli bir peptiddir (22 kDa) 'dir. Hipotalamik peptid büyüme hormonu salıveren hormon (GHRH) ve somatotropin arasındaki etkileşim hGH pulsatil salgıları indükler. Bunun bir sonucu olarak, hGH seviyesi 0,03 ng / ml aralığı 1 en düşük seviyelerine 50-100 ng / ml zirve arasında değişmektedir. Vücuttaki bir eksiklik ya da hGH aşırı anormal fizyolojik semptomlara geniş bir yol açabilir. Örneğin, hGH aşırı seviyeleri gigantism 2 ve diyabet 3 neden olabilir. HGH'nin tüketilmiş seviyeleri yetişkinlerde 4 yenidoğanlarda kan şekeri düşüklüğü ve zayıf kemik yoğunluğu ve depresyona neden olur.
Vücut yağ azaltırken hGH (rhGH) rekombinant formunun uygulanması yağsız kas kütlesini artırır. Bir zarf kazandıran fiziksel güç geliştirir gibi, bu madde profesyonel ve amatör sporcular için tercih edilen ilaç olduRekabetçi spor antage. rhGH varlığını veya anabolik etkiye algılayabilir testleri geliştirme odaklı olmuştur uluslararası araştırmacılar tarafından Dünya Anti-Doping Ajansı (WADA) 5,6 ve çok çaba ile yasaklanmıştır.
Enzim-bağlı imünosorban deneyi (ELISA), tam kan 7 iBH'nin belirlenmesi için tercih edilen bir yöntem olmuştur. ELISA iyi hassasiyet ve seçiciliği sunan güvenilir bir tekniktir rağmen, nispeten zaman ve emek yoğundur. Buna ek olarak, ELISA, enzimatik etiketler kullanılarak hGH indirekt tespiti dayanır. Bunun aksine, yüzey plazmon rezonansı (SPR) ile doğrudan gerçek zamanlı olarak alır ve etiket kullanılmaksızın hGH tespit edilmesine izin verir. SPR arkasındaki saptama prensibi ince bir metal tabaka (altın veya gümüş) kaplanmış olan bir prizma oluşan bir algılama yüzeyini içerir; monokromatik polarize ışık metal yüzeyi ile etkileşime girdiğinde, "yüzey plazmonları" oluşturulur. Bir analitin bağlanmasınınmetal yüzey üzerinde immobilize edilmiş bir yüzey reseptörüne daha sonra analit konsantrasyonu ile alakalı bir kaydırılmış rezonans daldırma ile sonuçlanan rezonans koşullarını bozan. SPR temelli biyosensörler şimdi biyomoleküler bağlayıcı olayları ve biyokimyasal reaksiyonları 8-10 izlemek için gerçek zamanlı, etiket ücretsiz teknik teklif piyasada mevcuttur. Daha yakın zamanlarda, Spri çoğullama için ihtiyacına yanıt olarak geliştirilmiştir (yani, aynı anda birden fazla bağlayıcı olayları izlemek) Klasik SPR biyosensörlerde mümkün değildi. Böylece, Spri aynı anda birkaç bağlayıcı olayları izlemek için bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Mevcut Spri sistemler belirli bir açı ve dalga boyunda 10 de ışıkla uyarılan bir yüzeyinin mikroskopik görüntülemesi dayanmaktadır. Görüntü daha sonra bir şarj-kuplajlı aygıt (CCD) dizisi üzerine yakalanır.
Bugüne kadar, hGH 11-14 tespit etmek için geliştirilmiş bir kaç SPR bazlı deneyler yapılmıştır. Belirli bir stratejiOlmayan 22-kDa 'lık endojen düzeyleri eksojen rhGH uygulamadan sonra damla olarak, izoform yöntemi 15 olarak da bilinen, toplam İBH 22 kDa hGH oranının tespitine dayanır. Son zamanlarda, Juan-Franco ve ark., 11 22 kDa ve insan serum numunelerinde 20 kDa hGH izoform seçici saptanması için bir SPR tabanlı immunosensor gelişimi rapor de. Her izoformuna belirli monoklonal antikorlar 0.9 ng ml -1 de algılama sınırı olan tek enjeksiyon aynı anda her iki izoformların ölçümü izin altın sensörü doğrudan immobilize edildi. Seçenek olarak ise, SPR hGH 13 yüksek spesifikliği olan antikorları taramak için kullanılmıştır. Hedef analitin konsantrasyonu tespiti Spri sistemin sınırı (<nM) altına düşerse, kimse nanopartiküllerin kullanımı (Nano-Spri) üzerinden Spri sinyali kuvvetlendiren başvurmak zorundadır. Böyle SPR temelli amplifikasyon iyi v literatürde 16-19 belgelenmiştiranalitin ve yüzeylerin arious türleri.
Bu çalışmada, Spri ve Nano-Spri temelli biyosensörler analitik potansiyeli özellikle çivili insan serumunda rhGH tespiti için, muayene edildi ve ELISA doğrudan algılama yeteneğinin karşılaştırılması. Aşağıdaki parametreler gözden ve dikkate alınacaktır: algılama süresi, duyarlılık, kinetik profili, tekrarlanabilirlik ve özgüllüğü.
HGH, doğal olarak oluşan bir hormon düzensiz seviyeleri insan büyüme ve gelişimini etkileyen çok sayıda tıbbi bozukluklar ile bağlantılı olmuştur. Dahası, rhGH eksojen yaygın onların performansını artırmak için doping maddesi olarak, bu yasak olsa bile, sporcular tarafından kullanılır. Endojen formdan eksojen hGH ayırt zorluk rhGH kötüye sonucu tespit Zorluklar. Bu nedenle, eksojen hGH tespit etmek için mevcut onaylanmış bir teknik 20 kDa izoformuna göre 22 kDa hGH izoformunun oranı ölçme üzerine dayanır. Birden çok hGH ölçümü için izoform testi talepleri dolayısıyla konsantrasyonları geniş bir zaman kısa bir süre içinde aynı anda izoformları yana, mükemmel bir eşleşme olarak spri platformudur. Buna ek olarak, endojen hGH seviyesi dolayısıyla algılama sistemi, yüksek sp rahatça bu aralığı ölçmek gerekir kan dolaşımında çok düşük bir seviyede (0.03 ng / ml) dalgalanmaecificity. Sonuç olarak, biz de hGH'nin için bir tanı aracı olarak bu çalışmada Nano-Spri potansiyelini araştırdık ve Spri ve klasik immunoassay ELISA ile doğrudan karşılaştırdık.
Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara göre, spri Nano-spri yöntemin en önemli avantajı rhGH konsantrasyonları daha geleneksel bir yöntemle ELISA ile karşılaştırıldığında daha hızlı bir şekilde ölçülebilir olmasıdır. Nano Spri işleminde ek adımlar nedeniyle 2 saat gerekli ise, doğrudan algılama yöntemi ile tek bir numunede rhGH seviyelerini ölçmek için standart bir süresi 1 saat idi. Genel olarak, Spri ve Nano-Spri deneyler ile bir numunenin enjeksiyonundan önce, bir kalibrasyon adımı şiddetle tavsiye edilir. Buna ek olarak, sadece belirli bir etkileşimi ortaya çıkarmak için yüksek tuz yıkama tamponu enjekte etmek zorunludur bir sonucu olarak, bazı spesifik olmayan etkileşimlerle insan serum sonuçları gibi ham numune enjeksiyonu. Bir yıkama aşaması kesinlikle gerekli olduğunu da fazlalaştıSensör yüzeyine moleküller engelleme girmesinden sonra, bağlanmamış molekülleri kaldırın. ELISA zaman gereksinimleri gelince bir örnek analizi için (~ 16-18 saat) çok daha fazladır. Odak alt deteksiyon limiti ile karşılaştırma olarak tahlilin duyarlılığı, bu çalışma için özellikle geliştirilmiş edilen bir uzun bir enkübasyon süresi gereklidir.
Yüzey kimyasının seçimi bir uygulamadan diğerine değişir ve bu Spri tekniğinin sınırlama biri olarak gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada, geniş ve kimyasal bağlayıcılar ve engelleme moleküllerin bir kombinasyon sensör yüzeyine rhGH optimal bağlanma etkinliğini gözlemlemek için doğru kombinasyonu elde etmek için değerlendirildi. Örneğin, bu çalışmada, BSA ve PEG kombinasyonu, spesifik olmayan etkileşimleri minimize iyi görev yaptı. Ancak, yakalama ligandı bir aptamer olan önceki bir çalışmada 17 bölgesi, PEG tek başına en iyi bloke molekül olarak görev yaptı. Değişkenlerliganda analitle etkiler bağlanma verimliliği tampon ve sıcaklık da pH değerine bağlıdır. Bu nedenle, herhangi bir uygulama ile, bu değişkenler optimize edilmesi gerekir. Buna ek olarak, bu çip yüzeyinde ligandın uygun lekelenme konsantrasyonunu belirlemek için önemlidir. Hareketsizleştirilmiş ligand konsantrasyonları bir dizi ile titrasyon deneyi çalışma başlamadan önce gerçekleştirilir. Bu rezidüel sıvı artık olduğu sağlanmalıdır olarak ELISA için olduğu gibi, prosedür çok önemli bir adımdır mikrotabla dokunarak kuyulardan yıkama tamponu süzün oldu. Herhangi bir artık sıvı, hedef numunenin sinyal okuma müdahale olarak pipet ile tampon yıkama çıkarılması yeterli değildi.
Duyarlılığı referans olarak, ELISA (1 ng / ml) spri (3.61 ng / ml), fakat nano spri (9.20 ug / ml) ile karşılaştırılabilir böylece rhGH alt biyolojik seviyelerde ölçüm sağlayan büyüklükte üç siparişleri hassasiyeti artırır 0,03 ng / ml olmuştur. Daha önce 1 bildirdiği gibi6,17, NanoEnhancers tarafından kazandırılan sinyal geliştirme kitle yükleme etkisi ve altın filmi nanoyapılarda NUR fluorophores ve çoğaltım yüzey plazmonları arasında var olan güçlü bağlantı atfedilir. Olsa bile, Nano-Spri prosedürüne fazladan bir adım ekliyor, hassasiyet bu seviyede çeşitli mağazalarında Spri teknolojisinin uygulamaları genişletmek olabilir.
ELISA tek afinite değerleri bildirebilirsiniz oysa Spri antikoru / rhGH etkileşiminin (K D, K a ve K d) bilim adamlarına tam kinetik profili sunmaktadır. Varyasyon katsayısı (CV) iyi tekrarlanabilirlik düşündüren, Spri (% 4.1) ve ELISA (% 6.5)% 10 altında olmuştur. Immobilize veya detektör çipi yakalama antikorları ELISA 96 oyuklu plaka içerisinde hareketsizleştirilmiş antikorlardan farklı olduğu için ELISA ve spri afinite değerleri farklıdır. Nano Spri gelince daha yüksek bir CV değeri (20%) gözlenmiştir. Erro kaynağı olarak katkıda bulunabilir birçok parametre vardırCV tespiti için rs. Örneğin, analit, çok daha düşük konsantrasyonu ölçülmüştür olan nano-spri deneyi ile, NanoEnhancers eklenmesi prosedüründe bir adım ekler ve deney elle uygulandı. Nano Spri ve ELISA ile çok iyi bir korelasyon sivri insan serumunda rhGH saptanması için elde edilmiştir. Son olarak, ELISA yöntemi kendisi hGH'nin olduğu gibi zor, gerçek zamanlı izleme ve çoğullama gerektiren durumlarda kullanmak için yapar zaman tüketen, ancak güvenilir bir teknik olabilir. Buna ek olarak, spri ELISA içinde yer alan bu çalışmada, doğrudan araştırılmadı daha çekici bir özelliği, aynı zamanda gerçek zaman içinde etkileşimlerin yüzlerce ölçülebilmesidir. Bu nedenle gelecekte, Nano-Spri yöntemi uygulanabilir bir klinik tanı aracı olarak potansiyel incelemek için çeşitli konsantrasyonlarda serumunda bulunan birden biyomarkerları aynı anda gerçek zamanlı olarak (çoklayıcı) tespit etmek değerlendirilecektir.
The authors have nothing to disclose.
NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.
Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
Nanostrip | Cyantek | ||
N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
SPR biochip | HORIBA | ||
SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |