Introduction
双乳液包括由一中间，不混溶流体层从载体相分离的液滴的，并且是特别令人感兴趣的，因为它们在工业，制药潜在用途，以及生物应用1。在某些情况下，以封装高价值的化合物在双乳剂的核心的能力使材料受到保护和释放以控制的方式。例如，药物可能不适合于外部载体流体 2的溶解度的条件下被封装。此外，中间层的油可以被用作用于药物，化妆品，和营养物质3的封装和递送的胶囊模板。在生物学中，双乳液，可以在高通量筛选有用的，因为它们允许进行子纳升实验数量庞大出来，然后检测和分选使用荧光激活细胞分选（FACS）仪器4,5。
ENT“>双乳液具有所需的性能特性的设计需要的双乳液的尺寸，组合物和均匀性的精确控制。虽然散装乳化过程，如膜乳化，在工业中使用，所得到的乳液是高度多分散的，显示出各种各样的功能特性1。液滴的微流体的字段被自然地适合单分散乳剂的产生与仔细控制组合物6。微流体双乳液生成已经实现了两个主要策略，顺序降制作和玻璃毛细管流聚集。双乳剂可以在使用两步骤降决策过程的平面PDMS的设备来产生。首先，含水包油乳液用的是水包油滴制作具有疏水通道壁的装置的区域。接着创建的，该乳液可以是流入或重新注入与适用于水包油型亲水墙壁下降，使得区域落制作4。然而，PMDS的亲水性表面处理需要额外的制造步骤和通常是暂时的7。最可控和可重复的方法，以形成双乳液是通过共轴流聚焦，一种技术使用玻璃毛细管微流体，由此形成含有三个阶段的同心射流通过一个小孔剪切以产生单分散的液滴8首创。这种技术允许用于生产液滴比通道尺寸小得多的，与双乳液是各相的流速的函数的精确大小和组成。液滴和信道的大小和保护性外鞘流之间的大的差异防止液滴从接触通道壁，使表面处理不必要。然而，这种玻璃设备需要锥形毛细管提示定制加工，以及精心的组装和密封。以前的研究已经用3D软光刻造影生成使用流聚集物理双乳液，但这些设备生产的乳剂，直径>150μm的9,10，要比一般分拣用FACS较大的物体大约一个数量级。一个有吸引力的替代方案将包括强大的功能的玻璃毛细管同轴流量和小液滴产生聚焦与易于制造的硅橡胶软光刻技术。在本文中，我们描述了使用同轴流动聚焦以产生≤50μm的乳剂和完全使用三维软光刻11构成的双乳液生成器。我们的设备采用了翻盖的方法来制造的设备，其中包括一个小剪切通道（图1）来近似所述乳液形成过程中拉玻璃毛细管喷嘴。更重要的是，这些设备不需要特定的表面处理，并且所有的聚合物结构提供简单和可重复的制造SCalable到大量的重复装置。在这里，我们概述了设计，制造和测试的双乳液生成器。双乳液生成被证明是健壮的，可重复至14微米的微滴直径。功能轻松制作的耦合使得该器件一个有吸引力的选项，新的双乳液的应用开发。
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Protocol
1. SU8主制造
- 设计微流体结构中使用AutoCAD软件两层制作，并与10微米的分辨率由印刷电路板上胶片供应商的设计。器件设计的细节在一个附加的基准11和通道几何形状示于图1中 。这些层应该包括对准标记，以帮助从每个制造层 12并置的特征。
- 放置一个预净化3英寸直径的硅晶片上旋涂机和打开真空将其粘贴到卡盘。申请1 ml的SU8-3035在晶片和旋转的中心，持续20秒在500rpm，然后在30秒以2000rpm，提供50μm的层厚度。
- 取出晶片并烘烤上的135℃热板上30分钟。允许晶片移动到下一步骤之前，冷却至室温。
- 揭露涂晶圆到1层掩膜（ 图2A
- 放置在晶片上旋涂机和打开真空将其粘贴到卡盘。申请1 ml的SU8-2050在晶片和旋转的中心，持续20秒在500rpm，然后在30秒在1375转，从而产生层，可提供135微米的附加厚度。
- 移动到下一步骤之前，取出晶片并烘烤上的135℃热板上进行30分钟，然后冷却至室温。
- 第 2次层掩模（图2B）对齐到图案化在1.3的几何形状和涂布的晶片暴露于准直的190毫瓦，365纳米LED 3分钟。曝光后，放置在一个135℃热板上进行1分钟，然后冷却至RT在进行下一步骤之前。
- 通过浸入丙二醇单甲基醚乙酸酯的搅拌浴中30分钟，开发口罩。洗片在异丙醇和烘烤在135℃热板上进行1分钟。将发达师傅在100毫米的培养皿的PDMS成型。
2. PDMS设备制造
- 通过组合50个克硅酮基料而言，用5克在塑料杯中的固化剂1的PDMS：准备10。混合内容物用装有搅拌棒的旋转工具。脱气30分钟，或直至所有的气泡除去的干燥器内的混合物。
- 倒入PDMS，得到厚度为3毫米以上的主站和放置放回干燥器进行进一步脱气。一旦所有的气泡被除去，烘烤设备在60℃下2小时。
- 从使用上清洁的表面与图案的一面了手术刀和地点的模切设备。切PDMS模具一半用刀片从硕士2人（ 图3a）单独的主1。在含有50微米流体处理几何大师1印片，冲流体入口和出口有0.75毫米活检穿孔。
- 等离子治疗装置在1毫巴O 2等离子体60秒，一个300瓦等离子清洗。润湿未打孔片的PDMS的表面上一滴去离子水，以暂时延缓PDMS-PDMS键合，并作为润滑剂。同时通过立体显微镜，地点硕士1人观看的主2面相对滑动面，直至机械锁，实现当凹入框架和图 3A队友伸出帧。
- 将设备放置在一个60℃的烘箱烤的组装的装置（图3B）两天，在60℃以蒸发水和完全粘结。
3.制备试剂
- 填充1ml注射器用蒸馏水内相。
- 填写1毫升注射器与HFE 7500氟油与1重量。 ％生物相容性表面活性剂的表面活性剂13的中间阶段。
- 填充10毫升注射器用10重量％polyethylenë乙二醇（PEG）在含有1重量水溶液。 ％吐温20和1重量％十二烷基硫酸钠为连续相。
4.系统准备
- 放置在微流体芯片上的倒置显微镜加上能够<100微秒的快门速度的数字照相机的阶段。
- 所有装入注射器上的注射泵和连接27G的针头。附加〜PE-2管30厘米长的针头插入有始有终到适当的打孔设备中的漏洞。
- 插入PE-2的10cm长到设备的出口，并放置在一个垃圾收集容器的另一端。
- 素的装置，通过运行速度的高速率的注射泵（2000微升/分钟），直到流体在管段到达装置的入口端口。
5.乳液代
- 聚焦显微镜对包含50微米×50微米孔和一个区域下游出口通道。
- 设定注射器泵将流体输送到双乳剂发生器在250微升/小时的内相，加入100μl/小时为中间相，和700微升/小时的连续相的流速，并等待10分钟以达到平衡。
- 保持内和中间相的流速，在250微升/小时和100微升/小时，分别。在1050微升/小时设定外相的流率。等待3-5分钟为双乳液一代在这组流状况稳定。
- 采集5秒的视频图像时，透过手动图像分析30赫兹脱机处理。
- 重复5.3和5.4 与表1中给出的流速，内和中间相的流速保持恒定和载波相位的流速是通过调节注射器泵的设置来改变。
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Representative Results
双乳剂发生器由使用三维PDMS制造（图1A）产生的共轴流聚焦装置的。几何图形，可允许形成一个三相同轴射流被剪切成一个正方形，50微米×50微米的孔，允许水/油/水双乳液（图1B， 图1C）的形成。的内水相和中间油相都汇集于连接处为10微米的通道尺寸x 50微米（图1D，点“1”）。由于PDMS的疏水性，氟化油拥抱通道壁和内相停留在通道作为流体的中心在连续喷射行进，直到突然膨胀通道扩展达到（图1D，点“2” ）。在这个位置中，内部两相被注入到一个320微米的高大JUNC的中心针对这样可以使相对同心引进水载波相位。这三个阶段被强制进入一个50微米×50微米的孔（图1D，点“3”），从而使载波相位剪的高流速的内两相到细长卷须而分解，从均匀的液滴（ 图1E）。
三维PDMS制造需要的两个独特的硅橡胶模具在翻盖配置成型两种层光刻大师之后的耦合。甲50微米高的层被用于形成所述内和中间流体处理通道，连同上万事达1（图2A）的剪切孔，以及免费凸出和凹进帧上相对的主站。一个附加的135微米高的层被用于创建载体流体和出口通道（图2B）。双乳液发电机组件利用牛逼他凹和等离子体处理（图3B）经过几何对准突出帧（ 图3A）。
双乳液装置在各种流量条件下进行测试以证明不同大小的，单分散的双乳液的形成。对于这些实验中，内和中间相的流速保持恒定和载波相位流速改性液滴生成期间影响剪切力。实验条件是由载波相位流量（Q c）在所述内两相的总和的比率参数流（Q 总和）。产生液滴的以Q C / 3至57 之和q进行的实验图像示于图4中 。观察到含有内两相的细长区域伸入50微米×50微米孔和断裂成液滴被对流下游。一世D.加强载波相位的流量（提高Q C / Q 总和 ）导致所述内相被剪切成能产生更小的液滴逐渐变薄的区域。由该装置在不同的流速产生双乳液显示出5.2％的变化的平均直径系数。液滴直径为q的C / Q 总和选择值的直方图也显示中所产生的微滴（图5）的大小相对均匀性。该装置展示了，以形成双乳液显著较小孔口宽度的能力，并显示出具有增加Q C / Q 总和 （图6）的明确减少的趋势。在最高载波相位流量测试，使用50微米×50微米的小孔形成14微米的双乳液。
图1.几何域金字塔之戒的Ë乳液发电机。在制造的器件的（A）3D模型。 （B）的中心通道表示引入的内（灰色）的垂直横截面，中间（红色），以及载体（蓝色）相。 （C）的横截面示出包含内部两个阶段进入方孔中射流。 （D）的乳液产生在设备顶视图。交界（1）在注入疏水中间相是由亲水性的PDMS，这会导致它的外套通道壁辅助。交界（2）的信道扩展和内两相的射流被剪切成孔（3）由较高的速率流动的连续流体的一个点，其中物理原因液滴形成。 （ 五）复乳一代器件的显微图像。 请点击此处查看该图的放大版本。</ P>
图2.平版印刷生产的主人 。 （A）的用于制备50μm的特征的掩模。主站1是用来模制流体入口，所述内/中间相交界，该乳液产生孔口，以及一个凹槽对准。硕士2包含用于对准凸起的脊。 （二）用于制备135微米功能的面膜。主人是包含载液布线通道和出口通道镜像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.大会PDMS设备 。 （
图生成双乳液4.图像以不同的流速。外相的流速被改变，以改变Q C / Q 总和 ，这是考虑到每个图像的左侧。增加Q C / Q 总和变窄通过节流孔被剪切内液体的喷射，产生越来越小的液滴。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.直方图双乳液液滴的尺寸在不同的流速 。在给定的流动条件下生产的乳滴的直径平均变异系数为5.2％。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.雾滴直径与归一化的流量参数 。调整连续相的流速可以生产双乳液是30％的孔径-100％的。 请点击此处查看该图的放大版本。
用于实验表1流速的参数。内相和中间相的流速（Q I，Q 米 ）被保持不变，从而以恒定的组合流速（Q 总和）。载波相位流动速率（QC）是变化的，以产生双乳液具有不同的直径。的比例Q C / Q 总和是主无量纲参数描述的实验条件。
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Discussion
这里所描述的双乳液生成几何形状设计模仿的玻璃毛细管装置8的物理过程。在这些，对齐圆筒形玻璃毛细管用于创建被剪切成均匀的双乳液液滴三相同轴射流。我们的3D PDMS装置的功能是依赖于用50微米高的制造具有载波相位通道是320微米的总高度形成小的特征的中心对准。有一个显著潜力以错开的第二层掩模，在步骤1.7图案相对于50μm的高大几何的高功能，如果掩模不能准确地对准。适当的对准可以通过设计对准标记，例如同心圆入口罩被共同定位过程中的照片图案化来辅助。的装置的两个半体的PDMS等离子体键合是可能导致最终器件的显著不对准的第二过程。等离子焊接PDMS至PDMS的一般是瞬间的，所以在步骤2.4，我们描述了装置表面的润湿用DI水以延迟接合并允许处理，使得在图3A中所示的对准帧可被允许以锁定。如果这是试图在没有足够的湿润，在PDMS表面将不可逆转键进入适当的调整之前，和设备必须加以处置和新的PDMS模具制作。
双乳液装置设计成采取的制造技术优点，即该铅均匀疏水表面性质。然而，在该协议中描述的参数之外的操作要求所要求的流体方法的一些了解。内层和中间相的交界处（图1D，点“1”），内相和中间相的低流量的相对高的流创建的两相喷射，与疏水性中间相涂敷的通道壁。如果中间相的比例流量增加，离散水包油微滴的产生将开始发生，消除以形成相干的三相喷射在孔（图1D滴形成的能力，点“3” ）。后的信道的扩展（图1D，点“2”），一个显著量的载体相流的需要来创建中间相和疏水通道壁之间的几何距离。在载波相位流量减少，最终将导致中间相润湿的疏水性设备的壁。显著减少载波相位流动可产生流动条件不足以剪切的内相为长，细丝，从而从根本上改变的双乳液液滴形成的物理过程。
一旦建成，该装置的设计，生产从14双乳液到50微米，一个方便的大小商业FACS分拣使用仪器。如果超出该尺寸范围双乳液期望，孔尺寸需要从这里使用的50微米×50微米大小缩放。因为该设备被设计为产生水/油/水双乳液有均匀的疏水表面性质，油/水/油双乳液不能创建除非有施加到使设备均匀地亲水表面处理。
这项工作表明一个简单的制造PDMS设备能够健壮形成水/油/水双重乳液。虽然以前的研究报告双乳液的使用3D光刻14,15创建的设备的形成，形成了他们的设备的双乳液有直径分别测量微米100S的。这里所报告的设备适合于生产双乳液幅度比这个更小的顺序，提供卷类似于哺乳动物细胞和适合于由FA排序CS。
虽然这些结果也可以用玻璃毛细管微流控技术，制造玻璃的设备来实现是费力的，需要很多动手的每个设备的步骤。对于我们所有的PDMS设备制造主要包括铸造，焊接，烘烤PDMS板，这是简单的，重复的，并且易于扩展到大量进程。
一个光刻制造的器件的效用来生成使用共轴流聚焦已证明双乳液。我们希望简单的制造和这双乳液发生器的设计强大的功能应该导致其适应的科学和工业应用。以前在玻璃毛细管微流控芯片工作所需的专业技能阻止调查人员，使用硅橡胶软光刻，现在常见的实验室技术应该会更舒适。此外，可以产生小的液滴尺寸很适合于perfor米细胞并以小滴的生物测定法，定量和使用FACS分选。对于工业应用，它已经被证明，这些类型的设备可被制造成阵列和并行化10，使双乳剂产生率相比，单个设备，以提高到几个量级。此外，能够形成大的同轴流量聚焦通道小双乳液应使设备抵抗结垢和堵塞，并行旨在在不干预运行较长的时间的设备时，这是至关重要的。
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Acknowledgments
这项工作是由研究奖由美国加州理工学院定量生物科学（QB3），在缩小差距奖由罗杰斯家族基金会，加州大学旧金山分校/桑德勒基金会计划为突破生物医学研究，从巴斯夫赠款和美国国家科学基金会通过支持学院早期职业发展（CAREER）计划（DBI-1253293）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Biocompatable surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| 35,000 MW PEG | Sigma Aldrich | 1546660 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1369 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 |
References
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