Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

دراسة في Complexation من الزئبق (II) مع Dicysteinyl Tetrapeptides التي كتبها Electrospray التأين الطيف الكتلي

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

ملاحظة: يرجى التشاور مع جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. الزئبق كلوريد هو مادة كيميائية سامة. يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية (القفازات، ونظارات السلامة، ومعطف المختبر) عند تسليمه وجميع الحلول المرتبطة بها. التخلص من الحلول في زجاجات النفايات الكيميائية علامات واضحة المعينة للمعادن الثقيلة.

1. إعداد 5 ملي نزع الغاز الأمونيوم فورمات العازلة، ودرجة الحموضة 7.5

  1. حل 0.1576 غرام من عازلة فورمات الأمونيوم في 450 مل من الماء HPLC الصف. ضبط درجة الحموضة من الحل أعلاه مع 1 M حمض الفورميك و1 M هيدروكسيد الأمونيوم إلى 7.5. نقل هذا الحل إلى 500 مل قارورة حجمية وإضافة الماء HPLC إلى خط المعايرة لجعل 5 ملي حل فورمات الأمونيوم.
  2. ديغا 5 ملي العازلة فورمات الأمونيوم في ظل نظام فراغ لمدة 10 دقيقة وتطهير مع الأرجون. كرر مرتين وحل مخزن تحت الأرجون. في يوم من الاستخدام، تصفية حل العازلة من خلال مرشح 0.2 ميكرون قبل احتساباستخدام البريد.

2. إعداد الزئبق (II) حلول كلوريد

  1. تزن من 0.2375 غرام من الزئبق (II) كلوريد. حله في 25 مل من 5 ملي العازلة فورمات الأمونيوم لإنتاج 0.035 M الزئبق (II) محلول كلوريد.
  2. إضافة 0.214 مل من 0.035 حل M الزئبق (II) كلوريد إلى 9.785 مل من 5 ملي العازلة فورمات الأمونيوم لإنشاء 7.5 × 10 -4 M الحل. بطانية 7.5 × 10 -4 M الزئبق (II) حل مع غاز الارجون.

3. إعداد CGGC محلول المخزون

  1. حل 2.0 ملغ من رباعي البيبتيد dicysteinyl، CGGC، في 0.118 مل من HPLC الصف الأسيتونتريل ثم قم بإضافة 1.0647 مل من 5 فورمات الأمونيوم ملم، ودرجة الحموضة 7.5 العازلة التي تم نزع الغاز في الأرجون لانتاج ملي CGGC حل سهم 5.
  2. إضافة 225 ميكرولتر من ملي CGGC حل سهم 5 إلى 1275 ميكرولتر من 5 ملم تشكيل الأمونيوم 7.5 درجة الحموضة عازلة لإعطاء 7.5 × 10 -4 M CGGC الحل.

4. إعدادمن مخاليط رد فعل مختلفة من الزئبق (II) وCGGC

  1. إعداد 1: 0.5 نسبة الزئبق (II): CGGC الحل
    1. وضع 255 ميكرولتر من فورمات الأمونيوم 5 ملم، ودرجة الحموضة 7.5 العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 30 ميكرولتر من 7.5 X10 -4 M الحل الزئبق (II) كلوريد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع العازلة فورمات الأمونيوم.
    2. دوامة الحل لمدة 10 ثانية. ثم إضافة 15 ميكرولتر من 7.5 × 10 -4 M CGGC حل في microcentrifuge ل1.5 مل. دوامة الحل لمدة 10 ثانية. اسمحوا الحل الوقوف لمدة 10 دقيقة قبل الحقن في مطياف الكتلة.
  2. إعداد 1: 1 نسبة الزئبق (II): CGGC الحل
    1. وضع 240 ميكرولتر من فورمات الأمونيوم 5 ملم، ودرجة الحموضة 7.5 العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 30 ميكرولتر من 7.5 X10 -4 M الحل الزئبق (II) كلوريد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع العازلة فورمات الأمونيوم.
    2. دوامة الحل لمدة 10 ثانية. ثمإضافة 30 ميكرولتر من 7.5 × 10 -4 M CGGC الحل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كرر بطريقة مماثلة كما هو موضح في القسم 4.1.
  3. إعداد 1: 2 نسبة من الزئبق (II): CGGC الحل
    1. وضع 210 ميكرولتر من فورمات الأمونيوم 5 ملم، ودرجة الحموضة 7.5 العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 30 ميكرولتر من 7.5 X10 -4 M الحل الزئبق (II) كلوريد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع العازلة فورمات الأمونيوم.
    2. دوامة الحل لمدة 10 ثانية. ثم إضافة 60 ميكرولتر من 7.5 × 10 -4 M CGGC الحل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كرر بطريقة مماثلة كما هو موضح في القسم 4.1.

5. إعداد التعاون الاقتصادي الأوروبي محلول المخزون

  1. حل 3،5 ملغ من رباعي البيبتيد dicysteinyl، التعاون الاقتصادي الأوروبي، في 0.145 مل من HPLC الصف الأسيتونتريل إلى حل الببتيد. ثم إضافة 13.067 مل من 5 فورمات الأمونيوم ملم، ودرجة الحموضة 7.5 العازلة التي تم نزع الغاز في الأرجون لإنتاج 0.5 مترM التعاون الاقتصادي الأوروبي الحل.
  2. دوامة الحل حتى يذوب كل الببتيد. إضافة 1.125 مل من 0.5 ملي حل التعاون الاقتصادي الأوروبي و0.375 مل من 5 ملي فورمات الأمونيوم، ودرجة الحموضة 7.5 العازلة لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل لإعطاء 7.5 × 10 -5 M التعاون الاقتصادي الأوروبي الحل. دوامة حتى تمتزج.

6. إعداد خلطات رد فعل مختلفة من الزئبق (II) وحلول التعاون الاقتصادي الأوروبي

  1. إعداد 1: 0.5 نسبة الزئبق (II): حل التعاون الاقتصادي الأوروبي
    1. وضع 255 ميكرولتر من فورمات الأمونيوم 5 ملم، ودرجة الحموضة 7.5 العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 30 ميكرولتر من 7.5 X10 -4 M الحل الزئبق (II) كلوريد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع العازلة فورمات الأمونيوم.
    2. دوامة الحل لمدة 10 ثانية. ثم إضافة 15 ميكرولتر من 7.5 × 10 -4 M التعاون الاقتصادي الأوروبي الحل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كرر بطريقة مماثلة كما هو موضح في القسم 4.1.
  2. إعداد 1: 1 نسبة الزئبق (II): حل التعاون الاقتصادي الأوروبي
    1. ضع 24081؛ ل فورمات الأمونيوم 5 ملم، ودرجة الحموضة 7.5 العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 30 ميكرولتر من 7.5 X10 -4 M الحل الزئبق (II) كلوريد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع العازلة فورمات الأمونيوم.
    2. دوامة الحل لمدة 10 ثانية. ثم إضافة 30 ميكرولتر من 7.5 × 10 -4 M التعاون الاقتصادي الأوروبي الحل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كرر بطريقة مماثلة كما هو موضح في القسم 4.1.
  3. إعداد 1: 2 نسبة من الزئبق (II): حل التعاون الاقتصادي الأوروبي
    1. وضع 210 ميكرولتر من فورمات الأمونيوم 5 ملم، ودرجة الحموضة 7.5 العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 30 ميكرولتر من 7.5 X10 -4 M الحل الزئبق (II) كلوريد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع العازلة فورمات الأمونيوم.
    2. دوامة الحل لمدة 10 ثانية. ثم إضافة 60 ميكرولتر من 7.5 × 10 -4 M التعاون الاقتصادي الأوروبي الحل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كرر بطريقة مماثلة كما هو موضح في القسم 4.1.

7. Analyزينغ ومخاليط رد فعل من الزئبق (II) وعينات CGGC التي كتبها Orbitrap ESI الطيف الكتلي

  1. إعداد مطياف الكتلة ESI 16
    1. رسم 100 ميكرولتر من المعايير المعايرة في كوب 500 ميكرولتر حقنة.
    2. وضع حقنة في المهد حقنة من مضخة MS، إرفاق الأنابيب، وحقن في معمل الشامل.
    3. إعداد اسم الملف على المدى عن طريق اختيار رمز الملف وكتابة اسم الملف.
    4. اختر زر البيانات تحصل عليها في وحدة الحصول على البيانات وجمع 150 بالاشعة.
    5. تحليل اللوني للتحقق من معايير المعايرة عن طريق فتح وحدة معالجة البيانات من البرنامج. فتح وحدة، انتقل إلى القائمة ملف واختر "فتح"، وحدد الملف في مربع الحوار. تحقق من أن القمم في اللوني ترتبط إلى كتلة لتوجيه الاتهام نسب للمعايير.
    6. تنظيف الزجاج 500 ميكرولتر حقنة عن طريق وضع 500 ميكرولتر HPLC الصف الميثانول ثم الاستغناء مالايثانول في كوب.
    7. وضع 500 ميكرولتر من HPLC الصف الميثانول في حقنة زجاجية وطرد النظام كما في الخطوة 7.1.2.
    8. حدد وحدة طريقة إعداد البرنامج لتعيين المعلمات. اختر من القائمة وضع المسح الضوئي وتحديد محلل كما في Ftms، ثم اضغط على "OK". ثم من خلال النقر على الرموز المختلفة على صفحة عرض الطيف في الوقت الحقيقي، تعيين المعلمات التالية: غمد معدل تدفق الغاز: 10، ودرجة الحرارة المصدر: 0، شعري الجهد: 37 V، عدسة أنبوب: 95 V، الرذاذ الجهد: 4.20 كيلو فولت ، معدل التدفق 10.00 ميكرولتر / دقيقة، محلل: في Ftms، عدد المسحات: 150.
  2. تشغيل عينات CGGC على ESI مطياف الكتلة
    1. تشغيل 5 ملي فورمات الأمونيوم درجة الحموضة 7.5 العازلة.
      1. وضع 500 ميكرولتر من 5 ملي العازلة فورمات الأمونيوم في الزجاج 500 ميكرولتر حقنة، وضعه في مهد حقنة من مضخة MS، ونعلق الأنبوب.
      2. تشغيل عازلة من خلال الأنبوب لمدة 1-2 دقيقة.
      3. إعداد اسم الملف على المدىعن طريق اختيار رمز الملف وكتابة اسم الملف.
      4. اختر زر البيانات تحصل عليها في وحدة وجمع 150 بالاشعة.
      5. انقر على زر التشغيل لوقف جمع بعد جمع 150 بالاشعة.
      6. فتح وحدة متصفح البيانات، ثم انتقل إلى القائمة ملف واختر "فتح"، وحدد الملف في مربع الحوار. تحقق من عدم وجود قمم في 483، 683، 1163 و 1363 م / ض موجودة تشبه الببتيد أو الزئبق (II) المجمعات -peptide.
    2. تشغيل 1: الزئبق 0.5 (II): CGGC نسبة حل.
      1. وضع 250 ميكرولتر من 1: 0.5 الزئبق (II): نسبة CGGC من العينة إلى الحقنة.
      2. ضع الحقنة في مهد حقنة من مضخة MS، ونعلق الأنبوب، ورئيس الجهاز.
      3. حدد اسم ملف على المدى عن طريق اختيار رمز الملف وكتابة اسم الملف.
      4. اضغط على زر البيانات تحصل عليها في وحدة الحصول على البيانات وجمع 150 بالاشعة وانقر على زر التشغيل لوقف جمع.
      5. فتح وحدة، انتقل إلى القائمة ملف واختر "فتح"، وحدد الملف في مربع الحوار. تحقق من أن اللوني يحتوي على قمم بما في ذلك واحدة لالببتيد CGGC وحدها.
      6. غسل حقنة بواسطة الشفط مع 500 ميكرولتر العازلة فورمات الأمونيوم ثم الاستغناء المخزن المؤقت فورمات الأمونيوم في دورق.
      7. حدد زر النفايات على MS وتدفق أنابيب ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر العازلة فورمات الأمونيوم.
      8. غسل حقنة بواسطة الشفط مع 500 ميكرولتر الميثانول ثم الاستغناء عن الميثانول في دورق.
      9. مسح مرة واحدة أنابيب مع 500 ميكرولتر الميثانول.
      10. حدد زر للكشف عن الحمل على MS.
      11. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة فورمات الأمونيوم إلى الحقنة.
      12. ضع الحقنة في مهد حقنة من مضخة MS، ونعلق الأنبوب، ورئيس الجهاز.
      13. حدد اسم ملف المنطقة العازلة التي تديرها اختيار رمز الملف وكتابة اسم الملف.
      14. صحافةالزر البيانات اكتساب وجمع 150 بالاشعة ثم انقر على زر التوقف التشغيل.
      15. فتح وحدة متصفح البيانات، انتقل إلى القائمة ملف واختر "فتح"، وحدد الملف في مربع الحوار. تحقق من أن اللوني هو باطل من قمم من الزئبق السابق: CGGC التشغيل.
    3. تشغيل 1: 1 الزئبق (II): CGGC نسبة حل.
      1. وضع 250 ميكرولتر من 1: 1 الزئبق (II): CGGC العينة نسبة إلى الحقنة.
      2. كرر بطريقة مماثلة كما هو موضح لخطوات 7.2.2.2 ل7.2.2.15.
    4. تشغيل 1: 2 الزئبق (II): CGGC نسبة حل
      1. وضع 250 ميكرولتر من 1: 2 الزئبق (II): CGGC عينة تركيز في حقنة.
      2. كرر بطريقة مماثلة كما هو موضح لخطوات 7.2.2.2 ل7.2.2.15.

8. تحليل مخاليط رد فعل للزئبق وعينات التعاون الاقتصادي الأوروبي التي كتبها Orbitrap ESI الطيف الكتلي

  1. تشغيل عينات التعاون الاقتصادي الأوروبي على ESI مطياف الكتلة
    1. إجراء تحليل كرر (خطوات 7،1-7،2) باستخدام عينات التعاون الاقتصادي الأوروبي ومخاليط رد فعل من الزئبق (II) والتعاون الاقتصادي الأوروبي في مختلف نسب متكافئة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأجريت دراسة لتوصيف الممكن الزئبق الببتيد تكوين معقد لمدة tetrapeptides، CGGC والتعاون الاقتصادي الأوروبي (الشكل 1) من خلال ESI الطيفي. وقد تم التحقيق المجمعات من الزئبق (II) مع CGGC أو التعاون الاقتصادي الأوروبي عن طريق تفاعل خليط من الزئبق (II) وحلول الببتيد في ثلاث نسب مختلفة المولي: 1: 0.5، 1: 1 و 1: 2 (الزئبق (II): الببتيد) . وكان تركيز الزئبق (II) 7.5 × 10 -6 M وتركيز الببتيد تختلف وفقا لذلك.

الشكل 1
الشكل 1. الهياكل الببتيد Dicysteinyl. الهياكل الكيميائية للtetrapeptides dicysteinyl، CGGC والتعاون الاقتصادي الأوروبي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

والأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" 1 "> الرقم 2
الشكل 2. ESI MS الزئبق (II) وCGGC Electrospray التأين orbitrap الأطياف كتلة من محلول يحتوي على 7.5 × 10 -6 M زئبق 2+ في الأمونيوم عازلة فورمات، ودرجة الحموضة 7.5 تحتوي على زئبق متفاوتة 2+: نسب متكافئة CGGC: (A ) نسبة 1: 0.5، (B) نسبة 1: 1، و (C) 1: 2 النسبة. تظهر الأشكال أنماط النظائر الزئبق من المجمعات من الزئبق الببتيد المشار إليها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. ESI MS الزئبق (II) والتعاون الاقتصادي الأوروبي. التأين electrospray orbitrap أطياف الشامل منمحلول يحتوي على 7.5 × 10 -6 M زئبق 2+ في الأمونيوم عازلة فورمات، ودرجة الحموضة 7.5 تحتوي على زئبق متفاوتة 2+: نسب متكافئة التعاون الاقتصادي الأوروبي: (A) نسبة 1: 0.5، (B) نسبة 1: 1، و (C) 1 : 2 النسبة. تظهر الأشكال أنماط النظائر الزئبق من المجمعات من الزئبق الببتيد المشار إليها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم جمع التأين electrospray orbitrap الاستشرابية كتلة الزئبق (II) كومبليكسينج مع CGGC (الشكل 2) والتعاون الاقتصادي الأوروبي (الشكل 3) في مختلف الزئبق (II) إلى الببتيد نسب متكافئة (1: 0.5، 1: 1 و 1: 2). أنواع معقدة من الزئبق الببتيد احظ تظهر متميزة قمم النظائر الزئبق (إدراجات)، والتي تستخدم لتحديد عدد من أيونات الزئبق في المجمع فضلا عن عدد من deprotonations. على سبيل المثال، الشكل 1B أقحم يظهر التوقيع النظائر الزئبق في ناتج إضافة الببتيد من الزئبق، والتي تتطابق مع سبعة الرئيسية النظائر التي تحدث بشكل طبيعي من الزئبق: 196 الزئبق (0.146٪)، 198 الزئبق (10.02٪)، 199 الزئبق (16.84٪) ، 200 الزئبق (23.13٪)، 201 الزئبق (13.22٪)، 202 الزئبق (29.80٪)، 204 الزئبق (6.85٪)، مع وفرة طبيعية في المئة بين قوسين. في نظيرين الرئيسية 200 زئبق و 202 زئبق تظهر نسبة الكثافة النسبية متميزة من 2.3: 3. وفقا لذلك ذروة النظائر أشد من هذه المجموعة النظير من الزئبق واحدة تشكل كتلة monoisotopic للناتج إضافة (م / ض = 539). أنه يرتبط مع الإحداثي اثنين المجمع، الذي يتكون من نزع بروتون اثنين التجولات cysteinyl لتشكيل [(CGGC-2H + زئبق) + H] + ناتج إضافة. يتم هذا التحليل على النحو التالي:

قيمة م / ض ل[(CGGC-2H + زئبق) + H] + هي من الأجهزةالقاعدة ل(338-2 + 202 +1) = 539.

الشكل 1A أقحم يظهر التوقيع النظائر الزئبق في ناتج إضافة الببتيد من الزئبق، والتي تتطابق مع مجمع اثنان من الزئبق المحسوبة باستخدام برنامج ChemCal ل[(2CGGC-4H + 2HG) + H] + (الشكل 4). يتوافق كتلة monoisotopic البروتونية النظرية إلى قيمة م / ض من 1077.061، الذي هو ذروة النظائر التاسعة في الكتلة النظائر المحسوبة. ويبين الشكل 1A أقحم ذروة النظائر المقابلة لقيمة م / ض من 1077.1، الذي هو أيضا ذروة التاسعة في الكتلة النظائر الملاحظة. ولذلك، فإن ناتج إضافة منشأ لهذه المجموعة النظائر يمكن تعيين ل[(2CGGC-4H + 2HG) + H] +.

الرقم 4
الرقم 4. أنماط النظائر النظرية ل[(2CGGC-4H + 2HG) + H] + سوب>. أنماط النظائر النظرية ل[(2CGGC-4H + 2HG) + H] + المحسوبة باستخدام برنامج ChemCal. السهم يشير إلى الذروة monoisotopic. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. adducts Cationized بعض الصوديوم والبوتاسيوم adducts cationized المرتبطة المجمعات من الزئبق الببتيد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويبين الشكل 5 بعض الصوديوم والبوتاسيوم adducts cationized المرتبطة المجمعات من الزئبق الببتيد التي شكلتها CGGC. adducts Sodiated هي ر 22 وحدة جماهيرية أكبرهان والبروتونية المجمعات الزئبق CGGC المقابلة، في حين أن adducts البوتاسيوم هي 38 وحدة جماهيرية أكبر. المهيمن البروتونية CGGC ديمر (م / ض = 677) يشكل أيضا الأنواع cationized مع الصوديوم (م / ض = 699)، وأيونات البوتاسيوم (م / ض = 715). وهذا يؤكد أيضا على تشكيل dimers CGGC دون أكسدة المجموعات cysteinyl ثيول لتشكيل ثنائي السلفيدات، التي قد أدى إلى انخفاض وحدتين الجماعية لadducts البروتونية أو cationized.

الشكل (6)
الرقم 6. تداخل +1 و +2 تهمة الدول. قمم المتداخلة المرتبطة أيونات الزئبق الببتيد [(التعاون الاقتصادي الأوروبي-4H + 2HG) + H] + في دول تهمة +1 و +2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7. أنماط النظائر النظرية ل[(التعاون الاقتصادي الأوروبي-4H + 2HG) + H] +. أنماط النظائر النظرية ل[(التعاون الاقتصادي الأوروبي-4H + 2HG) + H] + كما يحسب باستخدام برنامج ChemCal. السهم يشير إلى الذروة monoisotopic. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6 يبين تداخل القمم المرتبطة adducts من الزئبق التعاون الاقتصادي الأوروبي في +1 و +2 تهمة. فإنه يظهر القمم النظائر التي ترتبط مع أيونات الزئبق الببتيد [(التعاون الاقتصادي الأوروبي-4H + 2HG) + H] + في تهمة +1 وقيمة م / ض من 883. وهذا هو في اتفاق مع مجمع اثنان الزئبق كما يحسب ل [(التعاون الاقتصادي الأوروبي-4H + 2HG) + H] + باستخدام برنامج ChemCal (الشكل 7). وmonoisotopic البروتونية النظري تقابل الكتلة إلى قيمة م / ض من 883،032.

لوحظ أعلاه [(التعاون الاقتصادي الأوروبي-4H + 2HG) + H] + ناتج إضافة وبلغت ذروتها monoisotopic من 883.03 تتداخل مع ناتج إضافة أخرى تحتوي على قمم المقابلة مبديا 0.5 وحدات جماعية إضافية. مع مرتفعة للغاية بقرار من orbitrap أداة قياس الطيف الكتلي يتحقق، فإنه يمكن افترض أن هذه القمم تداخل تتوافق مع adducts مع تهمة +2. وفقا لذلك، وكتلة monoisotopic من تداخل مجمع يجري المتأين يمكن أن تحسب على النحو التالي الشكل 8 يدل على أن الفرق م / ض بين القمم النظائر هو 0.5 والفرق الشامل بينهما هو 1 اتحاد المغرب العربي. ولذلك، فإن الدولة هي المسؤولة +2. لحساب كتلة معقدة من الزئبق الببتيد، يتم ضرب م / ض لذروة monoisotopic من قبل الدولة تهمة، وتطرح من كتلة اثنين من البروتونات، مما جعل أيون معقد موجبة الشحنة.

س: المحافظة على together.within صفحة = "1"> حسابات للناتج إضافة +2:

م / ض الفرق بين قمم النظائر هو 0.5

الفرق الشامل بين قمم النظائر هو 1 اتحاد المغرب العربي (1 النيوترون)

ض = 1 القسمة على 0.5 = 2

م / ض لالبروتونية الذروة monoisotopic هو (883.53 × 2) - 2 = 1765،06

قيمة م / ض المذكورة أعلاه لذروة monoisotopic البروتونية، [(2CEEC-8H + 4Hg) + H] +، تتفق مع القيمة النظرية المحسوبة من قبل برنامج ChemCal كما 1765.056 (الشكل 8).

الرقم 8
الرقم 8. النظري أنماط النظائر ل[(2CEEC-8H + 4Hg) + H] +. أنماط النظائر النظرية ل[(2CEEC-8H + 4Hg) + H] + المحسوبة باستخدام برنامج ChemCal. السهم يشير إلى الذروة monoisotopic. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ميزة تحليل المجمعات من الزئبق الببتيد مع ESI orbitrap مطياف الكتلة هو أن المسؤول عن كل أيون يمكن تعيين بسهولة كما هو مبين أعلاه. الببتيدات التي تحتوي الأساسية الأمينية محطة يمكن أن تستقر بسهولة الشحنات الموجبة. عند استخدام التأين electrospray ومحلل الكتلة عالية الدقة مثل orbitrap، والدولة مسؤولة عن أيونات الببتيد مع أكبر من +1 تهمة يمكن تحديده بسهولة أكبر مقارنة مع دقة أقل iontrap محلل الشامل.

= "1"> قمم المتداخلة المرتبطة adducts من الزئبق التعاون الاقتصادي الأوروبي (3A الشكل والشكل 6)، كما هو موضح أعلاه، تم تحليلها أيضا جنبا إلى جنب MS. ولم تظهر أي تجزئة MS-MS، الذي أشار إلى أن الإشارات التي تم الحصول عليها تنتمي إلى مجمع المتوقع كما ذكرنا آنفا، ولا بتجميع القطع الأثرية التي شكلت في تركيزات أعلى من الزئبق لالببتيد النسب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وdicysteinyl رباعي البيبتيد مسعور CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2، MW = 338) (الشكل 1)، وأشكال المجمعات مع الزئبق (II) كما هو مبين في الشكل 2 والجدول 1 بالإضافة إلى ذلك، يشكل dimers الببتيد وtrimers. تدريجيا كما زادت كمية الببتيد في خليط التفاعل. كما يتضح من قيم م / ض من dimers يرتبط [(2M + H) + = 677] وtrimers [(3M + H) + = 1015]، ومجموعة ثيول من CGGC لم أكسدة لتشكيل ثنائي السلفيدات تحت ظروف تجريبية . تشكيل هذه الأنواع CGGC المرتبطة يمكن أن يعزى إلى للا مائية من هذا رباعي البيبتيد. CGGC تشكل نوعين من المجمعات مع الزئبق الموافق 1: 1 الزئبق (II): الببتيد و 1: 2 الزئبق (II) :( الببتيد) 2 المجمعات كما ذكرت سابقا لtripeptides dicysteinyl 7. ومع ذلك، في ظل وجود فائض أو الزئبق يعادل (II)، كما أنه FOالتربيعي 2: 2 [الزئبق (II)] (2): (الببتيد) 2 تعقيدا.

وdicysteinyl رباعي البيبتيد carboxylated التعاون الاقتصادي الأوروبي (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2، MW = 482) (الشكل 1) المجمعات شكل مع الزئبق (II) كما هو مبين في الشكل (3) والجدول 1 ولم تشكل dimers التعاون الاقتصادي الأوروبي كما بسهولة كما. أن مراقبة لCGGC أكثر مسعور. مقارنة لCGGC، وأنها تشكل مجمعات مع الزئبق الموافق 1: 1 الزئبق (II): الببتيد و 1: 2 الزئبق (II) :( الببتيد) 2 المجمعات. ومع ذلك، مع مجموعة الكربوكسيل المساعدة، وأنها تشكل 2: 2 [الزئبق (II)] (2): (الببتيد) 2 مجمع بسهولة أكبر. وعلاوة على ذلك، في الزئبق الزائدة، وأنها تشكل 2: 1 [الزئبق (II)] 2: الببتيد مجمع و4: 2 [الزئبق (II)] (4): (الببتيد) 2 مجمع الببتيد، والتي لم تراع للCGGC.

ملخص الإشارات التي لوحظت في المجمعات وormed كما تظهر قيم م / ض في الجدول 1.

الجدول 1

الجدول 1. ملخص المجمعات إشارات من الزئبق الببتيد. المجمعات إشارات الزئبق الببتيد في الاستشرابية LTQ / Orbitrap MS العازلة في فورمات الأمونيوم، ودرجة الحموضة 7.5.

لقد أثبتنا أن رد الفعل من الزئبق (II) واثنين من tetrapeptides dicysteinyl تشكيل المجمعات التي تعتمد على النسب الأولية من الزئبق (II): الببتيد فضلا عن وجود جماعات ملزمة المساعدة في رباعي البيبتيد dicysteinyl. وعلاوة على ذلك، رياضيات الكيمياء دقيقة من الزئبق والببتيد في مجمعات شكلت في ظل ظروف التأين electrospray معينة يمكن تحديدها باستخدام عالية الدقة ESI قياس الطيف الكتلي على أساس الزئبق متميز أنماط توزيع النظائر.

في رد فعل cysteinyl peptايديس مع الزئبق (II)، يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لمنع أكسدة مجموعة cysteinyl ثيول على شكل سندات ثاني كبريتيد. ضمن بروتوكول وصفها، كانت محاليل نزع الغاز بعناية وتخزينها تحت الأرجون. بالإضافة إلى ذلك، يتم إعداد جميع العينات رد فعل على الفور قبل التحليل من قبل ESI مطياف الكتلة.

بسبب الاختلافات في الذوبان بين tetrapeptides اثنين، والتعاون الاقتصادي الأوروبي CGGC، استخدمت تركيزات مختلفة لإعداد الحلول الأسهم. والمبللة والأوراق المالية الثلاجة من CGGC الببتيد مع الأسيتونتريل وبسهولة المنحل تليها 5 ملي العازلة فورمات الأمونيوم، ودرجة الحموضة 7.5 لإنتاج 7.5 × 10 -4 M CGGC الحل. وقد أعد التعاون الاقتصادي الأوروبي بتركيز أقل، 7.5 × 10 -5 M، قبل الزئبق (II): خطوات خليط التفاعل الببتيد بسبب انخفاض ذوبانه. التخفيف الأمثل لتحليل الزئبق واعتبر (II) مجمعات لتكون 10 -5 M بسبب ذوبان الببتيد والسماح لللإزالة المخلفات في مطياف الكتلة. في العقد إلى حلول CGGC، وبقايا التعاون الاقتصادي الأوروبي تلتزم الأنبوب، مما يستدعي استبدال أنابيب في بعض الأحيان.

أهمية استخدام ESI الطيفي لتحليل المجمعات من الزئبق الببتيد تكمن في التأين الناعمة المتمثلة في التحاليل. هذا يسهل تحليل الأيونات الجزيئية مع تجزئة يكاد يذكر. كما هو مبين في هذا العمل، فإنه يمكن استخدامها لتوصيف stoichiometries المجمعات من الزئبق الببتيد استنادا إلى أنماط توزيع النظائر الزئبق التوقيع. ومع ذلك، فإن نظام المخزن متقلبة ضروري لتحليلها من قبل ESI الطيفي. هذا قد يحد من الاستخدام العملي لها لتحديد التحاليل التي تتطلب المذيبات أقل تقلبا أو وسائط التخزين المؤقت للانحلال.

كما ذكرنا سابقا 7،8، ويوفر ESI الطيفي أداة تحليلية حساسة لتحديد دقيق لرياضيات الكيمياء من الزئبق وpeptبيئة تطوير متكاملة في المجمعات من الزئبق الببتيد في ظل حالة التأين electrospray المحدد. ومع ذلك، فمن الضروري استخدام وسائل إضافية (على سبيل المثال، 1 H، C 13، 199 زئبق NMR الطيفي، مدد امتصاص الأشعة السينية هيكل غرامة، أو تكمين 17-18) لتوفير تقرير أكثر دقة من محتوى المجمعات في حل.

لقد أثبتنا أن ESI مع محلل الشامل orbitrap يمكن استخدامها لتحليل المجمعات من الزئبق الببتيد. نتوقع أن هذه التقنية يمكن تطبيقها تجاه تحليل ايونات المعادن الأخرى والمجمعات مع المركبات الصغيرة المختلفة. سيكون مفيدا بشكل خاص لتحليل المجمعات التي شكلتها ايونات المعادن الأخرى التي يمكن أن توجد في أشكال النظائر المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

MN-S يعترف بدعم من مؤسسة العلوم الوطنية، وروي منح CHE 1011859. والكتاب الامتنان مرفق ثالوث الطيف الكتلي في جامعة كارولينا الشمالية في جرينسبورو لاستخدام مطياف الكتلة الحرارية فيشر LTQ العلمي Orbitrap XL. الكتاب أشكر دانيال تود، فنسنت سيكا، وBrandie Erhmann في جامعة كارولينا الشمالية في جرينسبورو للحصول على اقتراحات وتعليقات مفيدة بشأن هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clifton, J. C. Mercury exposure and public health. Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).
  2. Andersen, O. Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication. Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).
  3. Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents. Toxicology. 97, 23-38 (1995).
  4. Flora, S. J. S., Pachauri, V. Chelation in Metal Intoxication. Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).
  5. Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning. JAMA. 256, 3127-3130 (1986).
  6. Rooney, J. P. K. The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury. Toxicology. 234, 145-156 (2007).
  7. Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides. Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).
  8. Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides. J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).
  9. Winther, J. R., Thorpe, C. Quantification of thiols and disulfides. Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).
  10. D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands. Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).
  11. Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes. Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).
  12. Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).
  13. Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS. Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).
  14. Schaumlöffel, D., Tholey, A. Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis. Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).
  15. Patiny, L., Borel, A. ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure. J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).
  16. Thermo Scientific. Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).
  17. Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II). Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).
  18. Mah, V., Jalilehvand, F. Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH. Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).

Tags

الكيمياء، العدد 107، المجمعات الزئبق الببتيد، قمم النظائر الزئبق، مطياف الكتلة، ESI MS، الببتيدات cysteinyl
دراسة في Complexation من الزئبق (II) مع Dicysteinyl Tetrapeptides التي كتبها Electrospray التأين الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter