Flödescytometri kan användas för att bedöma tillståndet i kromatinet i T-celler. Detta protokoll kan forskare att tolka tecken på kromatin decondensation under T-cellaktivering visas genom en ökning av den genomsnittliga blomningstid intensitet (MFI) av fluorescerande Histone H3 antikroppar
Under en ordentlig immunsvar, vilande T-celler blir aktiverade vid antigenpresentation till deras antigenspecifika T-cellreceptor. Detta leder till klonal spridning av endast de T-celler som bär en receptor som känner igen antigenet. Kromatin decondensation är ett kännetecken för T-cellaktivering och krävs för T-celler att förvärva förmågan att föröka sig efter antigen engagemang. Denna förändring i kromatinkondensation kan detekteras med användning av antikroppar framtagna mot histonproteiner. Dessa antikroppar kan inte binda till deras epitoper i naiva T-celler såväl som de kan i aktiverade T-celler. Vi beskriver hur man samtidigt färga T-cellspecifika ytmarkörer, spår lönsamhet med en fixable död cell fläck, och mäta kromatin status via intracellulär färgning av Histon H3 proteiner. Färgade celler analyserades med flödescytometri och kromatinkondensation status mätes som den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) av Histon H3 fläcken. Chromati decondensation under T-cellaktivering demonstreras som en ökning i MFI
Flödescytometri är en laserbaserad teknik som utvecklats för analys av flera fysiska och fluorescerande parametrar i cellpopulationer. Denna teknik fungerar som suspenderade celler i en ström av fluid möter en laser, spännande fluorescerande markörer på eller inuti cellerna. Dessa markörer avger sedan ljus som detekteras och kvantifieras genom fotomultiplikatorrör. Medan flödescytometri har traditionellt använts för att identifiera populationer av celler, har det visat sig vara en användbar teknik vid studier en array av cellegenskaper inklusive cellmembranintegritet, protein-protein interaktioner och protein trafficking 1-3. Vi har utvecklat ett protokoll som gör att denna teknik kan användas för att detektera tillståndet för kromatin i T-celler som de aktiveras in vitro 4. Vi har också använt detta protokoll för att undersöka mekanismen för aktiveringsinducerat kromatin decondensation av T-celler 5.
T-cell activation och proliferation är kritiska för en korrekt immunsvar. T-celler, en särskild undergrupp av lymfocyter inom immunsystemet, krävs för korrekt immunsvar och utveckling av immunologiskt minne. Aktivering initieras när ett antigen presenteras i samband med det stora kompatibilitetskomplexet till T-cellreceptorn (TCR) som är belägen på den extracellulära ytan av vilande T-celler (översikt i 6). Detta utlöser en serie av dynamiska och mycket ordnade molekylära händelser inom T-celler som kulminerar i en ökning av intracellulär Ca2 + -koncentration 7 och den nukleära translokation av transkriptionsfaktorer som krävs för aktivering (översikt i 8-10). När aktiverad T-celler få möjlighet att svara på interleukin-2 (IL-2), en potent tillväxtfaktor som utnyttjar JAK (januskinas) / STAT (signalomvandlare och aktivator av transkription) -vägen för att driva klonal proliferation av aktiverade T cellerna 11. Kortfattat, IL-2-stimuleringresulterar i fosforylering av STAT-proteiner, en familj av latenta cytosoliska transkriptionsfaktorer. När fosforylerad, STAT proteiner dimeriseras, translokera till kärnan och driva uttryck av gener, inklusive de som är involverade i cellcykelprogression. I T-celler, IL-2 signaler via STAT5, som krävs för T-cellförökning 12,13.
För att uppnå klonal expansion av aktiverade T-celler, måste dessa celler som inte har upplevt antigen TCR ingrepp (naiva T-celler), ha en mekanism för att ignorera de potenta effekterna av IL-2. Detta uppnås genom reglering av kromatin status. Naiva T-celler har en kondenserat kromatin som förbjuder STAT5-DNA-ingrepp som svar på IL-2-stimulering. Vid aktivering kan kromatin decondenses och STAT5 tillgång promotorerna målgenerna, medger klonal proliferation 4. Intressant är inte beroende av epigenetisk modifiering av histon protei denna förändring i kromatin statusns (för granskning, se 14) som vi observerat någon global förändring i histon modifiering under T-cellsaktivering 4.
Medan dessa studier, upptäckte vi att antikroppar mot histonproteiner hade också svårt att få tillgång sina epitoper i naiva celler, men som vid aktivering kan lättare binda sina epitoper 4. Således, antikroppsbindning till histoner fungerar som en avläsning för kromatinkondensation status. Här presenterar vi metoden att använda flödescytometri för att detektera fluorescerande konjugerade Histon H3-antikroppar för att bedöma kromatin status i T-celler. Kromatinkondensation i en population av celler mäts som genomsnittlig blomningstid intensitet (MFI) i Histon H3 färgning. I samband med T-cellsaktivering, MFI i Histone H3 färgnings ökar och att betyda decondensation av kromatin. Förutom att mäta kromatin status via intracellulär Histone H3 färgning, detta protokoll incorpora ocksåtes ytan färgning och en fastställbara fläck för levande celler, vilket möjliggör analys av subpopulationer av celler.
Vi utvecklade ett protokoll som gör det möjligt att bedöma kromatinkondensation i T-celler. Det bygger på den enkla observationen att Histon H3 antikroppar inte kan komma åt sina epitoper lätt i naiva celler, men vid T-cellsaktivering, samma antikroppar kan binda till sina epitoper. Genom att jämföra MFI i Histone H3 färgning mellan behandlingsgrupperna, kan den relativa graden av kondensation eller decondensation bestämmas. Vi har använt detta protokoll för att bestämma relativ kondens status under tymocyt utveckling och under T-cellsaktivering 4. Vi har också använt detta protokoll för att undersöka de mekanismer som styr decondensation processen 5.
Detta protokoll förlitar sig på användningen av en Histon H3 antikropp för att detektera kromatinkondensation status. Eftersom det inte finns någon global förändring i histon modifiering under T-cellsaktivering 4, kan vi använda en H3K4me1 antikropp för att bedöma kromatinstatus i detta protokoll. Vi har använt antikroppar mot omodifierad Histon H3; emellertid signalen som producerades var mycket svagare övergripande. Enligt vår erfarenhet, antikroppar framtagna mot modifierad Histon H3 fungerar bättre i immunofluorescens och flödescytometri analyser, medan antikroppar mot omodifierad Histon H3 fungera bättre i Western blöt. Det måste noteras att det även är möjligt att använda antikroppar riktade mot andra histonproteiner, även om vi inte har försökt det.
De Perm / Block och Histon H3 steg antikropps är de mest kritiska stegen i protokollet. Mängden Perm / block lösning som används måste optimeras varje gång beståndet Perm lösning gjorts. Detta kan göras genom att jämföra prestanda hos olika spädningar av stamlösning. Ett typiskt experiment involverar jämförelse kromatin status i naiva T-celler som de som aktiveras för 3 h (fig 4). Man bör välja den utspädning som ger den största förändringen i MFI överden tidsperiod analyseras. Förrådslösningen kan spädas i PBS + 2% för att minska Perm / block styrka genom att först återsuspendering av cellerna i så mycket som 100 ml PBS + 2% efter steg 3,4 och sedan tillsätta Perm / block i steg 3,5. Ett liknande pilotförsök bör användas för att testa olika utspädningar av fluorescerande konjugerade Histon H3 antikropp varje gång en ny sats av antikropp är märkt. Dessa steg är särskilt avgörande för framgångsrik detektering av kondenseringsskillnader i början av T-cellsaktivering (t.ex. inom 3 timmar för aktivering). Ibland finns det celler som inte får permeabiliserad och kommer sålunda inte färgas med Histon H3 antikropp. Detta kan inträffa om cellerna inte resuspenderas väl när du lägger Perm / block eller om Perm / Block är inte stark nog. Dessa celler kommer att visas som händelser pressas mot axeln när visualisera ett histogram av Histon H3 färgning. Eftersom dessa händelser kommer att skeva den totala MFI, kan dessa händelser utelämnas från analys av gating den normala fördelningen av Histone H3 positiva celler. Ytterligare stöd kan hittas i handboken Felsökning (tabell 1).
Införandet av en fixable död cell fläcken gör det möjligt att bedöma cellviabilitet i analysen. Detta är helt avgörande när manipulera T-cellsaktivering, eftersom vissa stimuli kan inducera celldöd. I ett sådant fall kan Histon H3 antikropp binda histoner i döda celler annorlunda än levande celler, vilket leder till misstolkning av resultaten.
Detta protokoll är utformad för användning i 96-brunnars plattformat, vilket medger en hög genomströmning analys av kromatin status. En mjälte från en 6-8 veckor gammal kvinnlig mus typiskt ge mellan 60 till 90.000.000 celler använder protokollet. Eftersom färgningsprotokollet kräver 2 miljoner celler per prov, kan ett enkelt analysera multipla behandlingsgrupper och tidspunkter i triplikat med en enda mjälte på ett enda 96-brunnsplatta. Det är möjligt att perform protokollet med färre celler per prov; emellertid, på grund av antalet centrifugeringssteg och den inneboende förlust av celler vid var och en av dessa steg, är det inte tillrådligt att sänka antalet celler genom att mycket. Vi har framgångsrikt genomfört protokollet med 1 miljon celler per prov.
Vi använde detta protokoll för att undersöka kromatin status i CD4 + T-hjälparceller och CD8 + cytotoxiska T-celler. Detta är möjligt eftersom protokollet innehåller standard ytfärgning. Protokollet kan enkelt anpassas för undersökning av kromatin i andra lymfocytsubpopulationer genom användning av antikroppar mot befolkningsspecifika ytmarkörer. Detta protokoll kan också lätt anpassas till andra celltyper så länge som antikroppar som känner igen relevanta ytmarkörer är tillgängliga och lämpliga fixering / permeabilization förhållanden är kända.
The authors have nothing to disclose.
Projektet har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (5 P20 RR016461 och 8 P20 GM103499), National Science Foundation (EPS-0903795). Ytterligare stöd från Furman University forsknings- och professionell utveckling och Furman Advantage utmärkelser.
100mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
Precleaned frosted microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363548 | |
3mL syringe, Luer-Lok tip | BD | 309585 | |
Falcon 50mL polypropylene conical tube | Corning | 352098 | |
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit | Life Technologies | L23102 | Life Technologies sells versions of this kit with different colors |
Fc Block | BD Biosciences | 553142 | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Normal rabbit serum | Sigma-Aldrich | R9133 | |
Anti-H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
R-Phycoerythrin conjugation kit | Abcam | ab102919 | Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used |