Protocol
注意：使用前请咨询所有相关的材料安全数据表（MSDS）。氯化汞是一种有毒的化学品。个人防护装备（手套，护目镜，以及白大褂）必须交给当它和所有相关的解决方案，可以穿。在处置指定重金属明确标示化学废物瓶的解决方案。
1.制备5mM的脱气甲酸铵缓冲液，pH为7.5
- 溶解0.1576克的甲酸铵缓冲液450毫升HPLC级水。调整用1M甲酸和1M氢氧化铵7.5上述溶液的pH值。此溶液转移到500ml容量瓶中和HPLC水添加到该校准线作出的5mM甲酸铵溶液。
- 脱气下一个真空系统的5mM甲酸铵缓冲液10分钟，清洗用氩气。重复两次，在氩气中存储的解决方案。上使用的当天，过滤通过0.2微米的过滤器江前缓冲溶液E使用。
2.准备氯化汞解决方案
- 称取0.2375克汞（Ⅱ）氯化物。溶解在25ml的5mM甲酸铵缓冲，以产生一个中号0.035汞（Ⅱ）氯化物溶液。
- 添加0.214毫升0.035中号汞（Ⅱ）氯化物溶液到毫升5mM的的9.785甲酸铵缓冲以创建一个7.5×10 -4 M溶液。毯用氩气7.5×10 -4 M的汞（II）溶液。
3.制备葛洲坝股票方案
- 溶解2.0毫克dicysteinyl四肽，CGGC的，在0.118毫升的HPLC级乙腈和然后添加1.0647毫升的5mM甲酸铵，pH值已脱气，在氩，得到5mM的CGGC原液7.5缓冲液中。
- 添加225微升的5mM CGGC原液至1275微升5mM甲酸铵的形成pH为7.5的缓冲，得到7.5×10 -4 M CGGC溶液。
4.准备的汞（II）和CGGC的各种反应混合物
- 制备的1：0.5的比例的汞（Ⅱ）：CGGC溶液
- 放置255微升的5mM甲酸铵，pH为7.5的缓冲至1.5 ml微量离心管中。加30微升7.5×10 -4 M的汞（Ⅱ）氯化物溶液到1.5 ml离心管与甲酸铵缓冲。
- 涡旋10秒的溶液。然后加入15微升7.5×10 -4 M葛洲坝溶液倒入1.5 ml离心。涡旋10秒的溶液。让该溶液静置10分钟，在注射前进入质谱仪。
- 1比例的汞（Ⅱ）：1- CGGC溶液
- 放置240微升的5mM甲酸铵，pH为7.5的缓冲至1.5 ml微量离心管中。加30微升7.5×10 -4 M的汞（Ⅱ）氯化物溶液到1.5 ml离心管与甲酸铵缓冲。
- 涡旋10秒的溶液。然后加入30微升7.5×10 -4 M葛洲坝解决方案到1.5 ml离心管。如第4.1节所述重复以类似的方式。
- 2比汞（Ⅱ）：1- CGGC溶液
- 放置210微升的5mM甲酸铵，pH为7.5的缓冲至1.5 ml微量离心管中。加30微升7.5×10 -4 M的汞（Ⅱ）氯化物溶液到1.5 ml离心管与甲酸铵缓冲。
- 涡旋10秒的溶液。然后加入60微升7.5×10 -4 M葛洲坝解决方案到1.5 ml离心管。如第4.1节所述重复以类似的方式。
5.制备CEEC原液
- 溶解3.5毫克dicysteinyl四肽，中欧和东欧国家的，在0.145毫升HPLC级乙腈溶解肽。然后添加13.067毫升5mM的甲酸铵，pH值已脱气，在氩7.5缓冲，以产生0.5米中号CEEC的解决方案。
- 涡的解决方案，直到所有肽溶解。添加1.125 ml的0.5的20mM CEEC溶液和0.375 ml的毫5酸铵，pH为7.5的缓冲到1.5ml微量离心管中，得到7.5×10 -5 M CEEC溶液。涡街，直到混合。
6.制备汞（II）和中欧和东欧国家解的各种反应混合物
- 制备1：0.5的比例汞（二）：中欧和东欧国家的解决方案
- 放置255微升的5mM甲酸铵，pH为7.5的缓冲至1.5 ml微量离心管中。加30微升7.5×10 -4 M的汞（Ⅱ）氯化物溶液到1.5 ml离心管与甲酸铵缓冲。
- 涡旋10秒的溶液。然后加入15微升7.5×10 -4 M CEEC解决方案到1.5 ml离心管。如第4.1节所述重复以类似的方式。
- 制备的1：1的比例的汞（Ⅱ）的：CEEC溶液
- 将24081;微升的5mM甲酸铵，pH为7.5的缓冲至1.5 ml微量离心管中。加30微升7.5×10 -4 M的汞（Ⅱ）氯化物溶液到1.5 ml离心管与甲酸铵缓冲。
- 涡旋10秒的溶液。然后加入30微升7.5×10 -4 M CEEC解决方案到1.5 ml离心管。如第4.1节所述重复以类似的方式。
- 制备的1：2的比例的汞（Ⅱ）的：CEEC溶液
- 放置210微升的5mM甲酸铵，pH为7.5的缓冲至1.5 ml微量离心管中。加30微升7.5×10 -4 M的汞（Ⅱ）氯化物溶液到1.5 ml离心管与甲酸铵缓冲。
- 涡旋10秒的溶液。然后加入60微升7.5×10 -4 M CEEC解决方案到1.5 ml离心管。如第4.1节所述重复以类似的方式。
7. ANALY由轨道阱ESI质谱查懋汞（II）和CGGC样品的反应混合物
- 准备ESI质谱仪16
- 绘制100微升的校准标准为500微升玻璃注射器。
- 将注射器在MS泵的注射器托架，连接管，并注入到质谱仪。
- 通过选择文件图标，并输入文件名设置为运行中的文件名。
- 数据采集模块中选择获取数据按钮，并收集150扫描。
- 分析色谱图，打开数据处理模块的软件来验证校准标准。打开该模块，进入文件菜单并选择“打开”，然后选择在对话框中的文件。验证在色谱图中的峰关联到质荷的标准比率。
- 通过制定500微升HPLC级甲醇清洁500微升玻璃注射器，然后分配并购乙醇到烧杯中。
- 制定500微升HPLC级甲醇到玻璃注射器和冲洗系统按照步骤7.1.2。
- 选择软件设定参数的方法中设置模块。选择扫描模式菜单，识别分析仪FTMS，然后单击“确定”。然后通过点击实时查看光谱页面上的各种图标，设置以下参数：鞘气流量：10，离子源温度：0，毛细管电压：37 V，管透镜：95 V，喷雾电压：4.20千伏，流速10.00微升/分钟，分析仪：FTMS，扫描次数：150。
- 在ESI质谱仪运行葛洲坝样本
- 运行的5mM甲酸铵pH为7.5的缓冲。
- 将500微升5毫米甲酸铵缓冲到500微升玻璃注射器，把它放入MS泵的注射器摇篮，并连接管。
- 运行缓冲通过管1-2分钟。
- 建立的文件名的运行通过选择文件图标，并输入文件名。
- 在模块中选择获取数据按钮，并收集150扫描。
- 点击运行按钮来停止征收150扫描采集后。
- 打开数据浏览器模块，然后转到文件菜单并选择“打开”，然后选择在对话框中的文件。确认没有峰值在483，683，1163和1363米/ Z都存在类似于肽或汞（II） - 肽复合物。
- 运行1：0.5的汞（Ⅱ）：CGGC比溶液。
- 将250微升1：0.5的汞（Ⅱ）：将试样放入注射器CGGC比率。
- 将注射器插入该MS泵的注射器托架，连接管，并给装置。
- 通过选择文件图标，并输入文件名选择运行一个文件名。
- 按采样数据按钮，数据采集模块，并领取150扫描，然后点击运行按钮停止收集。
- 打开该模块，进入文件菜单并选择“打开”，然后选择在对话框中的文件。验证色谱峰含有包括一个用于仅在葛洲坝肽。
- 通过吸用500μl甲酸铵缓冲液，然后分配的甲酸铵缓冲到烧杯洗涤注射器。
- 选择在MS上的废物按钮和冲洗管道三次，用500μL甲酸铵缓冲。
- 通过吸用500μl甲醇，然后分配甲醇放入烧杯洗涤注射器。
- 冲洗管一次用500μl甲醇。
- 在MS选择负荷检测器按钮。
- 加入500微升甲酸铵缓冲到注射器。
- 将注射器插入该MS泵的注射器托架，连接管，并给装置。
- 选择通过选择文件图标并输入文件名运行缓冲液中的文件名。
- 按在获取数据按钮，并收集150扫描，然后单击停止运行按钮。
- 打开浏览器的数据模块，转到文件菜单并选择“打开”，然后选择在对话框中的文件。验证色谱是无效的，从以前的汞峰：葛洲坝运行。
- 运行1：1的汞（Ⅱ）：CGGC比溶液。
- 将250微升1:1汞（Ⅱ）：CGGC比样品进入注射器。
- 如对于步骤7.2.2.2到7.2.2.15重复类似的方式。
- 运行1：2的汞（Ⅱ）：CGGC比溶液
- 将250微升1：2的汞（Ⅱ）：CGGC浓度样品进入注射器。
- 如对于步骤7.2.2.2到7.2.2.15重复类似的方式。
- 运行的5mM甲酸铵pH为7.5的缓冲。
8.分析水星的反应混合物和CEEC样品轨道阱ESI质谱
- 在ESI质谱仪运行中东欧国家样本
- 重复分析程序（步骤7.1至7.2），使用CEEC样品和汞（II）和中欧和东欧国家的不同化学计量比的反应混合物。
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Representative Results
进行一项研究，以表征可能汞肽复合物组成了两个四肽，葛洲坝集团和中东欧国家（ 图1）通过ESI质谱法。汞（II）与CGGC或中欧和东欧国家的复合物经汞的混合物反应，调查（Ⅱ）中，在三个不同的摩尔比肽溶液：1：0.5，1：1和1：2（汞（II）的肽） 。汞（Ⅱ）的浓度为7.5×10 -6 M和肽浓度相应变化。
图1. Dicysteinyl肽的结构。在dicysteinyl四肽，葛洲坝集团与中欧和东欧国家的化学结构。 请点击此处查看该图的放大版本。
汞的 图2. ESI MS（II）和从含7.5×10 -6 M的 汞离子在甲酸铵缓冲液，含有不同汞离子pH为7.5的溶液CGGC电喷雾电离轨道阱质谱：CGGC化学计量比：（ 甲 ）1：0.5的比例，（B）的1：1的比例，和（C）的1：2的比例。插图显示指定的汞肽复合物的汞同位素模式。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 汞ESI MS（II）和东欧国家 。电喷雾电离轨道阱从质谱含7.5×10 -6 M的 汞离子在甲酸铵缓冲液，pH 7.5，含有不同汞离子的溶液：中欧和东欧国家的化学计量比：（A）1：0.5的比例，（B）的1：1的比例， 和 （C）1 ：2的比例。插图显示指定的汞肽复合物的汞同位素模式。 请点击此处查看该图的放大版本。
共收集汞（Ⅱ）配位与CGGC（图2）和中欧和东欧国家（图3）在不同的汞（Ⅱ）的肽化学计量比电喷雾轨道阱质量色谱（1：0.5，1：1和1：2）。所观察到的汞 - 肽复合物的类型显示不同的汞同位素峰（插图），其用于确定在复汞离子的数量以及depro数tonations。例如， 图1b插图显示的汞同位素特征在肽汞加合物，其对应于汞的七个主要的天然存在的同位素：196汞（0.146％），198汞（10.02％），199汞（16.84％） ，汞200（23.13％），201汞（13.22％），202汞（29.80％），204汞（6.85％），并在括号中指出％的天然丰度。两大同位素200 Hg和202汞柱显示2.3的不同相对强度比为1:3。因此这一个汞同位素簇的最强烈的同位素峰构成的单一同位素质量加合物（M / Z = 539）。它相关用两坐标复杂，这是由两个半胱氨酰硫醇的去质子化形成的，以形成[（CGGC-2H +汞柱）+ H] +加合物。此分析制备如下：
对于[（CGGC-2H +汞柱）+ H] + m / z值是当量人到（338 - 2 + 202 + 1）= 539。
图1A插图显示在肽汞加合物，其对应于一个两汞络合物作为计算通过使用ChemCal方案[（2CGGC-4H + 2HG）+ H] +（图4）中的汞同位素特征。理论质子单一同位素质量对应于1077.061一个m / z值，这是在计算出的同位素簇的第九同位素峰。 图1A插图显示对应于1077.1的m / z值，这也是第九峰的同位素峰在观察到的同位素簇。因此，始发加合物对于此同位素簇可以分配给[（2CGGC-4H + 2HG）+ H] +。
图4.理论同位素型态为[（2CGGC-4H + 2HG）+ H] + SUP>，理论同位素型态为[（2CGGC-4H + 2HG）+ H] +计算作为通过使用ChemCal程序。箭头表示同位素峰。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.阳离子化加合物，与汞肽复合物相关的一些阳离子的钠和钾加合物。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5示出与由CGGC形成的汞肽复合物相关的一些阳离子化钠和钾加合物。 Sodiated加合物22质量单位更大的牛逼韩相应的质子化汞葛洲坝复合物，而钾加成物38质量单位更大。占主导地位的质子CGGC二聚体（M / Z = 677）也形成与钠阳离子物种（M / Z = 699）和氢离子（M / Z = 715）。这进一步证实了形成CGGC二聚体未经半胱氨酰硫醇基的氧化形成二硫化物，这将导致在一个减少2个质量单位的质子化或阳离子化的加合物。
图6.重叠+1和+2价态，与汞肽离子[（CEEC-4H + 2HG）+ H] +在+1和+2充电状态有关叠嶂。 请点击此处查看大图这个数字。
图7.理论同位素型态为[（CEEC-4H + 2HG）+ H] +， 理论同位素型态为[（CEEC-4H + 2HG）+ H] +计算作为通过使用ChemCal程序。箭头表示同位素峰。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6示出重叠有在1和2的电荷汞中欧和东欧国家加合物有关的峰。它显示了与汞肽离子[（CEEC-4H + 2HG）+ H] +在1电荷和883.这一个m / z值相关联是在用两汞复杂协议作为计算同位素峰[（CEEC-4H + 2HG）+ H]通过使用ChemCal程序（图7）。理论质子单一同位素质量对应于883.032的m / z值。
上述观察到的[（CEEC-4H + 2HG）+ H] +加合物的883.03一个单一同位素峰与含有相应峰表示额外0.5质量单位另一个加合物重叠。与由轨道阱质谱仪取得的极高分辨率，可以假定这些重叠峰对应于加合物带有电荷的2。因此，的单一同位素质量的重叠复杂被电离，可以计算如下 ：图8示出了同位素峰之间的M / Z差为0.5，它们之间的质量差是1原子量。因此，充电状态为+2。为了计算汞肽复合物的质量，所述的M / Z的单一同位素峰用的充电状态相乘，然后从两个质子的质量，从而使该配离子正电减去。
计算为+2加合物：
同位素峰之间M / Z差为0.5
同位素峰之间的质量差为1原子量（1中子）
Z = 1除以0.5 = 2
M / Z为质子化单同位素峰（883.53×2） - 2 = 1765.06
为质子化单一同位素峰，[（2CEEC-8H + 4HG）+ H] +，上述m / z值与所计算由ChemCal程序作为1765.056（图8）的理论值相一致。
图8。 理论同位素型态为[（2CEEC-8H + 4HG）+ H] +，理论同位素型态为[（2CEEC-8H + 4HG）+ H] +计算作为通过使用ChemCal程序。箭头表示同位素峰。 请点击此处查看该图的放大版本。
分析汞肽复合物与ESI轨道阱质谱仪的优点是，每一个离子的电荷可以容易地分配，如上所示。含有碱性氨基末端的肽能容易地稳定正电荷。当使用电喷雾离子化和高分辨率质量分析仪，如轨道阱，肽离子与大于1充电的充电状态可确定更容易相比iontrap质量分析仪的分辨率较低。
（图3A和图6）相关联，重叠峰也通过串联MS分析。它并没有显示出任何的MS-MS裂解，这表明所得到的信号属于预期的化合物如上述所讨论的，并且不聚集形成在较高浓度的汞对肽比率工件。
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Discussion
疏水dicysteinyl四肽CGGC（C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; MW = 338）（图1），形成复合物与汞（Ⅱ），如图2和表 1此外，它形成的肽二聚体和三聚体。增量为在反应混合物中的肽的量增加。如由相关联的二聚体[（2M + H）+ = 677]的m / z值和三聚体〔（3M + H）+ = 1015]，CGGC的硫醇基团没有氧化而形成的实验条件下的二硫化物。这些相关CGGC物种的形成可能是由于此四肽的疏水性。 CGGC形成两种类型的复合物与汞对应于1：1的汞（Ⅱ）：肽和1：2的汞（Ⅱ）:(肽）如前面对dicysteinyl三肽7 报告了2络合物。但是，在过量或等效汞（Ⅱ）的存在下，它也FO有效值是2：2 [汞（Ⅱ）] 2：（肽）2络合物。
羧化dicysteinyl四肽中欧和东欧国家（C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; MW = 482）（图1）形成复合物与汞（Ⅱ），如图3和表 1对于没有形成中欧和东欧国家二聚体那样容易。该观察的疏水性更强的葛洲坝。媲美CGGC，它形成配合汞对应于1：1的汞（Ⅱ）：肽和1：2的汞（Ⅱ）:(肽）2络合物。然而，与辅助羧酸盐基时，它形成的2：2 [汞（Ⅱ）] 2：（肽）2配合物更容易。此外，在过量的汞时，它形成了2：1 [汞（Ⅱ）] 2：肽复合物和4：2 [汞（Ⅱ）] 4：（肽）2肽复合物，这些都没有为CGGC观察。
所观察到的信号选择为配合f显示摘要ormed为m / z值示于表1。
表水银肽复合信号1. 概述 。在甲酸铵缓冲液，pH值7.5的LTQ /轨道阱质谱色谱水星肽复合物的信号。
我们已经证明，汞（Ⅱ）和两个dicysteinyl四肽的反应形成复合物是依赖于汞（Ⅱ）的初始比率：肽以及辅助结合基团中的四肽dicysteinyl的存在。此外，汞和肽在根据规定的电喷雾条件所形成的复合物的化学计量精确的可以通过使用基于不同的汞同位素分布模式高分辨率ESI质谱测定。
在pept中半胱氨酸反应的IDE与汞（II）中，必须采取预防措施，以防止半胱氨酰硫醇基团的氧化，以形成二硫键。内所描述的协议中，缓冲溶液小心脱气并在氩气下储存。此外，所有的反应样品立即用ESI质谱分析之前制备。
由于在两个四肽，中欧和东欧国家和CGGC之间溶解度的差异，不同浓度的用于制备储备溶液。 CGGC肽的冷冻储备液弄湿乙腈中容易溶解，随后用5 mM的甲酸铵缓冲液，pH 7.5，以产生7.5×10 -4 M CGGC溶液。在中欧和东欧国家的制备在一个较低的浓度，7.5×10 -5 M，之前的汞（Ⅱ）：肽反应混合物的步骤，因为它的溶解度较低的。用于分析汞最佳稀释度（II）配合被认为是因为该肽，并允许溶解度为10 -5 M在质谱仪除去残余物。在合同的葛洲坝集团的解决方案，CEEC残留坚持管，这需要偶尔管更换。
使用ESI质谱法的汞肽复合物的分析的意义在于它软分析物的电离。这有利于分子离子与碎片可忽略不计的分析。如图这项工作中，它可以被用于表征基于所述签名汞同位素分布模式汞肽复合物的化学计量。然而，一个易失性缓冲区系统是必要的用ESI质谱分析。这可能会限制其实际使用用于鉴定需要更少的挥发性溶剂或缓冲介质溶解分析物。
正如我们前面所提到的7,8，ESI质谱法提供了一种精确测定汞和PEPT的化学计量的灵敏的分析工具IDE在指定的电喷雾离子化条件下的水银肽复合物。然而，它需要使用其他方法（例如，1 H，13 C，199汞核磁共振光谱，扩展X射线吸收精细结构，或电位17-18），以提供更精确地确定复合物中的含量的解。
我们已经表明，ESI带有轨道阱质量分析仪可用于分析汞肽复合物。我们预计，这种技术可以朝向其他金属离子及其络合物与各种小化合物的分析应用。这将是用于分析由能够以不同的同位素形式存在的其他金属离子形成配合物特别有用。
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Acknowledgments
MN-S承认来自美国国家科学基金会的支持下，瑞授予CHE 1011859.作者非常感谢三合会质谱设施在北卡罗来纳大学格林斯伯勒的使用的Thermo Fisher Scientific LTQ XL的Orbitrap质谱仪。作者感谢丹尼尔·托德，文森特·西卡，并Brandie Erhmann在北卡罗来纳大学格林斯伯勒分校，了解有关这项工作有益的建议和意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mercury(II) chloride | Sigma-Aldrich | 429724 | Highly toxic |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 516961 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher | A512-P500 | |
| HPLC water | Fisher | W5-4 | |
| HPLC Acetonitrile | Fisher | BP2405-1 | |
| HPLC Methanol | Fisher | A452-4 |
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