This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Bireysel myofibers büyük, çok organize sinsityal hücrelerdir. Kas birkaç hücre kültürü modeli vardır; Ancak, bu modeller tam olgun myofibers içine ayırt yok onların ana sınırlama olarak var. Örneğin, C2C12 ve L6 hücre çizgileri farelerde ve sıçanlarda, sırası ile 1-4 elde edilir. Serum açlık koşullarında, tek çekirdekli "miyoblast gibi" hücreler çoğalması ateşkes hücre döngüsü çekilmesi geçmesi ve sarkomer ile çok çekirdekli hücreler oluşturan Miyojenik programa girmek, miyotüplerinin olarak anılacaktır. Uzun süreli kültür koşulları ile miyotüpleri kasılma özellikler gösterebilir ve kültürde "seğirme". İnsan hücre hatları da hemen 5 tespit edilmiştir. Bu ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına ek olarak, tek çekirdekli miyoblastlar kas ve miyotüpler oluşturacak serum açlık benzer koşullar altında izole edilebilir. Bu hücre hatları ve birincil miyoblast kültürleri çok kullanımı vardırful bu plasmidler ile transfekte ya da virüs ile transduse ve temel hücre biyolojik süreçleri incelemek için kullanılabilir, çünkü. Miyotüpler oluşturmak için uyarılan Ancak, bu hücreler, hatta, olgun kas örgütün belirgin özelliklerinden birçoğu yoksundur. Özellikle, miyotüpleri bireysel olgun myofibers çok daha küçüktür ve myofibers normal şeklini yoksundur. Kritik, miyotüpleri enine (T) tübüller eksikliği, myoplasm boyunca verimli Ca 2+ serbest bırakılması için gerekli membranöz ağ.
Birincil miyoblast veya myojenik hücre hatlarına alternatif bir yöntem olgun myofibers kullanarak gerektirir. Transgenesis etiketli proteinlerin ekspresyonunu belirlemek için kullanılabilir, ancak bu yöntem pahalı ve zaman alıcı bir iştir. Fare kas in vivo elektroporasyon hızı ve güvenilirliği 6-10 için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır.
In vivo elektroporasyon ve myofibers ha etkin izolasyon yöntemleriFare fleksör digitorum brevis (FDB) kas 6 için optimize oldum. Yöntemler hali hazırda tamamlanmış ve plazmidlerden in vivo ifadenin uyarılması için minimal invaziv girmektedir. Bu yaklaşım artık sarcolemma 6,7 lazer bozulması sonrasında görüntüleme dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri ile kombine edilir. Floresan boyalar ve floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu kombinasyonu, olgun myofibers hücre, biyolojik işlemleri izlemek için de kullanılabilir.
In vivo olarak, floresan etiketli proteinler çalışma elektroporasyon kullanımı ideal sadakatle kas tüm hücre yapısını taklit Uygun bir hüre hattı modellerinin olmaması ile kas çalışma için uygundur. Bu protokol lazer yaralama sonra protein lokalizasyonu ve translokasyon ayrıntılı görüntüleme sağlamak için elektroporasyon ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanımını açıklar. Bu yöntem hücre iskeleti yeniden, insan ticareti ve füzyon gibi diğer hücresel süreçl…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NS047726, NS072027 ve AR052646 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.
DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
Clay | Electroporation | ||
Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |