DNA Electroporation, Isolering og Imaging av Myofibers
Summary
This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Abstract
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Introduction
Individuelle myofibers er store, svært organiserte syncytial celler. Det er noen få cellekultur modeller for muskel; men disse modellene har som sitt store begrensning at de ikke fullt differensieres til modne myofibers. For eksempel er C2C12 og L6-cellelinjer avledet fra mus og rotter, henholdsvis 1-4. Under betingelsene i serum sult, de mononukleære "myoblast-like" celler opphøre spredning, gjennomgå cellesyklus tilbaketrekning, og inngå myogenisk program forming multinucleated celler med sarcomeres, referert til som myotubes. Med langvarig dyrkningsforhold, kan myotubes utvise kontraktile egenskaper og "napp" i kultur. Humane cellelinjer har også nå etablert fem. I tillegg til disse udødeliggjorte cellelinjer kan mononukleære myoblaster isoleres fra muskel og under de tilsvarende betingelser i serum sult vil danne myotubes. Disse cellelinjer og primære myoblast kulturer er sterkt brukeful fordi de kan bli transfektert med plasmider eller transdusert med virus og brukt til å studere grunnleggende cellebiologiske prosesser. Men disse cellene, selv når talt til å danne myotubes, mangler mange av de viktigste funksjonene i moden muskel organisasjon. Nærmere bestemt, myotubes er mye mindre enn de enkelte modne myofibers og mangel på normal form av myofibers. Kritisk, myotubes mangler tverr (T-) tubuli, den membranøs nettverket som kreves for effektiv Ca 2+ utgivelsen hele myoplasm.
En alternativ metode til primær myoblast eller myogeniske cellelinjer innebærer å bruke modne myofibers. Transgenesis kan anvendes til å etablere ekspresjon av kodede proteiner, men denne metoden er kostbar og tidkrevende. In vivo elektroporering av mus muskel har dukket opp som en foretrukket fremgangsmåte for dets hastighet og pålitelighet 6-10.
Fremgangsmåter for in vivo elektroporering og effektiv isolering av myofibers hektarhar blitt optimalisert for musen flexor digitorum brevis (FDB) muskel 6. Metodene kan gjennomføres lett og er minimal invasiv å indusere in vivo uttrykk fra plasmider. Denne tilnærmingen er nå kombinert med høyoppløselig bildemetoder, inkludert bilde etter laser forstyrrelse av sarcolemma 6,7. Kombinasjonen av fluorescerende fargestoffer og ekspresjon av fluorescensmerkede proteiner kan benyttes for å overvåke cellebiologiske prosesser i modne myofibers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruken av elektroporering for å studere fluorescerende merkede proteiner in vivo, er ideelt egnet for studiet av muskelen gitt fraværet av egnede cellelinje modeller som nøyaktig gjengir hele cellestrukturen i muskel. Denne protokollen beskriver utnyttelsen av elektroporering og høy oppløsning konfokalmikroskopi å gi detaljert avbildning av protein lokalisering og trans etter laser såret. Denne metoden kan tilpasses for å studere andre cellulære prosesser, inkludert cytoskeleton omorganisering, traffic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir NS047726, NS072027, og AR052646.
Materials
| DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
| Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
| 1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
References
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).
