Introduction
Emulsioni doppie consistono goccioline separate da una fase portante da uno strato liquido immiscibile intermedio, e sono di particolare interesse per le loro potenziali impieghi industriali, farmaceutici e applicazioni biologiche 1. In alcuni casi, la capacità di incapsulare composti ad alto valore del core doppio dell'emulsione permette materiale da proteggere e rilasciato in modo controllato. Ad esempio, i farmaci possono essere incapsulati in condizioni di solubilità non appropriati per il vettore fluido esterno 2. Inoltre, lo strato di olio intermedio può essere utilizzato come modello per la capsula incapsulamento e la consegna di farmaci, cosmetici e nutrienti 3. In biologia, doppie emulsioni sono anche utili in screening ad alto rendimento in quanto consentono un enorme numero di esperimenti sub-nanolitri da effettuare, quindi rilevato e risolto utilizzando una cella a fluorescenza-attivato (FACS) strumento 4,5.
ent "> Il disegno di doppi emulsioni con caratteristiche prestazionali desiderate richiede il controllo preciso della dimensione doppia emulsione, composizione e uniformità. I processi di emulsificazione sfuso, come le membrane emulsificazione, sono utilizzati nell'industria, le emulsioni risultanti sono altamente polidisperso, esibendo un Un'ampia varietà di proprietà funzionali 1. Il campo di goccia microfluidica è naturalmente adatto alla generazione di emulsioni monodisperse con composizione attentamente controllata 6. Microfluidic generazione doppia emulsione è stato raggiunto con due strategie principali, la preparazione di goccia sequenziale e flusso capillare di vetro concentrandosi. emulsioni doppie possono essere generati in dispositivi PDMS planari utilizzando una goccia in due fasi processo. Primo, acquosa-in-olio vengono creati utilizzando un acqua-in-olio regione di un dispositivo con pareti di canale idrofobici fabbricazione goccia. Successivamente, l'emulsione può essere scorreva o reiniettato in una regione-making goccia con pareti idrofili adatti per olio in acquadrop-fare 4. Tuttavia, il trattamento di superficie idrofila di PMDS richiede un ulteriore fase di fabbricazione ed è spesso temporanea 7. Il metodo più controllabile e ripetibile per formare emulsioni doppie è di flusso coassiale focalizzazione, una tecnica sperimentato usando microfluidica capillare di vetro, per cui un getto concentrica contenente le tre fasi viene tagliato attraverso un piccolo orifizio per produrre goccioline monodisperse 8. Questa tecnica permette la produzione di goccioline molto più piccole rispetto alle dimensioni di canale, con la dimensione precisa e composizione del doppio dell'emulsione essendo funzione delle portate di ciascuna fase. La grande differenza tra le dimensioni delle gocce e il canale ed il flusso protettivo guaina esterna impedisce goccioline dal contatto con le pareti del canale, rendendo non necessario il trattamento di superficie. Tuttavia, tali dispositivi richiedono vetro montaggio su ordinazione di estremità dei capillari conici, insieme a un'attenta assemblaggio e sigillatura. Ricercatori precedenti hanno utilizzato 3D litografia sofficegrafia di generare doppi emulsioni utilizzando flusso focalizzazione fisica, ma questi dispositivi prodotta emulsioni con diametri> 150 micron 9,10, circa un ordine di grandezza più grande di oggetti tipicamente ordinati con FACS. Un'alternativa interessante includerebbe la robusta funzionalità e piccola generazione goccia di vetro capillare flusso coassiale messa a fuoco con la facilità di fabbricazione di PDMS morbido litografia.In questo articolo, si descrive un doppio generatore di un'emulsione che utilizza il flusso coassiale di messa a fuoco per produrre ≤ 50 micron emulsioni ed è costruito interamente con 3D litografia soft 11. Il nostro dispositivo utilizza un approccio a conchiglia per fabbricare dispositivi che include un piccolo canale di taglio (figura 1) per approssimare i processi di formazione di emulsione in un ugello capillare di vetro tirato. Ancora più importante, questi dispositivi non richiedono alcun trattamento superficiale specifica, e la costruzione tutto polimero fornisce un facile e ripetibile fabbricazione scalable a un gran numero di dispositivi duplicati. Qui, descriviamo la progettazione, fabbricazione e collaudo del doppio generatore di emulsione. Generazione Doppia emulsione è dimostrato di essere affidabile e ripetibile fino a diametri delle gocce di 14 micron. L'accoppiamento di funzionalità, facilità di fabbricazione rende questo dispositivo un'opzione attraente per sviluppo di nuove applicazioni doppia emulsione.
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Protocol
1. SU8 Maestro Fabrication
- Progettare le strutture microfluidica per due fabbricazione strato utilizzando il software AutoCAD e avere i disegni stampati da un fornitore su pellicola circuito con risoluzione di 10 micron. I dettagli del progetto del dispositivo sono riportati in un riferimento collegato 11 e le geometrie dei canali nella Figura 1. Gli strati devono includere segni di allineamento per aiutare colloca caratteristiche da ogni strato fabbricazione 12.
- Posizionare un 3 pollici wafer di silicio del diametro di pre-pulizia su un dispositivo a induzione giro e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3035 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, quindi 30 secondi a 2000 rpm, fornendo uno spessore di 50 micron.
- Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra riscaldante a 135 ° C per 30 min. Lasciare raffreddare il wafer di RT prima di passare alla fase successiva.
- Esporre il wafer rivestito al 1 maschera di livello (Figura 2A
- Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di rotazione e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-2050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, quindi 30 secondi a 1.375 rpm, risultante in uno strato che fornisce uno spessore di 135 micron aggiuntivo.
- Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra 135 ° C per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva.
- Allineare la maschera di livello 2 nd (Figura 2B) sulla geometria modellata in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l'esposizione, posto su una piastra 135 ° C per 1 minuto, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva.
- Sviluppare le maschere immergendo in un bagno agitata di propilenglicole monometiletere acetato per 30 min. Lavare il waferin isopropanolo e cuocere su una piastra 135 ° C per 1 min. Posizionare il maestro sviluppato in una capsula di Petri 100 mm per lo stampaggio PDMS.
2. PDMS di fabbricazione del dispositivo
- Preparare 10: 1 PDMS combinando 50 g di base siliconica con 5 g di agente indurente in una tazza di plastica. Mescolare il contenuto con un utensile rotante dotato di un bastoncino. Degassare la miscela all'interno di un essiccatore per 30 minuti, o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse.
- Versare il PDMS per dare uno spessore di 3 mm sopra il maestro e il luogo di nuovo nel essiccatore per ulteriore degasaggio. Una volta che tutte le bolle vengono rimossi, cuocere il dispositivo a 60 ° C per 2 ore.
- Tagliare il dispositivo dallo stampo con un bisturi e posto su una superficie pulita con il lato modellato su. Tagliare lo stampo PDMS a metà con una lama di rasoio per separare Master 1 da Master 2 (Figura 3a). Sul pezzo che contiene la gestione geometria 50 um fluido impresso dal Maestro 1, pugno gli ingressi e le uscite fluidici con 0,75 mm biopsia.
- Plasma trattare i dispositivi a 1 mbar O 2 al plasma per 60 secondi in un pulitore di plasma di 300 W. Bagnare la superficie del pezzo unpunched di PDMS con una goccia di acqua deionizzata a ritardare temporaneamente PDMS-PDMS legame e servire come lubrificante. Durante la visualizzazione attraverso un microscopio stereo, posto Master 1 Master 2 sulla superficie e far scorrere le superfici relativamente fino ad ottenere un blocco meccanico quando i telai da incasso e le cornici sporgenti in figura 3A compagno.
- Posizionare il dispositivo in un forno a 60 ° C e cuocere il dispositivo assemblato (Figura 3B) per due giorni a 60 ° C per evaporare l'acqua e completo incollaggio.
3. Preparazione dei reagenti
- Riempire siringa da 1 ml con acqua distillata per la fase interna.
- Riempire siringa da 1 ml con HFE 7500 olio fluorurato con 1 peso. % Tensioattivo biocompatibile tensioattivo 13 per fase centrale.
- Riempire 10 ml siringa con 10 WT. % Polietilenee glicole (PEG) in soluzione acquosa contenente 1 wt. % Di Tween 20 e 1 in peso. % Sodio dodecil solfato per la fase continua.
4. Sistema Preparazione
- Posizionare il chip microfluidico sul palcoscenico di un microscopio invertito accoppiato con una fotocamera digitale in grado di <100 msec tempi di posa.
- Montare tutte le siringhe sulle pompe siringa e collegare 27 aghi G. Attaccare ~ 30 cm di lunghezza di PE-2 tubi sugli aghi e inserire le estremità nell'appropriata perforato fori nel dispositivo.
- Inserire una lunghezza 10 cm di PE-2 alla porta di uscita del dispositivo e posizionare l'altra estremità in un contenitore di raccolta dei rifiuti.
- Prime dispositivo eseguendo le pompe a siringa ad alte percentuali di velocità (2,000 ml / min) fino fluido nei segmenti tubi raggiunge le luci di entrata del dispositivo.
5. Emulsione Generation
- Fuoco il microscopio su una regione che contiene il 50 um x 50 um orifizio e lacanale di uscita a valle.
- Impostare le pompe a siringa per fornire fluido al doppio generatore di emulsione a portate di 250 ml / h per la fase interna, 100 ml / h per la fase intermedia, e 700 ml / h per la fase continua e attendere 10 minuti per il raggiungimento dell'equilibrio.
- Mantenere le portate delle fasi interni e centrali a 250 microlitri / hr e 100 microlitri / h, rispettivamente. Impostare la portata della fase esterna a 1.050 ml / hr. Attendere 3-5 minuti per il doppio generazione emulsioni per stabilizzare sotto questo insieme di condizioni di flusso.
- Acquisire 5 sec di immagini video a 30 Hz per l'elaborazione offline tramite analisi di immagine manuale.
- Ripetere 5.3 e 5.4 con le portate indicate nella tabella 1. Le portate fase interni e centrali rimangono costanti e la portata fase della portante viene variata regolando l'impostazione della pompa a siringa.
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Representative Results
Il generatore doppia emulsione costituito da un dispositivo di messa a fuoco flusso coassiale creato utilizzando 3D PDMS fabbricazione (Figura 1A). La geometria permette che la formazione di un getto coassiale trifase da tagliare in un quadrato, 50 um x 50 um orifizio, consentendo la formazione di acqua / olio / acqua doppio emulsioni (Figura 1B, Figura 1C). La fase acquosa interna e la fase olio medio sono riuniti in una giunzione con dimensioni di canale di 10 micron x 50 micron (Figura 1D, punto "1"). A causa della idrofobicità di PDMS, gli abbracci olio fluorurati pareti del canale e le stecche interne fase al centro del canale, come i fluidi viaggiano a getto continuo, fino al raggiungimento di una espansione dei canali brusca espansione (Figura 1D, punto "2" ). In questa posizione, le due fasi interne vengono iniettati nel centro di un 320 micron junc altozione che permette l'introduzione relativamente concentrica della fase acquosa portante. Le tre fasi sono costretti in un 50 micron x 50 micron orifizio (Figura 1D, punto "3"), per cui la portata elevata della cesoia di fase portante le due interne fasi in un lungo, tentacolo sottile che decompone da goccioline uniformi ( Figura 1E).
La fabbricazione 3D PDMS richiede l'accoppiamento di due unici PDMS stampi in una configurazione a conchiglia dopo lo stampaggio su due strati maestri litografiche. A 50 micron strato alto è usato per formare i canali di gestione dei fluidi interni e centrali, insieme con l'orifizio di taglio su Master 1 (Figura 2A), oltre ad sporgenti gratuito e cornici incasso su opposti master. Un ulteriore strato 135 micron alto viene utilizzato per creare il fluido vettore e dei canali di uscita (Figura 2B). Montaggio del generatore doppia emulsione utilizza tlui incasso e sporgente fotogrammi (Figura 3A) per l'allineamento geometrico dopo il trattamento al plasma (Figura 3B).
Il dispositivo a doppia emulsione è stata testata in una varietà di condizioni di flusso per dimostrare la formazione di varie dimensioni, doppie emulsioni monodisperse. Per questi esperimenti, le portate di fase interni e centrali sono stati mantenuti costanti e la portata fase della portante è stata modificata per influenzare la forza di taglio durante la generazione delle gocce. Condizioni sperimentali sono parametrizzati dal rapporto del flusso fase della portante (Q c) alla somma delle due fasi flussi interni (Q somma). Immagini di generazione delle gocce per gli esperimenti effettuati alle Q c / Q somma da 3 a 57 sono illustrate in Figura 4. Una regione allungata contenente i due interni fasi è osservato per sporgere nel 50 micron x 50 micron orifizio e si rompe in goccioline che vengono convected a valle. ioncreasing il flusso della fase della portante (crescente Q c / Q sum) conduce alle fasi interne essere tosati in regioni progressivamente più sottili che producono gocce più piccole. Emulsioni doppie prodotte dal dispositivo a portate differenti mostrano un coefficiente di variazione del diametro medio del 5,2%. Istogrammi di diametri delle goccioline per selezionare i valori di Q c / Q somma mostrano anche la relativa uniformità delle dimensioni delle goccioline generate (Figura 5). Il dispositivo dimostra la capacità di formare emulsioni doppie significativamente più piccolo della larghezza orifizio, e mostra un chiaro andamento decrescente con l'aumento Q c / Q sum (Figura 6). A più alto flusso portante fase di test, 14 micron doppie emulsioni si sono formati con il 50 micron x 50 micron orifizio.
Figura 1. Geometria del double generatore di emulsione. (A) Modello 3D del dispositivo fabbricato. (B) Sezione verticale trasversale del canale centrale che mostra introduzione interno (grigio), Medio (rosso), e carrier (blu) fasi. (C) Sezione che mostra il getto contenente le due fasi interne che entrano nel foro quadrato. (D) Vista dall'alto della generazione emulsione nel dispositivo. Allo svincolo (1) l'iniezione della fase intermedia idrofobica è aiutata dai PDMS idrofili, che induce a rivestire le pareti del canale. Allo svincolo (2) il canale espande e un getto delle due fasi interne viene tagliato nel foro (3) per il più alto tasso di flusso del fluido continua ad un punto in cui la formazione di goccioline fisica causa. (E) Un microscopio di generazione doppia emulsione in dispositivo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. </ p>
Figura 2. Litografia produzione dei maestri. (A) La maschera utilizzata per la preparazione di 50 micron caratteristiche. Master 1 è utilizzato per modellare le insenature fluidici, la giunzione interna / fase intermedia, l'orifizio generazione di emulsione, e un trogolo incasso per l'allineamento. Master 2 contiene una cresta rialzato utilizzato per l'allineamento. (B) La maschera utilizzata per la preparazione di 135 micron caratteristiche. I maestri sono immagini speculari che contengono le modalità di inoltro del fluido vettore e il canale di uscita. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Montaggio del dispositivo PDMS. (
Figura 4. Le immagini di emulsioni doppie generati a portate diverse. La portata della fase esterna viene modificato per alterare Q c / Q somma, che è dato a fianco di ciascuna immagine. Aumentare Q c / Q somma restringe il getto dei fluidi interni di essere tranciati attraverso l'orifizio, creando sempre più piccole gocce. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. istogrammi di gocce doppie emulsione formati a portate diverse. Il coefficiente medio di variazione del diametro delle gocce di emulsione prodotte in un dato insieme di condizioni di flusso è del 5,2%. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Droplet diametro contro parametro portata normalizzata. Regolazione della portata della fase continua permette la produzione di emulsioni doppie che sono il 30% -100% del diametro dell'orifizio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Parametri di tasso di flusso utilizzati per gli esperimenti. La fase interna e portate fase centrale (Q i, Q m) sono mantenuti costanti, dando una costante portata combinata (Q sum). La portata fase della portante (Qc) viene variata per produrre doppie emulsioni con diversi diametri. Il rapporto Q c / Q somma è il principale parametro adimensionale descrivere condizioni sperimentali.
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Discussion
La doppia geometria di generazione emulsione qui descritto è stato progettato per simulare la fisica dei dispositivi capillare vetro 8. In questi, capillari di vetro cilindriche allineati vengono usati per creare un getto coassiale trifase che viene tranciata in uniformi goccioline doppia emulsione. La funzione del nostro dispositivo 3D PDMS dipende l'allineamento centrale piccole caratteristiche formate con 50 micron fabbricazione alto con canali di fase portante che sono 320 micron di altezza totale. C'è un potenziale significativo per le caratteristiche di disallineamento alti modellati dalla maschera di livello 2 ° al passo 1.7 rispetto al 50 um geometria alto se maschere non sono allineati con precisione. Corretto allineamento può essere aiutato progettando segni di allineamento, come cerchi concentrici in maschere per essere posizionato durante foto patterning. Il legame plasmatica delle due PDMS metà del dispositivo è un secondo processo che può portare a disallineamenti significativi del dispositivo finale. Incollaggio Plasmadi PDMS a PDMS è generalmente istantaneo, così al punto 2.4 descriviamo la bagnabilità di una superficie del dispositivo con acqua deionizzata per ritardare l'incollaggio e permettere la manipolazione modo che i frame di allineamento mostrato nella Figura 3A si può permettere di bloccare. Se questa viene tentata senza bagnare sufficiente, le superfici PDMS saranno irreversibilità legame prima di entrare in un corretto allineamento, e il dispositivo devono essere smaltiti e nuovi PDMS stampi fatti.
Il dispositivo a doppia emulsione è progettato per sfruttare le tecniche di fabbricazione che che portano a proprietà di superficie uniformemente idrofobiche. Tuttavia, il funzionamento al di fuori dei parametri descritti nel protocollo richiede una certa comprensione dei processi fluidici richiesti. Una giunzione delle fasi interni e centrali (Figura 1D, punto "1"), relativamente elevato flusso della fase interna e basso flusso della fase intermedia crea un getto a due fasi, con rivestimento fase centrale idrofoba pareti del canale. Seil flusso proporzionale della fase intermedia è aumentata, la generazione di goccioline discrete acqua-in-olio inizierà a verificarsi, eliminando la possibilità di formare un coerente jet trifase per formazione di gocce nell'orifizio (Figura 1D, punto "3" ). Dopo l'espansione del canale (Figura 1D, punto "2"), una notevole quantità di carrier flusso di fase è necessaria per creare la separazione geometrica tra fase centrale e le pareti del canale idrofobiche. Riduzioni del flusso fase portante alla fine porterà alla fase centrale bagnatura delle mura dispositivo idrofobiche. Riduzioni significative del flusso fase della portante possono creare condizioni di flusso che sono insufficienti a tosare le fasi interne in un lungo, sottile filamento, così modificando radicalmente la fisica della doppia formazione di goccioline di emulsione.
Una volta costruito, il dispositivo è progettato per produrre emulsioni doppie da 14 a 50 micron, un formato conveniente per ordinamento con FACS commercialistrumenti. Se si desiderano doppie emulsioni di fuori di questo intervallo di grandezza, le dimensioni dell'orifizio devono essere scalati dal 50 micron dimensioni x 50 micron usato qui. Poiché il dispositivo è progettato per produrre acqua / olio / acqua doppio emulsioni con proprietà superficiali uniformemente idrofobiche, emulsioni doppie olio / acqua / olio non può creare se non ci fosse un trattamento superficiale applicato per rendere il dispositivo uniformemente idrofila.
Questo lavoro dimostra un facile da realizzare dispositivo PDMS in grado di robusta formazione di acqua / olio / acqua doppio emulsioni. Sebbene altri ricercatori hanno riportato la formazione di emulsioni doppie in dispositivi creati utilizzando la litografia 3D 14,15, i doppi emulsioni formate nei loro dispositivi avevano diametri che sono stati misurati in 100s di micron. Il dispositivo qui riportato è adatto per produrre emulsioni doppie un ordine di grandezza più piccolo di questo, fornendo volumi simili alle cellule di mammifero e ben adatti per l'ordinamento per FACS.
Anche se questi risultati possono essere raggiunti usando microfluidica capillari di vetro, fabbricazione di dispositivi in vetro è laborioso e richiede molti hands-on di passi al dispositivo. Per il nostro dispositivo tutti PDMS, costituita in gran parte la fabbricazione di stampaggio, incollaggio, e lastre di cottura PDMS, processi che sono semplici, ripetibili, e facile da scalare per grandi numeri.
L'utilità di un dispositivo litograficamente fabbricato per generare doppi emulsioni con flusso coassiale di messa a fuoco è stata dimostrata. Ci auguriamo che la fabbricazione semplice e robusta funzionalità di questa doppia emulsione disegno generatore dovrebbero portare al suo adattamento per applicazioni scientifiche ed industriali. Gli investigatori precedentemente scoraggiati dalle competenze specialistiche necessarie per lavorare nel capillare di vetro microfluidica, dovrebbero essere più comodo utilizzare PDMS litografia soft, ora una tecnica comune di laboratorio. Inoltre, le piccole dimensioni delle goccioline che possono essere prodotti è adatto a PERFORm cellulare e saggi biologici in goccioline, e quantificazione e l'ordinamento utilizzando FACS. Per applicazioni industriali, è già stato dimostrato che questi tipi di dispositivi possono essere fabbricati in array e parallelizzati 10, consentendo tassi doppi generazione emulsione aumentare di ordini di grandezza rispetto ai singoli dispositivi. Inoltre, la capacità di formare emulsioni piccole doppie in ampi canali di flusso focalizzazione coassiali dovrebbe rendere il dispositivo resistente alle incrostazioni ed ostruzioni che è critico quando parallelizzare i dispositivi destinati a funzionare per lunghi periodi senza intervento.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di ricerca del California Institute for Quantitative Biosciences (QB3), il Bridging the Gap Award dalla Fondazione Famiglia Rogers, il / Sandler Foundation Program UCSF per Breakthrough Ricerca Biomedica, una borsa di studio dalla BASF, e la NSF attraverso il Programma di Facoltà anticipo di sviluppo di carriera (CARRIERA) (DBI-1.253.293).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Biocompatable surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| 35,000 MW PEG | Sigma Aldrich | 1546660 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1369 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 |
References
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