DNA电穿孔，肌纤维的分离和成像

Introduction

单个肌纤维比较大，高度组织化的合体细胞。有几个细胞培养模型为肌肉;然而，这些模型具有与它们不完全分化为成熟肌纤维的主要限制。例如，C2C12和L6细胞系来自于小鼠和大鼠，分别^1-4。下血清饥饿的条件下，单核“成肌细胞样”细胞停止增殖，进行细胞周期撤出，并进入生肌程序与肌节形成多核细胞，称为肌管。由于长时间的培养条件，肌管可能会出现收缩特性和文化“抽搐”。人类细胞系现在也已被建立^5。除了这些永生化细胞系，单核成肌细胞可以从肌肉和血清饥饿将形成肌管的类似的条件下进行分离。这些细胞系和原发性成肌细胞培养物是高度使用FUL因为它们可以转染的质粒或转导的病毒和用于研究细胞基本生物学过程。但是，这些细胞，即使当诱导以形成肌管，缺乏许多成熟肌肉组织的显着特征。具体地，肌管比单个成熟肌纤维小得多，缺乏肌纤维的正常形状。关键的是，肌管缺乏横（T-）管，需要有效^的 Ca 2+整个myoplasm释放膜状网络。

的替代方法初级成肌或肌原细胞系造成把成熟的肌纤维。转基因可被用来建立标记蛋白质的表达，但这种方法是昂贵且耗时的。 在体内电穿孔小鼠肌肉的已作为其速度和可靠性^6-10的优选方法。

方法用于体内电穿孔和的肌纤维公顷的有效隔离已经经过优化，鼠标趾短屈肌（FDB）肌肉^6。该方法可以很容易地完成，是微创在体内表达由质粒诱导。现在这种做法是结合高分辨率成像方法，包括肌膜^6,7激光破坏后成像。荧光染料和荧光标记的蛋白质的表达的组合可被用来监测在成熟肌纤维细胞的生物学过程。

Protocol

本研究的方法是在道德根据医学实验动物管理和使用委员会的西北大学Feinberg医学院（IACUC）批准执行准则。所作的所有努力，以尽量减少痛苦。

对于趾短屈肌的体内电 （FDB）肌束在小鼠1.实验步骤

1. 使用已知的在哺乳动物细胞中表达的启动子设计的质粒的体内表达 （例如，巨细胞病毒，巨细胞病毒），或在肌肉（例如，肌肉肌酸激酶^{，MCK）6,7。}较大的质粒可以表达在较低的水平。在CMV启动子已经被广泛地使用^6,7。
2. 净化从大肠杆菌的质粒使用大肠杆菌每制造商的说明无内毒素的条件。溶解在无菌，无内毒素TE缓冲质粒在2 - 5微克质粒/μL。
3. 稀释和分装的质粒到concentratio于10μl无菌无内毒素的TE（2微克/微升）正20微克的DNA每次注射缓冲到无菌离心管中。准备每次注射一个等份。
4. 稀透明质酸酶的库存至1x用无菌磷酸盐缓冲盐水不含钙和镁（PBS - / - ），得到的8个单位的终浓度。等份加入10μl每次注射稀释透明质酸到无菌离心管中。
5. 麻醉用2.5％异氟醚，直到镇静和反应迟钝尾巴或脚趾捏鼠标。将动物在加热板上或加热表仰卧位置，以保持正常体温。
6. 使用制备型技术从针站点始发和向外辐射清洁鼠标的足垫用聚维酮碘擦洗和醇的交替应用三次。这一技术保持针站点在无菌条件下，最大限度地减少病原体的介绍。
7. 注入日的足垫E滑鼠与10微升的皮肤，并用无菌的1ml注射器的肌肉之间的1倍的透明质酸酶溶液（2毫克/毫升= 8单位）。透明质酸酶消化细胞外基质的成分，以允许更有效的进入质粒的成肌纤维。输入在脚后跟的基部和推进针朝向脚趾。缓慢释放的液体当针缩回。皮肤下的注射部位将扩大，并开始变成粉红色。
8. 重复步骤1.6和1.7对侧脚。
9. 断开麻醉，然后将鼠标放回笼子。让鼠标完全从麻醉中恢复。
10. 等待2小时。
11. 重复麻醉和脚消毒程序，步骤1.5和1.6。
12. 注入稀释质粒DNA导入以相同的方式如透明质酸酶的足垫。确保最大音量为20微升或更少。对于双质粒表达注资20微克每个质粒与20的最大容积＃181; l或更少。
13. 重复对侧足垫质粒注射或使用对侧脚控制注射。
14. 上，最初注入的脚，抬起皮肤远离强调肌肉用细镊子和放置一个27G的针头通过邻近脚趾的皮肤中的球的位置垂直于脚的愈合趾线。花一秒钟无菌27G的针头和水平放置它通过皮肤的脚跟。地方针彼此平行〜1厘米分开。
15. 用鳄鱼钳，钳电极平行针，确保针不接触对方。使用橡皮泥可以保护夹到位。
16. 连接到电极的电刺激器。
17. 通过施加20个脉冲，20毫秒持续时间/每个，在1Hz，在100伏/厘米电穿孔肌肉。脚趾可能会抽搐与刺激。
18. 如果需要的话，重复的刺激方法对侧脚。
19. 取出针。请用碘伏擦洗脚垫。
20. 关闭麻醉。返回鼠标到恢复笼和监控活动。如果该程序是进行如预期的动物应恢复正常下地在30分钟内，并表现出从预喷射行为在行走或活性水平没有差异。因此，需要没有后置过程镇痛药。恢复后，返回动物到动物饲养。
    注：蛋白质表达可以电穿孔后进行测定早48小时。然而，让电后更完全恢复，我们更倾向于孤立和肌纤维的研究7 -电^10日之后 14天。表达可用来测定，只要电穿孔后4周。

对于趾短屈肌（FDB）纤维分离2.实验过程

1. 解冻胶原酶。对于每一个FDB捆在一个12孔培养板准备两口井。在一个孔加1米升预热的Dulbecco氏改良的Eagles介质加牛血清白蛋白（DMEM + BSA）和在其它公添加预热的林格氏溶液1毫升。此外，加入新的10毫升1X林格氏液，以35毫米的Sylgard菜。
2. 通过CO ₂或麻醉气体吸入牺牲动物，颈椎脱位或其它方法，以确保死亡。
3. 使用干净的刀片卸下后英尺以上的踝关节和淹没在35毫米培养皿SYLGARD 1×林格溶液。
4. 脚一只脚紧，鞋底朝上，上的Sylgard菜通过各5足尖和脚踝地下30针。
5. 开始在脚踝，剪断皮肤向上伸直脚沿着朝向脚趾发际线的一侧，注意不要切口皮下的肌肉。重复上脚的另一侧。
6. 保持皮肤在含有细镊子脚踝的基础上，跨越足跟皮肤。
7. 提升肌肤瓣钳，指向你的剪刀朝皮肤不尼克肌肉。剪断底层结缔组织，有效去除皮肤。
8. 要删除FDB肌束切大牛筋鞋跟释放从骨肌腱。保持用钳子肌腱，解剖FDB束从白色大腱小心除去附着在FDB用剪刀任何结缔组织。如果处理得当的包很容易取下底层筋透出明亮的白色筋导致个别数字的。切FDB在靠近脚趾释放从脚被捆绑的肌腱。
9. 发生在井的DMEM + BSA整个肌束。
10. 重复对侧脚。
11. 一旦所有FDB肌肉分离，添加100微升胶原酶到每孔含有DMEM + BSA和肌肉。
12. 检查电对之前消化一个倒置荧光显微镜成功。如果做得properlY，90％的转染效率向上可以实现。
13. 孵育板在湿润的37℃培养箱中，在_10％CO 2的约1小时。根据疾病模型和背景和很多胶原酶的孵育时间可以变化。
14. 1小时后，小心地将FDB束传送到井仅含林格溶液。
15. 磨碎FDB束在井中使用1毫升吸移管的林格溶液。切枪头用干净的刀片，使得包可以通过移液管尖端容易地通过的末端。轻轻磨碎的肌肉（〜15倍），允许包通过上下平行提示。完整的纤维会脱落进林格氏液。当纤维不容易脱落的捆绑，把肌肉放回胶原酶溶液。
16. 板隔离纤维上的菜〜500微升每盘。
17. 允许肌肉在井消化15分钟。
18. 重复步骤2.15到2.17，直到束在尺寸减小，并且大部分的纤维从束（通常是一个总的2-3倍）解离。一旦分离肌肉容易通过1毫升的枪头。
19. 让纤维附着到培养皿为至少15分钟。新鲜林格氏溶液可以被添加到该板以稀释残余的胶原酶或改变取决于时间的限制。
    注：纤维是现在准备成像。

利用共聚焦显微镜的激光诱导膜损伤可视化3.实验步骤

1. 负载纤维成像300微升2.5微米的FM 4-64染料林格氏液FM 1-43前夕。通常，分离后的图像的纤维15分钟到2小时。然而，纤维可以被成像到后24小时的隔离。
2. 广场上共聚焦显微镜配有紫外激光器和60X / 63X客观的玻璃底菜。
3. 找到一个纤维。确保光纤连接牢固的菜通过点击显微镜基地。排除了被损坏的分解过程中的纤维。受损的纤维可以包含膜泡，吸收高水平的FM染料，卷曲或弯曲强烈。
4. 为了诱导的纤维膜损伤，在成像窗口有明确的核场的中心位置肌膜。专注于使用FM染料通道，使肌纤维膜是极其尖锐的肌膜。
5. 广场上利用FM 4-64通道肌膜的投资回报率十字线。
6. 照射在80％功率的1个像素点，3秒（〜350纳米x 350纳米范围）。调频染料会进入细胞在损伤部位。功率和时间可以调整，以增加或减少损伤的面积。
7. 损坏之前捕获光纤的图像，在损坏的时间，每2秒后的损害，那么，每10秒，至多5分钟。定时可以根据需要进行调整。单个图像可以被转换为时间推移电影在图像J。
8. 重复步骤3.3通过3.7每个培养皿最多3纤维。

Representative Results

电穿孔是一种微创技术，有效地引入了纯化的质粒DNA进趾短屈肌（FDB）肌束（图1A）。七天在转染后荧光标记的蛋白可视化隔离肌纤维（图1B）。分离的纤维然后铺板并制备用于成像上的共焦显微镜。纤维可以进行激光诱导的损伤。调频染料可用于识别的膜损伤的位点（ 图1C）

在消化过程中，少数肌纤维可能会受伤（白色箭头）（ 图2A）。受损的肌纤维可以通过膜起泡出席肌膜（黑色箭头）被识别。受损的纤维不适合于进一步的实验，不应该使用。代表共聚焦图像显示的表达Ø分离的肌纤维。图2B内发荧光融合蛋白。 CMV启动子的利用驱动器的最佳肌纤维蛋白的​​表达。 DIC成像显示了一个最佳的纤维。调频4-64是存在于该膜在较低的水平之前，损坏（图2C）。

装载了FM 4-64成像在Leica SP 5共聚焦显微镜肌纤维的形象代表。肌膜居中在视（白框）和ROI十字线（白色x）的领域上对齐肌膜的区域缺乏肌细胞核（图3，中）的脆，荧光边缘。核被避免，因为它们会影响FM染料分析后成像。经膜损伤，FM染料微创进入正常的肌纤维（ 图3右）。肌纤维有缺陷的膜修复将显示在激光损伤增加了FM染率水平。

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图1.示意图 体内 电穿孔和激光损伤议定书 。（A）的透明质酸酶注射到麻醉小鼠的足垫。质粒DNA，然后注入并施加电压。 （ 乙 ）七天后喷射，所述趾短屈肌（FDB）束（白色箭头中间面板）被从足垫留下露筋（黑色箭头）分离。 （C）的纤维被镀和激光损伤的是活的肌纤维进行。左侧面板中，规模50微米。右侧面板中，规模5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2.隔离肌纤维表达荧光标记的蛋白质。七天电穿孔后，蛋白表达在整个检测到的肌纤维。 （A）分离过程中产生少量的不可用的肌纤维具有独特的膜起泡（黑色箭头）和膜破坏（白色箭头）的。比例尺为5μm。 （B）一种健康肌纤维的代表性的图像。均匀间隔的肌节可视化中的DIC成像（左）。一肌纤维表达膜联蛋白A6标记为绿色荧光蛋白（中图）。有最小的FM染料信号之前伤害（右图）。规模5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3.对准激光在FM阳性肌膜十字星。的肌膜上感兴趣区域的视场范围内居中。肌膜被放大（白色虚线框）和投资回报率的十字线的肌膜在一个地区缺乏核（中图）的急剧FM-正沿对齐。一旦损坏，FM染料进入在损伤部位（右图，白色箭头）。规模5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

利用电穿孔来研究荧光标记的蛋白质在体内非常适合于肌肉由于缺乏合适的细胞系模型，忠实复制肌的整个细胞结构的研究。这个协议描述电穿孔和高分辨率共焦显微镜的利用率，激光伤人后提供蛋白定位和易位的详细成像。这种方法可以适用于研究其他细胞过程，包括细胞骨架重组，贩运和融合。

使用该协议，高达90％的FDB肌束明示质粒内的肌纤维，这可以容易地通过荧光显微镜之前和肌纤维离解后可以看到。有典型的表达与高表达观察更靠近注射部位的梯度。因为表达的梯度，变化的蛋白表达的效果可以来回监视马单一的实验。如同所有的转染方法，该方法是通过与过表达问题的限制。值得注意的是，与高水平表达，蛋白质聚集可发生。在我们的经验中，mCherry荧光标签表明比增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标签降低分辨率和蛋白质结构域锐度多个聚集（例如，参见图4中的^7）。此外，mTurquise2和金星荧光标记既表现出足够的荧光表达。然而，这两种蛋白质是比绿色荧光蛋白那么明亮。

这种方法可用于将图像的活的肌纤维在各种条件下，包括测试药剂和细胞伤人。我们使用的激光损伤扰乱肌膜，但其他创伤过程可适于此方法。为此，在形成膜的泡通过渗透休克以及诱导通过轧制玻璃珠也可以是膜损伤创造评估利用电肌纤维^11,12。激光伤人，类型和激光的功率，以及目标将影响来创建膜病变^13,14所需的时间长度。此外，外部缓冲器，缓冲器内钙的具体浓度和FM染料会影响修复过程^13,15。这种方法已经过测试，在两个尼康和徕卡共聚焦成像系统，无一不是能够执行的技术。调频4-64是非常适合的实验与绿色荧光蛋白^7。他人已经使用调频1-43，另一亲脂性染料结合带负在470nm和发射峰在610纳米，这限制了这种染料^13,15,16的应用电荷的磷脂用激发峰。漂白和光毒性是由于过度成像两种可能的结果。确定曝光时间，图像频率和通道数之间的适当平衡成像很容易操纵，以减少这些影响的参数。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	11995-073	Dissection Media Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II	Life Technologies	17101-015	Fiber Digestion Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes	Fisher Scientific	877229	Fiber Digestion
Ringers Solution			Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM   KCl 2 mM   CaCl2 1 mM   MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes	Axygen	T-1000-C-R	Digestion
Razor Blades	Personna	94-120-71	Digestion
Precision Glide 30 G needle	BD Biosciences	305128	Dissection
1x PBS (-/-)	Life Technologies	14190-250	Dissection
Sylgard 184	Fisher Scientific	50-366-794	Dissection
Forceps	FST by Dumont	#5/45	Dissection
Forceps	Roboz	RS-4913	Dissection
Scissors	World Precision Instruments	500260	Dissection
BSA	Sigma	A7906	Dissection media Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes	Fisher Scientific	08772B	Dissection- used to hold sylgard
Clay			Electroporation
Stimulator	Grass	s88x	Electroporation
Clamps	Radio Shack	270-356	Electroporation
Triadine	Aplicare	82-220	Electroporation
Precision Glide 27 G needle	BD Biosciences	305136	Electroporation
Simulator	Grass	SIU-V	Electroporation
Gauze	Covidien	2146	Electroporation
Hyaluronidase	Sigma	H4272	Injection Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)	BD Biosciences	329420	Injection
Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	02-682-550	Injection
35 mm glass bottom Microwell dish	MaTek	P35G-1.5-14-C	Microscopy
FM 4-64	Life Technologies	T-13320	Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43	Life Technologies	T-35356	Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid Purification