Summary

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

Published: December 23, 2015
doi:

Summary

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

Abstract

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

Introduction

個々の筋線維は、大規模な、高度に組織化された合胞体細胞です。筋肉のためのいくつかの細胞培養モデルがあります。しかし、これらのモデルは、彼らが完全に成熟した筋線維に分化していない彼らの主要な制限として持ちます。例えば、C2C12およびL6細胞株は、マウス、ラット、それぞれ1-4から誘導されます。血清飢餓の条件下で、単核「筋芽細胞様」細胞は、増殖を止める細胞周期の撤退を受けて、サルコメアと多核細胞を形成する筋形成プログラムに入力して、筋管と呼ばれます。長期培養条件では、筋管が収縮特性を示すことができ、培養中の「けいれん」。ヒト細胞株は、今も5確立されています。これらの不死化細胞株に加えて、単核筋芽細胞が筋から単離することができ、血清飢餓の同様の条件下での筋管を形成します。これらの細胞株および初代筋芽細胞培養物は、高度に使用されていますそれらはプラスミドでトランスフェクトまたはウイルスで形質導入し、基本的な細胞生物学的プロセスを研究するために使用することができるので、FUL。筋管を形成するように誘導された場合しかし、これらの細胞は、さらに、成熟した筋組織の顕著な特徴の多くを欠いています。具体的には、筋管は、個々の成熟した筋線維よりもはるかに小さく、筋線維の正常な形状を欠いています。批判的に、筋管は、筋形質全体で効率的なのCa 2+放出のために必要な膜状のネットワークを横断(T-)細管を欠いています。

一次筋芽細胞または筋原細胞株の代替方法は、成熟した筋線維を使用することを伴います。形質転換は、標識タンパク質の発現を確立するために使用することができるが、この方法は、コストと時間がかかる。マウス筋肉インビボ電気穿孔は、速度と信頼性6-10ための好ましい方法として浮上しています。

in vivoでのエレクトロポレーションおよび筋線維ヘクタールを効率的に分離するための方法マウス短趾屈筋(FDB)の筋肉6のために最適化されまし。方法は簡単に完了し、プラスミドからin vivo発現誘導するために最小限の侵襲性ですることができます。このアプローチは現在、筋細胞膜6,7のレーザ破壊後のイメージングを含む高解像度イメージング法と組み合わされます。蛍光色素および蛍光標識されたタンパク質の発現の組み合わせは、成熟筋線維中の細胞の生物学的プロセスをモニターするために使用することができます。

Protocol

この研究における方法は、医療施設内動物管理使用委員会(IACUC)のノースウェスタン大学フェインバーグ学校と倫理に従って行ったガイドラインを承認しました。すべての努力は苦痛を最小限にするために行われました。 マウスにおける屈筋Digitorumブレビスの in vivoエレクトロポレーション(FDB)筋肉バンドル1.実験手順哺乳動物細胞で発現することが知られている…

Representative Results

エレクトロポレーションは、効率的に短趾屈筋(FDB)の筋肉の束( 図1A)に精製したプラスミドDNAを導入して低侵襲的手法です。七日には、蛍光標識タンパク質が分離された筋線維( 図1B)で可視化され、トランスフェクション後。単離された繊維は、次に、播種し、共焦点顕微鏡で画像化のために調製されます。繊維は、レーザ誘起損傷を…

Discussion

生体内での蛍光タグ付きタンパク質を研究するためのエレクトロポレーションの使用は忠実に筋肉の全体のセル構造を複製し、適切な細胞株モデルの欠如与えられた筋肉の研究のために理想的に適しています。このプロトコルは、エレクトロポレーションおよびレーザー創傷後のタンパク質の局在化及び転座の詳細な画像を提供するために、高解像度の共焦点顕微鏡の利用を説明して…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、国立衛生研究所NS047726、NS072027、およびAR052646を付与することによってサポートされていました。

Materials

DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50ml +100g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10mM HEPES
pH7.4 in H2O
1ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100mg / 50ml DMEM
Falcon 60mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock
1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

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Cite This Article
Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

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