Flowcytometri kan udnyttes til at vurdere tilstanden af kromatin i T-celler. Denne protokol giver forskerne at fortolke bevis for chromatin dekondensering under T-celleaktivering påvises ved en stigning i den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) af fluorescerende histon H3 antistoffer
Under et svar korrekt immunrespons, bliver hvilende T-celler aktiveres ved antigenpræsentation til deres antigen-specifik T-cellereceptor. Dette fører til klonal proliferation af kun de T-celler, som bærer en receptor, der genkender antigenet. Chromatin dekondensering er kendetegnende for T-celleaktivering og er nødvendig for T-celler at erhverve evnen til at proliferere efter antigen engagement. Denne ændring i chromatinkondensering kan detekteres under anvendelse af antistoffer rejst mod histonproteiner. Disse antistoffer kan ikke binde til deres epitoper i naive T-celler såvel som de kan i aktiverede T-celler. Vi beskriver, hvordan man samtidig plette T-celle-specifikke overflademarkører, levedygtighed spor med en fixable døde celle pletten, og måle kromatin status via intracellulær farvning af histon H3 proteiner. Farvede celler analyseres ved flowcytometri og chromatinkondensering status måles som den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af histon H3 pletten. Chromati dekondensering under T-celleaktivering er påvist som en stigning i MFI
Flowcytometri er en laserbaseret teknologi udviklet til analyse af flere fysiske og fluorescerende parametre i cellepopulationer. Denne teknologi fungerer som suspenderede celler i en strøm af fluid støder en laser, spændende fluorescerende markører på eller inden i cellerne. Disse markører derefter udsender lys, der detekteres og kvantificeres ved fotomultiplikatorrør. Mens flowcytometri traditionelt har været anvendt til at identificere populationer af celler, har det vist sig at være en nyttig teknologi, når man studerer en bred vifte af celleegenskaber, herunder cellemembranens integritet, protein-protein interaktioner og protein handel 1-3. Vi har udviklet en protokol, der tillader denne teknologi, der skal anvendes til at detektere tilstanden af kromatin i T-celler, når de aktiveres in vitro 4. Vi har også brugt denne protokol til at undersøge mekanismen for aktivering-induceret chromatin dekondensering af T-celler 5.
T-celle activation og proliferation er afgørende for et svar korrekt immunrespons. T-celler, en specifik undergruppe af lymfocytter i immunsystemet, der er nødvendige for korrekt immunrespons og udvikling af immunologisk hukommelse. Aktivering initieres, når et antigen præsenteres i forbindelse med den større kompatibilitet komplekset til T-cellereceptoren (TCR) placeret på den ekstracellulære overflade af hvilende T-celler (gennemgået i 6). Dette udløser en række dynamiske og stærkt ordnede molekylære begivenheder i T-celler, som kulminerer i en stigning i intracellulær Ca2 + -koncentration 7 og nuklear translokation af transkriptionsfaktorer, der er nødvendige for aktivering (revideret i 8-10). Når den er aktiveret, får T-celler evnen til at reagere på Interleukin-2 (IL-2), en potent vækstfaktor, som udnytter JAK (Janus kinase) / STAT (signaltransducer og aktivator af transkription) pathway at drive klonal proliferation af aktiverede T celler 11. Kort fortalt, IL-2-stimuleringresulterer i phosphorylering af STAT-proteiner, en familie af cytosoliske latente transkriptionsfaktorer. Når phosphoryleret, STAT proteiner dimeriserer, translokere til kernen og drev ekspression af gener, herunder de involverede i cellecyklusprogression. I T-celler, IL-2 signaler via STAT5, som er nødvendig for T-celleproliferation 12,13.
For at opnå klonal ekspansion af aktiverede T-celler, skal de celler, der ikke har oplevet antigen-TCR engagement (naive T-celler), har en mekanisme til at ignorere de potente virkninger af IL-2. Dette opnås via reguleringen af kromatin status. Naive T-celler har en kondenseret kromatin, som forbyder STAT5-DNA engagement som respons på IL-2-stimulering. Ved aktivering kan kromatin decondenses og STAT5 adgang til initiativtagerne til målgener, tillader klonal proliferation 4. Interessant denne ændring i kromatin status er ikke afhængig af epigenetisk modifikation af histon Proteins (til gennemgang, se 14), da vi observeret nogen globale ændringer i histon modifikation under T-celle aktivering 4.
Under udførelsen af disse undersøgelser, opdagede vi, at antistoffer rejst mod histonproteiner havde også svært ved at få adgang til deres epitoper i naive celler, men ved aktivering kunne lettere binde deres epitoper 4. Således antistofbinding til histoner fungerer som en udlæsning for chromatinkondensation status. Her præsenterer vi den metode at anvende flowcytometri til at detektere fluorescens konjugeret histon H3 antistoffer med henblik på at vurdere kromatin status i T-celler. Chromatinkondensering i en population af celler måles som den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) på histon H3-farvning. I forbindelse med T-celleaktivering, MFI histon H3 farvning stiger, symboliserer dekondensering af kromatin. Ud over at måle kromatin status via intracellulær Histone H3 farvning, denne protokol også incorporates overflade farvning og en fixable plet for levende celler, tillader analyse af subpopulationer af celler.
Vi udviklede en protokol, der giver mulighed for vurdering af chromatinkondensering i T-celler. Den er afhængig af den simple iagttagelse, at histon H3-antistoffer ikke kan få adgang til deres epitoper let i naive celler, men på T-celle aktivering, de samme antistoffer er i stand til at binde sig til deres epitoper. Ved at sammenligne MFI af histon H3 farvning mellem behandlingsgrupperne, kan bestemmes den relative grad af kondensvand eller dekondensering. Vi har brugt denne protokol til at bestemme relative kondens status under thymocyt udvikling og under T-celle aktivering 4. Vi har også brugt denne protokol til at undersøge de mekanismer, der styrer dekondensering processen 5.
Denne protokol bygger på anvendelsen af en histon H3-antistof til påvisning chromatinkondensering status. Da der ikke er nogen global ændring i histon modifikation under T-celle-aktivering 4, er vi i stand til at bruge en H3K4me1 antistof til at vurdere kromatinstatus i denne protokol. Vi har brugt antistoffer mod umodificeret Histone H3; imidlertid signalet produceret var meget svagere samlet. Det er vores erfaring, antistoffer mod modificeret Histone H3 fungere bedre i immunfluorescens og flowcytometri analyser, mens antistoffer mod umodificeret Histone H3 fungere bedre i Western blot. Det skal bemærkes, at det også er muligt at anvende antistoffer mod andre histonproteiner, selv om vi ikke har forsøgt det.
De Perm / Block og histon H3 antistof trin er de mest kritiske trin i protokollen. Mængden af Perm / blokeringsopløsning anvendes skal optimeres hver gang bestanden Perm opløsningen er fremstillet. Dette kan gøres ved at sammenligne effektiviteten af forskellige fortyndinger af stamopløsningen. Et typisk eksperiment omfatter en sammenligning kromatin status i naive T-celler til dem aktiveret i 3 timer (figur 4). Man bør vælge den fortynding, der producerer den største ændring i MFI løbettidsperioden analyseret. Stamopløsningen kan fortyndes i PBS + 2% for at mindske Perm / Block styrke ved først at resuspendering af cellerne i så meget som 100 ml PBS + 2% efter trin 3.4 og derefter tilsætte Perm / Block i trin 3.5. Et lignende pilotforsøg bør anvendes til at teste forskellige fortyndinger af fluorescens konjugeret histon H3-antistof hver gang et nyt parti af antistof er mærket. Disse trin er særligt afgørende for en vellykket påvisning af kondensationsprodukter forskelle tidligt i T-celleaktivering (f.eks indenfor 3 timer for aktivering). Indimellem er der celler, som ikke får permeabiliserede og vil således ikke farves med histon H3 antistof. Dette kan ske, hvis cellerne ikke resuspenderes godt, når tilsætning af Perm / Bloker eller hvis Perm / Block er ikke stærk nok. Disse celler vises som begivenheder presses mod aksen, når visualisere et histogram af histon H3 farvning. Da disse begivenheder vil forvrænge den samlede MFI, kan disse begivenheder udelades fra analyse af Gating den normale fordeling af histon H3-positive celler. Kan findes yderligere hjælp i Vejledning til fejlfinding (tabel 1).
Inkluderingen af et fixable døde cellefarvende muliggør vurdering af cellelevedygtighed i assayet. Dette er helt afgørende, når manipulere T-celle aktivering, fordi visse stimuli kan fremkalde celledød. I et sådant tilfælde, kan histon H3 antistoffet binder histoner i døde celler anderledes end levende celler, hvilket fører til fejlfortolkninger af resultaterne.
Denne protokol er udviklet til brug i 96-brønds plade-format, tillader en høj produktion analyse af kromatin status. En milt fra en 6-8 uger gammel hunmus vil typisk give mellem 60 til 90.000.000 celler ved anvendelse af protokollen. Da farvningsprotokollen kræver 2 millioner celler pr prøven, kan man nemt analysere flere behandlingsgrupper og tidspunkter i tre eksemplarer med en enkelt milten på en enkelt plade med 96 brønde. Det er muligt at perform protokollen med mindre celler pr prøve; Men på grund af antallet af trin og centrifugeringstrin den iboende tab af celler ved hvert af disse trin, er det ikke tilrådeligt at sænke antallet af celler ved meget. Vi har med succes gennemført protokol med 1 million celler pr prøve.
Vi brugte denne protokol til at undersøge kromatin status i CD4 + T-hjælper celler og CD8 + cytotoksiske T-celler. Dette er gjort muligt, fordi protokollen indeholder standard overflade farvning. Protokollen kunne let tilpasses til undersøgelse af kromatin i andre lymfocytsubpopulationer ved at bruge antistoffer mod befolkningens-specifikke overflademarkører. Denne protokol kan også nemt tilpasses til andre celletyper, så længe antistoffer, der genkender relevante overflademarkører er tilgængelige og korrekt fiksering / permeabilisering betingelser er kendt.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (5 P20 RR016461 og 8 P20 GM103499), National Science Foundation (EPS-0.903.795). Yderligere støtte fra Furman Universitets forskning og faglig udvikling og Furman Advantage prisuddelinger.
100mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
Precleaned frosted microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363548 | |
3mL syringe, Luer-Lok tip | BD | 309585 | |
Falcon 50mL polypropylene conical tube | Corning | 352098 | |
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit | Life Technologies | L23102 | Life Technologies sells versions of this kit with different colors |
Fc Block | BD Biosciences | 553142 | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Normal rabbit serum | Sigma-Aldrich | R9133 | |
Anti-H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
R-Phycoerythrin conjugation kit | Abcam | ab102919 | Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used |