फ्लो का उपयोग टी कोशिकाओं में chromatin की स्थिति का आकलन करने के लिए

Summary

प्रवाह cytometry टी कोशिकाओं के भीतर क्रोमेटिन की स्थिति का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल वैज्ञानिकों फ्लोरोसेंट histone H3 एंटीबॉडी का मतलब पुष्पन तीव्रता (एमएफआई) में वृद्धि के द्वारा प्रदर्शन किया टी सेल सक्रियण के दौरान क्रोमेटिन decondensation के सबूत की व्याख्या करने की अनुमति देता है

Abstract

एक उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान मौन टी कोशिकाओं को उनके विशिष्ट प्रतिजन टी सेल रिसेप्टर को प्रतिजन प्रस्तुति पर सक्रिय हो जाते हैं। इस प्रतिजन पहचानता है कि एक रिसेप्टर सहन कि केवल उन टी कोशिकाओं के प्रतिरूप प्रसार की ओर जाता है। क्रोमेटिन decondensation टी सेल सक्रियण की एक बानगी है और टी कोशिकाओं प्रतिजन सगाई के बाद पैदा करना करने की क्षमता हासिल करने के लिए आवश्यक है। क्रोमेटिन संक्षेपण में यह परिवर्तन हिस्टोन प्रोटीन के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। ये एंटीबॉडी सक्रिय टी कोशिकाओं में के रूप में अच्छी तरह से वे कर सकते हैं भोले टी कोशिकाओं में उनकी एपिटोप्स करने के लिए बाध्य नहीं कर सकते। हम एक साथ एक फिक्स मृत सेल दाग के साथ टी सेल विशिष्ट सतह मार्कर, ट्रैक व्यवहार्यता दाग, और हिस्टोन H3 प्रोटीन के intracellular धुंधला के माध्यम से क्रोमेटिन स्थिति को मापने के लिए कैसे का वर्णन है। दाग कोशिकाओं प्रवाह cytometry से विश्लेषण कर रहे हैं और क्रोमेटिन संक्षेपण स्थिति histone H3 दाग का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) के रूप में मापा जाता है। Chromatटी सेल सक्रियण के दौरान decondensation में एमएफआई में वृद्धि के रूप में प्रदर्शन किया है

Introduction

प्रवाह cytometry सेल आबादी में कई शारीरिक और फ्लोरोसेंट मापदंडों का विश्लेषण के लिए विकसित किया गया एक लेजर आधारित तकनीक है। इस तकनीक पर या कोशिकाओं के भीतर तरल पदार्थ मुठभेड़ की एक धारा में निलंबित कर दिया कोशिकाओं के रूप में एक लेजर, रोमांचक फ्लोरोसेंट मार्करों काम करता है। इन मार्करों तो पता चला और photomultiplier ट्यूब द्वारा मात्रा निर्धारित है कि प्रकाश का उत्सर्जन। फ्लो का पारंपरिक रूप से कोशिकाओं की आबादी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, यह कोशिका झिल्ली अखंडता, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और प्रोटीन की तस्करी ^1-3 सहित सेल संपत्तियों की एक सरणी का अध्ययन करते समय एक उपयोगी प्रौद्योगिकी साबित हो गया है। हम इस तकनीक वे इन विट्रो ⁴ में सक्रिय कर रहे हैं के रूप में टी कोशिकाओं में क्रोमेटिन की स्थिति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है कि एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। हम यह भी टी कोशिकाओं ⁵ की सक्रियता को प्रेरित क्रोमेटिन decondensation के तंत्र की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है।

टी सेल activation और प्रसार के लिए एक उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं। टी कोशिकाओं, प्रतिरक्षा प्रणाली के भीतर लिम्फोसाइटों के एक विशिष्ट सबसेट, उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति के विकास के लिए आवश्यक हैं। एक प्रतिजन ⁽⁶ में समीक्षा) मौन टी कोशिकाओं की बाह्य सतह पर स्थित टी सेल रिसेप्टर (TCR) को प्रमुख अनुकूलता परिसर के संदर्भ में प्रस्तुत किया जाता है जब एक्टिवेशन शुरू की है। इस इंट्रासेल्युलर सीए 2 + एकाग्रता ⁷ और ^(8-10 में समीक्षा) क्रियान्वयन के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारक के परमाणु translocation में वृद्धि में culminate कि टी कोशिकाओं के भीतर गतिशील और अत्यधिक आदेश दिया आणविक घटनाओं की एक श्रृंखला चलाता है। एक बार, टी कोशिकाओं इंटरल्यूकिन -2 (आईएल -2), जे ए (जानूस Kinase) / स्टेट इस्तेमाल करता है कि एक शक्तिशाली वृद्धि कारक के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता हासिल सक्रिय (सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन का उत्प्रेरक) मार्ग सक्रिय टी का प्रतिरूप प्रसार करने के लिए ड्राइव ¹¹ कोशिकाओं। संक्षेप में, आईएल -2 उत्तेजनास्टेट प्रोटीन, अव्यक्त साइटोसोलिक प्रतिलेखन कारकों में से एक परिवार के फोस्फोराइलेशन में परिणाम है। फॉस्फोरिलेटेड एक बार, स्टेट प्रोटीन dimerize, नाभिक को सरकाना और कोशिका चक्र प्रगति में शामिल लोगों सहित जीनों की अभिव्यक्ति ड्राइव। टी कोशिकाओं में, टी सेल प्रसार ^12,13 के लिए आवश्यक है, जो STAT5, के माध्यम से आईएल -2 का संकेत है।

सक्रिय टी कोशिकाओं का प्रतिरूप विस्तार को प्राप्त करने के लिए, प्रतिजन TCR सगाई (भोले टी कोशिकाओं) का अनुभव नहीं है कि उन कोशिकाओं, आईएल -2 के शक्तिशाली प्रभाव की अनदेखी करने के लिए एक तंत्र होना चाहिए। इस क्रोमेटिन स्थिति के विनियमन के माध्यम से हासिल की है। भोले टी कोशिकाओं आईएल -2 उत्तेजना के जवाब में STAT5 डीएनए सगाई पर प्रतिबंध लगाता है कि एक गाढ़ा क्रोमेटिन के पास है। सक्रियण पर, क्रोमेटिन decondenses और STAT5 क्लोनल प्रसार ⁴ की अनुमति, लक्ष्य जीन के प्रमोटरों का उपयोग कर सकते हैं। दिलचस्प बात यह है क्रोमेटिन स्थिति में इस परिवर्तन हिस्टोन protei की epigenetic संशोधन पर निर्भर नहीं हैएनएस (समीक्षा के लिए, ¹⁴ देखें) हम टी सेल सक्रियण ⁴ के दौरान हिस्टोन संशोधन में कोई वैश्विक परिवर्तन के रूप में मनाया।

इन अध्ययनों प्रदर्शन करते हुए, हम हिस्टोन प्रोटीन के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी भी भोले कोशिकाओं में उनके एपिटोप्स पहुँचने मुश्किल था कि पता चला है, लेकिन सक्रियण पर कि और अधिक आसानी से उनकी एपिटोप्स ⁴ बाध्य कर सके। इस प्रकार, histones के लिए बाध्य एंटीबॉडी क्रोमेटिन संक्षेपण की स्थिति के लिए एक readout के रूप में कार्य करता है। यहाँ हम विधि टी कोशिकाओं में क्रोमेटिन स्थिति का आकलन करने के क्रम में fluorescently संयुग्मित histone H3 एंटीबॉडी का पता लगाने के प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए उपस्थित थे। कोशिकाओं की आबादी में chromatin संघनन histone H3 धुंधला का मतलब पुष्पन तीव्रता (एमएफआई) के रूप में मापा जाता है। क्रोमेटिन की decondensation वाचक टी सेल सक्रियण, हिस्टोन H3 धुंधला बढ़ जाती है की एमएफआई, के संदर्भ में। इंट्रासेल्युलर histone H3 धुंधला के माध्यम से क्रोमेटिन स्थिति को मापने के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी incorporaटीईएस कोशिकाओं के उप-जनसंख्या के विश्लेषण की अनुमति, धुंधला हो जाना और जीवित कोशिकाओं के लिए एक फिक्स दाग सतह।

Protocol

इस अध्ययन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार बाहर किया गया था। पशु प्रोटोकॉल Furman विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (: A3242-01 परमिट नंबर) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस्तेमाल किया बफ़र्स बफ़र और समाधान की तालिका में पाया जा सकता है, जबकि इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी सामग्री और उपकरण, सामग्री और उपकरणों की तालिका में पाया जा सकता है। माउस Spleens से लिम्फोसाइटों के 1. एकल कक्ष निलंबन सीओ 2 asphyxiation के माध्यम से चूहों बलिदान। ग्रीवा अव्यवस्था से इच्छामृत्यु की पुष्टि करें। नोट: एक ही लिंग के (जैसे, / 6 C57B) दो 6-8 सप्ताह पुरानी isogenic चूहों से spleens का प्रयोग करें। आमतौर पर, दो spleens कार्रवाई कर रहे हैं। दरियादिली से 70% इथेनॉल समाधान और सिर के बाएं सामना कर रहा है कि इस तरह के ओरिएंट के साथ जानवरों का छिड़काव करें। संदंश का प्रयोग, ऊपर और दूर टी से जानवर की त्वचा उठावह शरीर। कैंची का प्रयोग, जानवर के पेट के पास की त्वचा के माध्यम से एक छोटा सा पायदान काटा। उंगलियों का प्रयोग, पिछले पैरों की शुरुआत करने के लिए गर्दन से पेरिटोनियम बेनकाब करने के लिए पायदान के प्रत्येक पक्ष खींच। तिल्ली पेरिटोनियम नीचे सीधे दिखाई जानी चाहिए। संदंश का प्रयोग, पेरिटोनियम उठा और तिल्ली का पर्दाफाश करने के लिए एक छोटा सा चीरा बनाते हैं। संदंश के साथ तिल्ली निकालें और किसी भी वसा और संयोजी ऊतक दूर तंग करने के लिए कैंची का उपयोग करें। 2% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक 10 मिलीलीटर पीबीएस युक्त एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में तिल्ली की जगह (इसके बाद पीबीएस + 2% के रूप में करने के लिए कहा गया है)। एकल कक्ष निलंबन शुरू करने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर ट्यूब रखें। नोट: विशिष्ट वसूली तिल्ली प्रति 60-90,000,000 बीच कोशिकाओं है, और आम तौर पर, 2 मिलियन कोशिकाओं नमूना प्रति की जरूरत है। एक टिशू कल्चर हुड में निम्नलिखित कदम के सभी प्रदर्शन करते हैं। एक बाँझ 100 मिमी टिशू कल्चर डिश में spleens छानना। टी दो तुहिनाच्छादित खुर्दबीन स्लाइड प्राप्त करें और पकड़दो किसी न किसी तुहिनाच्छादित सतहों एक दूसरे के प्रति अंदर की ओर का सामना करना पड़ता है, ताकि वह स्लाइड। पीबीएस + 2% समाधान में स्लाइड्स गीले पेट्री डिश में डाल दिया। अभी भी जलमग्न किनारों के साथ, स्लाइड के तुहिनाच्छादित सतहों के बीच तिल्ली पकड़ो, और एक दूसरे (चित्रा 1 ए) के खिलाफ आगे और पीछे स्लाइड ले जाकर धीरे तिल्ली पीस। कोशिकाओं पेट्री डिश में गिर जाएगी। सभी कोशिकाओं को जारी की है और तिल्ली के अवशेष (चित्रा 1 बी) सफेद दिखाई दिया गया है जब तक पीस जारी रखें। एक pipet में सेल निलंबन ड्रा और एक नया बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से धीरे-धीरे यह फिल्टर। लाल रंग का गूदा के छोटे टुकड़े फिल्टर (2A चित्रा) पर उपस्थित रहेंगे कि ध्यान दें। फिल्टर तक बढ़ जाता है, तो धीरे आवश्यक के रूप में इस प्रक्रिया को दोहरा, तरल पदार्थ के माध्यम से पलायन और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में वापस फिल्टर जगह और जारी रखने के लिए अनुमति देने के लिए यह थोड़ा ऊपर उठा। अधिक से अधिक 5 sple प्रसंस्करण हैंसत्ता, यह दो बैचों में विभाजित है और प्रत्येक के लिए एक नया फिल्टर का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है। एक 3 मिलीलीटर सिरिंज की डाट हिस्से के प्रयोग धीरे झरनी (चित्रा 2 बी) के माध्यम से शेष कोशिकाओं से युक्त लाल लुगदी दबाएँ। सभी लाल गूदा फिल्टर (चित्रा -2) के माध्यम से पारित कर दिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए फिल्टर नीचे और पक्षों दोनों प्रेस करने के लिए सुनिश्चित करें। टिशू कल्चर डिश के लिए 10 mlof पीबीएस + 2% जोड़ें और किसी भी शेष कोशिकाओं को ठीक करने के लिए स्लाइड, सिरिंज डाट, और पकवान धोने के लिए इस का उपयोग करें। 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ही 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से इस गुजरती हैं। इस कदम के रूप में आवश्यक दोहराएँ। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर फ़िल्टर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। धीरे छानना और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, सावधान नहीं गोली परेशान करने के लिए। पीबीएस + 2% की मात्रा का पता लगाने ट्यूब में छोड़ दिया जाएगा। ट्यूब टोपी और गोली पूरी तरह से resuspended है जब तक गोली झटका। विज्ञापन द्वारा Lyse लाल रक्त कोशिकाओंएसीके lysis बफर के डिंग 2 एमएल (0.15 एम एनएच 4 सीएल, 1 मिमी KHCO 3, 0.1 मिमी EDTA, 4 डिग्री सेल्सियस पर 7.2, स्टोर करने के लिए पीएच) शंक्वाकार ट्यूब तिल्ली प्रति और बारी बारी से और यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब पलटना कि सभी कोशिकाओं एसीके बफर के साथ संपर्क में आते हैं। धीरे आरटी पर 1 मिनट के लिए ट्यूब ज़ुल्फ़। पीबीएस + 2% एसीके बफर बेअसर करने के लिए ट्यूब जोड़कर 50 मिलीलीटर सेल निलंबन की मात्रा लाओ। 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 XG पर 5 मिनट के लिए ट्यूब में 10 बार और सेंट्रीफ्यूज उलटें। Centrifugation के बाद पूरा हो गया, गोली व्हाइट (चित्रा 3) होना चाहिए। धीरे छानना और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, सावधान नहीं गोली परेशान करने के लिए। ट्यूब में पीबीएस + 2% की मात्रा का पता लगाने छोड़ दो ट्यूब टोपी, और यह resuspend को गोली झटका। टी सेल मीडिया [10% FBS, 10 मिमी HEPES (पीएच 7.0), 2 मिमी GlutaMAX, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1X गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 50 मिमी β-mercaptoethanol], और आगे के 10 मिलीलीटर जोड़ें धीरे से गोली resuspendऊपर और नीचे pipetting। फिर एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक नया 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निलंबन फिल्टर। मूल ट्यूब कुल्ला और फ़िल्टर कोशिकाओं के बाकी युक्त ट्यूब में 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से यह पारित करने के लिए टी सेल मीडिया के एक और 5-10 मिलीलीटर का प्रयोग करें। दो से अधिक spleens प्रसंस्करण, तो टी सेल मीडिया की मात्रा वसूली को अधिकतम करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। तैयार दाग हो जब तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें। कोशिकाओं गिना और व्यवहार्यता पहुँचा किया जाना चाहिए। कोशिकाओं की गिनती करने के लिए, 24 पीबीएस + 2% की मिलीग्राम और 3 मिलीलीटर 0.4% trypan नीले रंग के साथ कोशिकाओं के 3 मिलीग्राम गठबंधन। लोड एक बेहतर Neubauer hemocytometer के प्रत्येक कक्ष में इस में से 10 मिलीलीटर। Trypan नीले अपवर्जन द्वारा मूल्यांकन के रूप में व्यवहार्यता, 85-95% के बीच आम तौर पर है। 2. व्यवहार्यता और सतह धुंधला 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 XG पर 10 मिनट के लिए centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं। 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए टी सेल मीडिया में कोशिकाओं Resuspend। Transfयू-तली 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के एक कुएं में एर 2 मिलियन कोशिकाओं (100 मिलीलीटर)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 XG पर 10 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह से थाली अपकेंद्रित्र। अच्छी तरह से सिंक में अच्छी तरह से थाली के भीतर तरल flicking द्वारा प्रत्येक से सतह पर तैरनेवाला निकालें (सेल गोली अच्छी तरह से में रहना होगा) और एक साफ कागज तौलिया पर प्लेट dabbing। 200 μl पीबीएस में उन्हें resuspending द्वारा कोशिकाओं को धो 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा पीछा किया। जब तक अन्यथा नोट सभी washes इस तरह से प्रदर्शन करते हैं। नोट: यह फिक्स पीआई दाग के साथ हस्तक्षेप करेगा के रूप में पीबीएस + 2% का प्रयोग न करें। प्लेट flicking द्वारा तैरनेवाला निकालें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए हौसले से तैयार वाणिज्यिक दाग (जैसे, फिक्स लाल मृत सेल दाग) के 100 मिलीलीटर जोड़ें। पीबीएस में 1:10 कमजोर पड़ने से पीछा DMSO में प्रतिक्रियाशील डाई शेयर समाधान 1:10 गिराए द्वारा दाग बनाओ। प्रकाश से सुरक्षित 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। पी अपकेंद्रित्रदेर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 XG पर 10 मिनट के लिए। आगे इस बिंदु पर, बंद टिशू कल्चर हुड प्रकाश के साथ थाली के साथ सभी काम करते हैं। प्लेट flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें और फिर एफसी ब्लॉक समाधान के 100 मिलीलीटर जोड़ें। एफसी ब्लॉक स्टॉक समाधान 1 गिराए द्वारा एफसी ब्लॉक समाधान करें: पीबीएस में 100। पतला एंटीबॉडी पीबीएस में सतह धुंधला के लिए (जैसे, विरोधी सीडी 4 या विरोधी सीडी 8) का इस्तेमाल किया और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 मिलीलीटर जोड़ने की जाए। प्रकाश से रक्षा 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं। नोट: सतह दाग एंटीबॉडी अनुकूलतम प्रदर्शन के लिए titered किया जाना चाहिए। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, 400 कमजोर पड़ने: 200 या 1: आमतौर पर एक 1 का उपयोग करें। Histone H3 के लिए 3. Intracellular धुंधला सतह दाग की ऊष्मायन के बाद, पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धो लें। पिछले धोने के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 4% paraformaldehyde के 100 μl जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं। Dilut द्वारा 4% paraformaldehyde बनाओपीबीएस में 16% paraformaldehyde हैैं। इस ताजा बनाओ। पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धो लें। पेर्म / ब्लॉक समाधान करें (शेयर पेर्म समाधान पीबीएस + 2% + 0.02% ट्राइटन X-100, स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर) 100 मिलीलीटर शेयर पेर्म समाधान के अनुसार सामान्य खरगोश सीरम के 2 मिलीलीटर के संयोजन के द्वारा। 60 मिलीग्राम / नमूना के लिए पर्याप्त बनाओ। धीरे बुलबुले बनाने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के लिए 40 मिलीलीटर पेर्म / ब्लॉक और मिश्रण जोड़ें। अंधेरे में 45 मिनट के लिए आरटी पर थाली सेते हैं। 3.6 कदम के लिए पेर्म / ब्लॉक शेष बचाओ। 3.5 चरण में आरक्षित पेर्म / ब्लॉक समाधान में fluorescently संयुग्मित Histone H3K4me1 एंटीबॉडी पतला और अच्छी तरह से प्रत्येक को यह कमजोर पड़ने के 10 μl जोड़ें। धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं। नोट: निर्माता के निर्देशों का पालन आर-phycoerythrin विकार किट का उपयोग कर संयुग्मित एक H3K4me1 एंटीबॉडी का प्रयोग करें। दो बार पीबीएस + 2% में कोशिकाओं को धो लें। 200 में कोशिकाओं Resuspendपीबीएस + 2% μl और प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए FACS ट्यूबों के लिए नमूने हस्तांतरण। नमूने अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। इष्टतम परिणामों के लिए दो दिनों के भीतर नमूनों का विश्लेषण। अकेले दाग नमूने मुआवजा नियंत्रण प्रवाह cytometry के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Representative Results

एक C57B / 6 माउस से लिम्फोसाइटों प्रोटोकॉल के अनुसार एक एकल कक्ष निलंबन में कार्रवाई की और एक मानक hemocytometer गिनती का उपयोग कर रहे थे। कोशिकाओं 2 एक्स 10 टी सेल मीडिया में 6 मिलीग्राम / 15 में मिलीलीटर में तीन प्रतियों में शंक्वाकार ट्यूबों वरीयता प्राप्त और इलाज छोड़ दिया, या में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल घुलनशील विरोधी CD3 एंटीबॉडी (क्लोन 4C11) साथ प्रेरित किया गया एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर। मृत कोशिकाओं दाग थे और फिर कोशिकाओं तो प्रोटोकॉल के अनुसार FITC-सीडी 8 और एपीसी-सीडी 4 एंटीबॉडी का उपयोग दाग सतह थे। हिस्टोन पहुंच फ्लो (चित्रा 4) के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। दोनों भोले सीडी 4 + और ​​CD8 + टी कोशिकाओं में, मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) एक संक्षिप्त क्रोमेटिन राज्य वाचक, कम है। कोशिकाओं विरोधी CD3 के साथ सक्रिय कर रहे हैं जैसा कि क्रोमेटिन decondensed है कि यह दर्शाता (पी <0.001, छात्र टी परीक्षण) काफी एमएफआई बढ़ जाती है एंटीबॉडी। तुहिनाच्छादित खुर्दबीन स्लाइड का उपयोग कर एक एकल कक्ष निलंबन में spleens प्रसंस्करण के लिए चित्रा 1. तकनीक। (ए) तिल्ली दो माइक्रोस्कोप स्लाइड के तुहिनाच्छादित सतहों के खिलाफ दबाया जाता है। (बी) स्लाइड तिल्ली के अवशेष सफेद होते हैं जब तक एक 100 मिमी पेट्री डिश में आगे और पीछे एक दूसरे को रिहा लिम्फोसाइटों के खिलाफ चले गए हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। एक तिल्ली के बाद शेष एक 70 मिमी सेल झरनी के माध्यम से लाल रंग का गूदा शेष प्रेस करने के लिए एक सिरिंज डाट का प्रयोग चित्रा 2। (ए) लाल रंग का गूदा मैं एक एकल कक्ष निलंबन में कार्रवाई की और 70 मिमी सेल झरनी के माध्यम से पारित कर दिया है। (बी) के एक 3 मिलीलीटर सिरिंज की डाट भाग धीरे सेल झरनी के माध्यम से लाल रंग का गूदा शेष प्रेस करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (सी) सिरिंज का उपयोग करने के बाद, लगभग सेल झरनी में छोड़ कोई लाल गूदा होना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। लाल रक्त कोशिकाओं की चित्रा 3. एसीके सेल। सेल एसीके करने से पहले एक माउस तिल्ली से उत्पन्न एक एकल कक्ष निलंबन की (ए) केन्द्रापसारण। (बी) लाल रक्त कोशिकाओं के एसीके सेल के बाद, सेल गोली सफेद होना चाहिए।= "_blank" मिल> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा प्रोटोकॉल 4. प्रतिनिधि परिणाम है। (ए) Gating योजना सीडी 4+ टी lymphocytes में क्रोमेटिन स्थिति का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (बी और सी) टी कोशिकाओं अनुपचारित छोड़ दिया है या (तीन प्रतियों में) 3 घंटे के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल घुलनशील विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ सक्रिय थे। कोशिकाओं तो सीडी 4 + कोशिकाओं (बी) और सीडी 8 + कोशिकाओं (सी) में क्रोमेटिन संक्षेपण निर्धारित करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया। डेटा H3K4me1 धुंधला का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का मानक विचलन ± साधन हैं। * पी <0.001 (छात्र टी परीक्षण) ज क्लिक करेंअरे यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए। तालिका 1:। समस्या निवारण गाइड आम मुद्दों और संभावित समाधान के लिए एक त्वरित संदर्भ।

Discussion

हम टी कोशिकाओं में क्रोमेटिन संक्षेपण के आकलन के लिए अनुमति देता है कि एक प्रोटोकॉल विकसित की है। यह histone H3 एंटीबॉडी भोले कोशिकाओं में आसानी से उनकी एपिटोप्स का उपयोग नहीं कर सकते हैं कि साधारण अवलोकन पर निर्भर करता है, लेकिन टी सेल सक्रियण पर, ये वही एंटीबॉडी उनकी एपिटोप्स के लिए बाध्य करने में सक्षम हैं। उपचार समूहों के बीच एमएफआई histone H3 का धुंधला की तुलना करके, संक्षेपण या decondensation के रिश्तेदार डिग्री निर्धारित किया जा सकता है। हम thymocyte विकास के दौरान और टी सेल सक्रियण ⁴ के दौरान रिश्तेदार संक्षेपण स्थिति का निर्धारण करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। हम यह भी decondensation प्रक्रिया ⁵ कि नियंत्रण तंत्र की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है।

इस प्रोटोकॉल क्रोमेटिन संक्षेपण स्थिति का पता लगाने के लिए एक histone H3 एंटीबॉडी के उपयोग पर निर्भर करता है। टी सेल सक्रियण ⁴ के दौरान हिस्टोन संशोधन में कोई वैश्विक परिवर्तन होता है के बाद से, हम क्रोमेटिन का आकलन करने के लिए एक H3K4me1 एंटीबॉडी का उपयोग करने में सक्षम हैंइस प्रोटोकॉल में स्थिति। हम असंशोधित histone H3 के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया है; हालांकि, उत्पादन संकेत काफी कमजोर समग्र था। असंशोधित histone H3 के खिलाफ एंटीबॉडी पश्चिमी धब्बा में बेहतर काम करते हुए हमारे अनुभव में, संशोधित histone H3 के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी, इम्यूनोफ्लोरेसेंस में बेहतर काम करते हैं और cytometry assays के प्रवाह। यह है कि हम यह प्रयास नहीं किया है, हालांकि यह भी अन्य हिस्टोन प्रोटीन के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए संभव है कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

पेर्म / ब्लॉक और हिस्टोन H3 एंटीबॉडी कदम प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। इस्तेमाल किया पेर्म / ब्लॉक समाधान की राशि शेयर पेर्म समाधान किया जाता है हर बार अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस शेयर के समाधान के विभिन्न dilutions के प्रदर्शन की तुलना द्वारा किया जा सकता है। एक ठेठ प्रयोग 3 घंटा (चित्रा 4) के लिए सक्रिय उन लोगों के लिए भोले टी कोशिकाओं में क्रोमेटिन स्थिति की तुलना करना शामिल है। एक से अधिक एमएफआई में सबसे बड़ा परिवर्तन है कि उत्पादन के कमजोर पड़ने का चयन करना चाहिएसमय अवधि का विश्लेषण किया। शेयर समाधान पहले 3.5 चरण में पेर्म / ब्लॉक जोड़ने तो 3.4 कदम के बाद के रूप में ज्यादा एमएल 100 के रूप में पीबीएस + 2% में कोशिकाओं resuspending और से पेर्म / ब्लॉक ताकत कम करने के लिए पीबीएस + 2% में पतला किया जा सकता। इसी तरह का एक पायलट प्रयोग fluorescently संयुग्मित histone H3 एंटीबॉडी के एंटीबॉडी का एक नया बैच लेबल है हर बार अलग dilutions के परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। ये कदम (सक्रियण के 3 घंटा के भीतर, उदाहरण के लिए) जल्दी टी सेल सक्रियण में संक्षेपण मतभेदों के सफल का पता लगाने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। कभी कभी, histone H3 एंटीबॉडी के साथ दाग नहीं होगा, इस प्रकार permeabilized पाने के लिए और नहीं है कि कोशिकाओं रहे हैं। इस पेर्म / ब्लॉक जोड़ने जब कोशिकाओं में अच्छी तरह से resuspended नहीं कर रहे हैं तो क्या कर सकते हैं या पेर्म / ब्लॉक पर्याप्त मजबूत नहीं है। इन कोशिकाओं को histone H3 धुंधला की एक हिस्टोग्राम visualizing जब अक्ष के खिलाफ लगाए घटनाओं के रूप में दिखाई देंगे। समग्र एमएफआई तिरछा जाएगा कि इन घटनाओं के बाद से, इन घटनाओं gatin द्वारा विश्लेषण से छोड़ा जा सकता हैजी histone H3 सकारात्मक कोशिकाओं की सामान्य वितरण। अतिरिक्त सहायता समस्या निवारण गाइड (1 टेबल) में पाया जा सकता है।

एक फिक्स मृत सेल दाग का समावेश परख में सेल व्यवहार्यता का आकलन के लिए अनुमति देता है। कुछ उत्तेजनाओं कोशिका मृत्यु को उत्पन्न कर सकते हैं क्योंकि टी सेल सक्रियण में हेर-फेर करते हैं तो यह पूरी तरह से गंभीर है। ऐसे एक मामले में, हिस्टोन H3 एंटीबॉडी परिणामों की गलत व्याख्या करने के लिए अग्रणी, जीवित कोशिकाओं की तुलना में अलग मृत कोशिकाओं में histones बाध्य कर सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल क्रोमेटिन स्थिति का एक उच्च throughput विश्लेषण की अनुमति, 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में इस्तेमाल के लिए बनाया गया है। एक 6-8 सप्ताह पुराने महिला माउस से एक तिल्ली आम तौर पर प्रोटोकॉल का उपयोग 60-90,000,000 बीच कोशिकाओं निकलेगा। धुंधला प्रोटोकॉल नमूना प्रति 2 मिलियन कोशिकाओं की आवश्यकता है, एक बड़ी आसानी से एक भी 96 अच्छी तरह से थाली पर एक भी तिल्ली के साथ तीन प्रतियों में कई उपचार समूहों और समय अंक परख सकते हैं। यह पी के लिए संभव हैनमूना प्रति कम कोशिकाओं के साथ प्रोटोकॉल erform; बहरहाल, कारण centrifugation कदम की संख्या और इनमें से प्रत्येक चरण में कोशिकाओं के निहित घटाने के लिए, यह बहुत से कोशिकाओं की संख्या कम करने के लिए उचित नहीं है। हम सफलतापूर्वक नमूना प्रति 1 लाख कोशिकाओं के साथ प्रोटोकॉल पूरा कर लिया है।

हम ^सीडी 4+ टी सहायक कोशिकाओं और सीडी 8 ⁺ साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं में क्रोमेटिन स्थिति की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया। प्रोटोकॉल मानक सतह धुंधला भी शामिल है क्योंकि यह संभव बनाया है। प्रोटोकॉल को आसानी से जनसंख्या-विशिष्ट सतह मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके अन्य लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या में क्रोमेटिन की परीक्षा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल भी आसानी से प्रासंगिक सतह मार्कर पहचानने एंटीबॉडी के रूप में इतने लंबे समय के अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए उपलब्ध है और उचित निर्धारण / permeabilization की स्थिति में जाना जाता हैं अनुकूलित किया जा सकता है।

Materials

100mm tissue culture dish	BD Biosciences	353003
Precleaned frosted microscope slides	Fisher Scientific	12-550-343
Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh	Fisher Scientific	22363548
3mL syringe, Luer-Lok tip	BD	309585
Falcon 50mL polypropylene conical tube	Corning	352098
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit	Life Technologies	L23102	Life Technologies sells versions of this kit with different colors
Fc Block	BD Biosciences	553142
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Normal rabbit serum	Sigma-Aldrich	R9133
Anti-H3K4me1 antibody	Abcam	ab8895
R-Phycoerythrin conjugation kit	Abcam	ab102919	Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used