Introduction
Individuelle myofibers er store, svært organiserte syncytial celler. Det er noen få cellekultur modeller for muskel; men disse modellene har som sitt store begrensning at de ikke fullt differensieres til modne myofibers. For eksempel er C2C12 og L6-cellelinjer avledet fra mus og rotter, henholdsvis 1-4. Under betingelsene i serum sult, de mononukleære "myoblast-like" celler opphøre spredning, gjennomgå cellesyklus tilbaketrekning, og inngå myogenisk program forming multinucleated celler med sarcomeres, referert til som myotubes. Med langvarig dyrkningsforhold, kan myotubes utvise kontraktile egenskaper og "napp" i kultur. Humane cellelinjer har også nå etablert fem. I tillegg til disse udødeliggjorte cellelinjer kan mononukleære myoblaster isoleres fra muskel og under de tilsvarende betingelser i serum sult vil danne myotubes. Disse cellelinjer og primære myoblast kulturer er sterkt brukeful fordi de kan bli transfektert med plasmider eller transdusert med virus og brukt til å studere grunnleggende cellebiologiske prosesser. Men disse cellene, selv når talt til å danne myotubes, mangler mange av de viktigste funksjonene i moden muskel organisasjon. Nærmere bestemt, myotubes er mye mindre enn de enkelte modne myofibers og mangel på normal form av myofibers. Kritisk, myotubes mangler tverr (T-) tubuli, den membranøs nettverket som kreves for effektiv Ca 2+ utgivelsen hele myoplasm.
En alternativ metode til primær myoblast eller myogeniske cellelinjer innebærer å bruke modne myofibers. Transgenesis kan anvendes til å etablere ekspresjon av kodede proteiner, men denne metoden er kostbar og tidkrevende. In vivo elektroporering av mus muskel har dukket opp som en foretrukket fremgangsmåte for dets hastighet og pålitelighet 6-10.
Fremgangsmåter for in vivo elektroporering og effektiv isolering av myofibers hektarhar blitt optimalisert for musen flexor digitorum brevis (FDB) muskel 6. Metodene kan gjennomføres lett og er minimal invasiv å indusere in vivo uttrykk fra plasmider. Denne tilnærmingen er nå kombinert med høyoppløselig bildemetoder, inkludert bilde etter laser forstyrrelse av sarcolemma 6,7. Kombinasjonen av fluorescerende fargestoffer og ekspresjon av fluorescensmerkede proteiner kan benyttes for å overvåke cellebiologiske prosesser i modne myofibers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metodene i denne studien ble utført i etisk henhold til Northwestern University Feinberg School of Medicine Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjente retningslinjer. Alle forsøk ble gjort for å minimere lidelse.
1. Eksperimentell Prosedyre for in vivo Electroporation av flexor digitorum Brevis (FDB) Muskel Bundle i Mouse
- Design plasmider for in vivo uttrykk ved hjelp av en promoter kjent for å uttrykke i pattedyrceller (for eksempel cytomegalovirus, CMV) eller i muskel (f.eks Muscle Kreatinkinase, MCK) 6,7. Større plasmider kan uttrykke på lavere nivåer. CMV-promoteren er blitt brukt i stor utstrekning 6,7.
- Rens plasmider fra E. coli bruker endotoksin frie forhold i henhold til produsentens instruksjoner. Løs opp plasmid i sterile, endotoksin gratis TE buffer ved 2 - 5 mikrogram plasmid / mikroliter.
- Fortynn og aliquot plasmidet til en-konsentrasjonn av 20 ug DNA i 10 ul sterilt endotoksin fri TE (2 ug / ul) buffer per injeksjon i et sterilt mikrosentrifugerør. Forbered én tilsetning per injeksjon.
- Fortynn lager av hyaluronidase for å 1x med steril fosfatbufret saltvann uten kalsium og magnesium (PBS - / -), hvilket gir en endelig konsentrasjon på 8 enheter. Alikvoter av 10 pl fortynnet hyaluronidase per injeksjon i et sterilt mikrosentrifugerør.
- Anesthetize mus med 2,5% isofluran til bedøvet og ikke svarer til hale eller tå knipe. Plasserer dyret i en liggende stilling på en varmepute eller varmebord for å opprettholde normal kroppstemperatur.
- Rens fotputen av musen med en alternerende bruk av et povidon-jod skrubb og alkohol tre ganger ved anvendelse av en preparativ teknikk som stammer fra nålen området og som stråler utover. Denne teknikken holder nålen nettstedet i en aseptisk tilstand, minimere patogen introduksjon.
- Injisere footpad av the mus med 10 ul av 1 x hyaluronidase-oppløsning (2 mg / ml = 8 enheter) mellom huden og muskelen ved hjelp av en steril 1 ml sprøyte. Hyaluronidase fordøyer komponenter i den ekstracellulære matriks for å tillate en mer effektiv innføring av plasmidet i myofibers. Gå inn i bunnen av hælen og fremover av nålen mot tærne. Slipper væsken sakte som nålen er trukket tilbake. Injeksjonsstedet under huden vil utvide og begynner å bli rosa.
- Gjenta trinn 1,6 og 1,7 på motsatt fot.
- Koble fra anestesi og plasser musen tilbake i buret. La musen til fullt igjen fra anestesi.
- Vent 2 timer.
- Gjenta bedøvelse og fot steriliseringsprosedyrer, trinn 1.5 og 1.6.
- Injisere fortynnede plasmid-DNA inn i fotputen på samme måte som hyaluronidase. Sørg for at det maksimale volumet er 20 ul eller mindre. For dual plasmid ekspresjon injisere 20 ug av hvert plasmid med et maksimalt volum på 20 &# 181; l eller mindre.
- Gjenta plasmid injeksjon på kontralateral footpad eller bruk kontralaterale foten for kontroll injeksjoner.
- På foten som opprinnelig ble injisert, løfte huden bort fra understreking muskelen med fin pinsett og plassere en 27 G nål gjennom ballene i huden nær tærne i en posisjon vinkelrett på helbrede tå linje av foten. Ta en ekstra steril 27 G nål og legg den horisontalt gjennom huden på hælen. Plasser nåler parallelt med hverandre ~ 1 cm fra hverandre.
- Ved hjelp av krokodilleklemmer, klemme elektroder til de parallelle nålene gjør at nålene ikke kommer i kontakt med hverandre. Bruken av modelleringsleire kan feste klemmene på plass.
- Koble elektrodene til en elektrisk stimulator.
- Electroporate muskelen ved å bruke 20 pulser, 20 ms varighet / hver, på en Hz, 100 V / cm. Tærne kan nappe med stimulering.
- Gjenta stimulering prosedyren på motsatt fot hvis nødvendig.
- Fjern nåler. Tørk fotbladet med povidonjodid kratt.
- Slå av anestesi. Returner musen til utvinning bur og skjermen aktivitet. Hvis prosedyren ble utført som forventet, bør dyret gjenvinne normal bevegelse og innen 30 min og viser ingen forskjell i bevegelse og eller aktivitetsnivå fra pre-injeksjon oppførsel. Derfor er ingen post-prosedyre analgetika nødvendig. Ved utvinning, returnere dyret til vivarium.
Merk: Protein uttrykk kan analyseres så tidlig som 48 timer etter elektroporering. Men for å tillate mer fullstendig gjenoppretting etter elektroporering, vi foretrekker isolering og studier av myofibers 7 - 14 dager etter elektroporering 10. Uttrykket kan analyseres så lenge som 4 uker etter elektroporering.
2. Eksperimentell Prosedyre for isolering av flexor digitorum Brevis (FDB) Fibers
- Thaw kollagenase. For hver FDB bunt fremstille to brønner i en 12-brønns vevskulturplate. I en godt legge en ml av forvarmet Dulbeccos modifiserte Eagles-medium pluss bovint serumalbumin (BSA DMEM +) og i den andre vel tilsett 1 ml forvarmes Ringers løsning. I tillegg legge friske 10 ml 1x Ringers løsning på 35 mm Sylgard parabolen.
- Ofre dyret gjennom CO 2 eller bedøvende gass inhalering, etterfulgt av cervikal dislokasjon eller annen metode for å sikre døden.
- Fjern de bakbeina over ankelleddet med en ren barberblad og senk i 1x Ringers løsning i de 35 mm Sylgard parabolen.
- Pin ene foten stramt, såle vendt opp, på Sylgard fatet med 30 G kanyler gjennom hver av de 5 tå tips og på ankelen.
- Starter på ankelen, avklipt huden rett opp på siden av foten langs hårfestet mot tærne, forsiktig så du ikke nick muskelen under huden. Gjenta på den andre siden av foten.
- Å holde huden i bunnen av ankelen med fin pinsett, kutt i huden på tvers av hælen.
- Løfte hudenklaff med pinsett, peker den saks mot huden som å ikke nick muskelen. Klipp den underliggende bindevev, effektivt fjerner huden.
- For å fjerne FDB muskelbunt kutte den store senen på hælen for å frigjøre senen fra benet. Holder sene med pinsett, dissekere FDB bunt fra den store hvite senen nøye fjerne eventuelle bindevev festet til FDB med saks. Hvis det gjøres riktig bunten vil lett løft av de underliggende sener avslørende lyse hvite sener som fører til de enkelte sifre. Kutt FDB på sener nærheten tærne frigjøre bunten fra foten.
- Plasser hele muskelbunt i brønnen inneholder DMEM + BSA.
- Gjenta på motsatt fot.
- Når alle FDBs muskler er isolert, tilsett 100 mL av kollagenase til hver brønn som inneholder DMEM + BSA og muskel.
- Sjekk suksessen elektroporering på en invertert fluorescerende mikroskop før fordøyelsen. Hvis gjort properly, kan i overkant av 90% transfeksjonseffektivitet oppnås.
- Inkuber platen i en fuktet 37 ° C inkubator ved 10% CO2 i ca. 1 time. Inkubasjonstiden kan variere avhengig av sykdomsmodell og bakgrunn, og mye av kollagenase.
- Etter 1 time, forsiktig overføre FDB bunten til brønnen inneholdende bare Ringers oppløsning.
- Triturer FDB bunten i brønnen med Ringers løsning ved anvendelse av en 1 ml pipette. Skjær enden av pipettespissen med en ren barberblad, slik at bunten lett kan passere gjennom pipettespissen. Forsiktig triturer muskelen (~ 15 ganger) slik at bunten å passere opp og ned parallelt med spissen. Intakte fiber vil falle ut i Ringers løsning. Når fibrene ikke lett falle av bunten, plasserer muskelen tilbake i kollagenaseoppløsning.
- Plate de isolerte fibre på fatet ~ 500 mL per plate.
- Tillat muskelen til å fordøye i brønnen i 15 min.
- Gjenta trinn 2.15til 2,17 til bunten avtar i størrelse og flertallet av fibrene er dissosiert fra bunten (vanligvis totalt 2-3 ganger). Når dissosiert muskelen lett passerer gjennom en 1 ml pipette.
- La fibre feste til parabolen i minst 15 min. Fersk Ringers oppløsning kan tilsettes til platen for å fortynne rest kollagenase eller endres avhengig av tidsbegrensninger.
Merk: Fiber er nå klar for bildebehandling.
3. Eksperimentell Prosedyre for visualisering av laser-indusert membranskade ved bruk Konfokalmikroskopi
- Last fibre umiddelbart før bildebehandling med 300 ul 2,5 mikrometer FM 1-43 av FM 4-64 fargestoff i Ringers løsning. Vanligvis bilde fibre 15 min til 2 timer etter isolering. Imidlertid kan fibrene bli fotografert opptil 24 timer etter isolasjon.
- Plasser glassbunn fatet på et konfokal mikroskop utstyrt med en UV laser og en 60X / 63X objektiv.
- Finn en fiber. Sørg for at fiber er godt festettil parabolen ved å tappe foten på mikroskopet. Utelukke fibre som ble skadet i dissosiasjon prosessen. Skadede fibre kan inneholde membran blebs, opptak høye nivåer av FM fargestoff, curl eller bøye intenst.
- For å indusere membranskade på fiberen, plasserer sarcolemma i sentrum av bildevindu med et felt klar av kjerner. Fokus på sarcolemma bruker FM-dye-kanalen slik at sarcolemma er svært skarp.
- Plasser ROI korset på sarcolemma benytte FM 4-64 kanal.
- Bestråle en 1 pixel poeng på 80% effekt i 3 sek (~ 350 nm x 350 nm området). FM fargestoff vil gå inn i cellen på stedet av skader. Makt og tid kan justeres for å øke eller redusere arealet av fornærmelse.
- Ta bilder av fiberen før skade, ved tidspunktet for skade, hver 2 sekunder etter skade, og deretter hvert 10. sekund i opptil 5 minutter. Timing kan justeres avhengig av behov. Enkeltbilder kan konverteres til time-lapse filmer i Image J.
- Gjenta trinn3.3 gjennom 3.7 på opptil 3 fibre per tallerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Electroporation er en minimal invasiv teknikk som effektivt introduserer renset plasmid DNA inn i flexor digitorum brevis (FDB) muskelbunt (figur 1A). Syv dager etter transfeksjon fluorescently tagget protein er visualisert i isolerte myofibers (Figur 1b). Isolerte fibre blir deretter belagt og klargjort for avbildning på et konfokalt mikroskop. Fibre kan utsettes for laserinduserte skader. FM fargestoff kan brukes for å identifisere stedet for membranskade (figur 1C)
Under fordøyelsesprosessen, kan et lite antall myofibers bli skadet (hvit pil) (figur 2A). Skadede myofibers kan identifiseres ved membran blebbing stede på sarcolemma (svart pil). Den skadede fibre er ikke egnet for ytterligere eksperimentering, og bør ikke brukes. Representative konfokale bilder som viser uttrykket ofa fluorescerende fusjonsprotein innenfor de isolerte myofibers figur 2B. Utnyttelse av CMV-promoteren driver optimal protein-ekspresjon i myofibers. DIC bildebehandling viser en optimal fiber. FM 4-64 er til stede på membranen ved lave nivåer før skaden (figur 2C).
Representant bilde av en myofiber lastet med FM 4-64 avbildes på en Leica SP 5 konfokal mikroskop. Sarcolemma er sentrert i synsfeltet (hvite bokser) og ROI trådkors (hvit x) er justert på den skarpe, fluorescerende kanten av sarcolemma i et område blottet for myonuclei (figur 3, i midten). Kjerner unngås fordi de kan påvirke FM dye analyse post bildebehandling. Ved membranskade, FM fargestoff minimal trer normale myofibers (figur 3, høyre). Muskelfibre defekte i membranen reparasjon viser økte nivåer av FM dye opptak på laser-indusert skade.
-together.within-page = "1"> 
Figur 1. Skjematisk av in vivo Electroporation og laser Damage protokoll. (A) Hyaluronidase blir injisert i fotputen av en bedøvet mus. Plasmid DNA blir deretter injisert og spenning. (B) Syv dager etter injeksjonen, flexor digitorum brevis (FDB) bundle (hvit pil midtre panelet) er isolert fra fotbladet later synlige sener (svart pil). (C) Fiber er belagt og laser-indusert skade er utført på levende myofibers. Venstre panel, skala 50 mikrometer. Høyre panel, skala fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3551fig2.jpg "/>
Figur 2. Isolerte Myofibers Uttrykke fluorescently Tagged proteiner. Syv dager etter elektroporering, er protein uttrykk oppdaget hele myofiber. (A) isoleringsprosedyren resulterer i et lite antall ubrukelige myofibers med distinkte membran blebbing (svart pil) og membran forstyrrelser (hvit pil). Skala fem mikrometer. (B) Representant bilde av en sunn myofiber. Jevnt fordelt sarcomeres er visualisert i DIC imaging (til venstre). En myofiber uttrykker annexin A6 merket med GFP (midtre panelet). Det er minimal FM fargestoff signal før skaden (høyre panel). Skala fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Justering av LaserKrysset på FM-positive sarcolemma. Regionen av interesse på sarcolemma er sentrert innenfor synsfeltet. Sarcolemma er forstørret (hvit stiplet boks) og avkastning trådkorset justert på den skarpe FM-positive kanten av sarcolemma i et område blottet for kjerner (midtre panelet). Ved skade, trer FM fargestoff på skadestedet (høyre panel, hvit pil). Skala fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av elektroporering for å studere fluorescerende merkede proteiner in vivo, er ideelt egnet for studiet av muskelen gitt fraværet av egnede cellelinje modeller som nøyaktig gjengir hele cellestrukturen i muskel. Denne protokollen beskriver utnyttelsen av elektroporering og høy oppløsning konfokalmikroskopi å gi detaljert avbildning av protein lokalisering og trans etter laser såret. Denne metoden kan tilpasses for å studere andre cellulære prosesser, inkludert cytoskeleton omorganisering, trafficking, og fusion.
Ved hjelp av denne protokollen, opp til 90% av myofibers innenfor FDB muskelbunt express plasmid, og dette kan sees lett av fluorescensmikropskopi både før og etter myofiber dissosiasjon. Det er typisk en gradient av uttrykk med høyere ekspresjon observert nærmere injeksjonsstedet. På grunn av gradienten til uttrykk, kan virkningen av å variere protein ekspresjon overvåkes froma enkelt eksperiment. Som med alle transfeksjonsmetoder, er denne metoden begrenset av problemer knyttet til overekspresjon. Spesielt, med ekspresjon i høyt nivå, kan protein aggregering forekomme. Vår erfaring viser mCherry fluorescerende lappen mer aggregering enn den forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) tag redusere oppløsningen og skarpheten på proteindomener (for eksempel se Figur 4 på 7). I tillegg mTurquise2 og Venus fluorescerende tags både demonstrere tilstrekkelig fluorescens uttrykk. Men begge proteiner er mindre lys enn EGFP.
Denne metoden kan brukes til å avbilde levende myofibers under en rekke forhold, inkludert testing farmasøytiske midler og celle såret. Vi brukte laser skade å forstyrre sarcolemma, men andre såret prosesser kan være tilpasset denne metoden. For dette formål, blebs dannelse av membranen er laget av osmotisk sjokk, så vel som membranskade indusert ved valsing glassperler kan også blivurderes å benytte elektroporerte myofibers 11,12. For laser såret, vil typen og kraften av laser, så vel som objektiv påvirke lang tid som trengs for å lage en membran lesjon 13,14. Videre vil eksterne buffere, spesielt konsentrasjonen av kalsium og FM fargestoff i bufferen påvirke reparasjonsprosessen 13,15. Denne metodikken har blitt testet på både Nikon og Leica konfokale bildesystemer, og begge er i stand til å utføre teknikken. FM 4-64 er godt egnet for eksperimentering med grønt fluorescerende protein 7. Andre har brukt FM 1-43, et annet lipofilt fargestoff som binder negativt ladede fosfolipider med en eksitasjon topp ved 470 nm og emisjonstopp ved 610 nm, noe som begrenser anvendelsen av dette fargestoff 13,15,16. Bleking og fototoksisitet er begge mulige utfall på grunn av over-bildebehandling. Bestemmelse av riktig balanse mellom eksponeringstiden, bildefrekvensen og antall kanaler som avbildeser parametre lett manipulert for å redusere disse effektene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir NS047726, NS072027, og AR052646.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50 ml +100 g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1 ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30 G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100 mg/50 ml DMEM |
| Falcon 60 mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27 G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock |
| 1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35 mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
References
- Blau, H. M., et al.
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).
