Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering CRISPR / Cas9 mediert Monoallelic Slett å studere Enhancer funksjon i mus embryonale stamceller

doi: 10.3791/53552 Published: April 2, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Transkripsjonsregulerende elementer er avgjørende for rom-tid-finjustering av genuttrykk under utvikling en og modifikasjon av disse elementene kan føre til sykdom på grunn av avvikende genuttrykk to. Mange sykdomsassosierte regioner identifisert av genom brede assosiasjonsstudier er i ikke-kodende regioner og har funksjoner av transkripsjonsforsterkere 3-4. Identifisere Forsterker og matche dem med genene de regulerer er komplisert som de ofte ligger flere kilobaser bort fra genene de regulerer og kan aktiveres i en vev-spesifikk måte 5-6. Enhancer spådommer er ofte basert på histone modifikasjon merker, mediator-cohesin komplekser og binding av celletype-spesifikke transkripsjonsfaktorer 7-10. Validering av forutsagte enhancers gjøres oftest gjennom en vektor basert analyse hvor forsterkeren aktiverer ekspresjon av et reportergen 11-12. Disse dataene gir valuable informasjon om regulatoriske potensialet antatte forsterkersekvenser, men ikke avsløre sin funksjon i deres endogene genomisk kontekst eller identifisere genene de regulerer. Genome redigering fungerer som et kraftig verktøy for å studere funksjonen til transkripsjonsregulerende elementer i deres endogene sammenheng med tap-av-funksjon analyse.

Nylige fremskritt innen genom redigering, nemlig CRISPR / Cas9 genom redigering systemet, lette etterforskningen av genomet funksjon. Den CRISPR / Cas9 systemet er enkelt å bruke og kan tilpasses for mange biologiske systemer. Den Cas9 protein er rettet mot et bestemt sted i genomet av en guide RNA (gRNA) 13. Den SpCas9 / gRNA komplekse skanner genomet for sin target genomisk sekvens som må være 5 'til en protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens, NGG 14-15. Base sammenkobling av gRNA til sitt mål, en 20 nukleotid (nt) sekvens komplementær til gRNA, aktiverer SpCas9 nukleaseaktiviteten resulterer i en dobbee tråd pause (DSB) 3 bp oppstrøms for PAM-sekvensen. Spesifisitet oppnås ved fullstendig baseparing i den gRNA frø regionen, 6-12 nt tilstøtende til PAM; omvendt, ikke samsvarer med 5 'av frøet blir vanligvis tolereres 16-17. Den introduserte DSB kan repareres enten ved ikke-homolog ende bli (NHEJ) DNA reparasjon eller homologi rettet reparasjon (HDR) mechanisms.NHEJ DNA-reparasjon ofte skaper innsetting / sletting (indels) av noen bp på målstedet som kan forstyrre den åpne leseramme (ORF) av et gen. For å generere større slettinger i genomet to gRNAs, som flankerer regionen av interesse, kan brukes 18-19. Denne fremgangsmåten er spesielt nyttig for studiet av transkripsjonsforsterkere som smyger seg inn i locus kontrollregioner eller super-forsterkere som er større enn konvensjonelle forsterkere 9,18,20-22.

Monoallelic slettinger er en verdifull modell for å studere cis -regulation av transkripsjon. Den observerte change i transkripsjon nivå etter monoallelic sletting av en forsterker korrelerer til rollen som forsterker i genregulering uten konfunderende effekter som kan oppstå når transkripsjon av begge alleler påvirkes potensielt påvirke celle fitness. Vurderer redusert uttrykk er vanskelig men uten evne til å skille slettet fra villtype-allelet. Videre genotyping slettinger i hvert allel uten evne til å skille de to alleler er krevende, særlig for store delesjoner av> 10 kb til en Mb 23 i hvilken det er vanskelig å forsterke hele villtype-regionen med PCR. Bruken av F1 ES-celler som genereres av krysset Mus musculus 129 med Mus castaneus gjør at to alleler lett å skille allel-spesifikk PCR 18,24. Den hybride genomet i disse cellene letter allel-spesifikk delesjon og ekspresjon screening-analyse. I gjennomsnitt er det en SNP hver 125 bp mellom disse to genomer, Som gir fleksibilitet i primer design for uttrykk og genotyping analyser. Tilstedeværelsen av en SNP kan påvirke tennsatsen smeltetemperaturen (T m) og rettet mot spesifisitet i sanntid kvantitativ PCR (qPCR) amplifikasjon slik at for diskriminering av de to allelene 25. Videre er en mistilpasning i 3'-enden av primeren har stor innvirkning på evnen av DNA-polymerase for å strekke seg fra primeren å forhindre forsterkning av den uønskede allel målet 26. Beskrevet i følgende protokoll er bruk av F1 ES-celler for allel spesifikk forsterkningsslettinger som er større enn 1 kb og påfølgende uttrykk analyse ved hjelp av CRISPR / Cas9 genom redigering systemet (figur 1).

Figur 1
Figur 1. Enhancer sletting bruker CRISPR / Cas9 å studere cis -reggler av genuttrykk. (A) F1 ES-celler som genereres av en krysning mellom Mus musculus 129 og Mus castaneus brukes til å tillate for allel bestemt sletting. (B) To førings RNA (gRNA) blir brukt for å indusere en stor Cas9-mediert sletting av forøker regionen. (C) Primer sett brukes for å identifisere store mono- og bi-allele delesjoner. De oransje primere er inne primere, lilla primere er utenfor primere og de grønne primere blir gRNA flankerer primere. (D) Endringer i genuttrykk overvåkes ved hjelp av allel-spesifikk qPCR. RFU betegner relative fluorescens enheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. designe og konstruere den gRNA

  1. Slik sletter transkripsjons enhancer regioner bruke to gRNAs, en 5 'og en 3 "av regionen av interesse. Bruk musen UCSC genom nettleser spor som genereres av Zhang laboratoriet for å identifisere unike gRNA sekvenser (http://www.genome-engineering.org 15). Neste sjekke disse gRNAs og deres tilstøtende PAM for SNPs og indels bruker elektroniske verktøy levert av Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27-28. For å målrette begge alleler med samme effektivitet, unngå gRNA / PAM sekvenser som inneholder en SNP eller Indel.
    1. Mens velge gRNA, se etter muligheten for å designe allel-spesifikke primere for genotyping slettingen. Se kapittel 5 for allel-spesifikk primer design.
  2. Monter de to gRNA plasmider basert på protokollen beskrevet i Mali et al. 2013 15. Innlemme den valgte unik 20 bp målsekvens into 61mer oligonukleotider som vist i Tabell 7 (sekvenser er vist i 5 'til 3' retning, og uthevet baser er den 20 bp målsekvensen som er reverse komplementer av hverandre).
    1. Bland 10 mL av 10 mm gRNA Primer_F og 10 mL av 10 mm utfyllende Primer_R i et rør.
    2. Anneal primerne ved inkubering av tennblandingen ved 100 ° C i 5 minutter og deretter avkjøles 1 ° C / sek til 25 ° C. For dette trinnet, kan du bruke en PCR maskin eller plassere røret i kokende vann og la det avkjøles til romtemperatur.
    3. Til herdet tennblandingen, tilsett følgende reaksjonsblandingen og inkuber ved 72 ° C i 30 minutter for å forlenge hver primer: 18,5 ul vann, 10 ul 5x HF-buffer, 1 pl 10 mM dNTP mix og 0,5 ul av høy- fidelity DNA-polymerase.
    4. Kjør 10 pl target fragment på en 2% agarosegel for å bekrefte de 100 bp guide fragmenter har blitt produsert.
    5. Linearisere gRNA vektor (en gave fra George Kirken; Addgene plasmid # 41824) 15 med Afl II ved hjelp av følgende reaksjon satt opp: 5 mL av gRNA vektor ryggrad (2-4 mikrogram), 5 pl 10x buffer, 3 pl Afl II (20 enheter / mL) og 32 mikroliter av vann. Inkuber reaksjonsblandingen i 3 timer ved 37 ° C.
    6. Kjør fordøyd produktet på en 1% agarosegel og rense DNA bånd tilsvarende de 3,5 kb lineært gRNA vektor ved hjelp av en gel utvinning kit ved å følge produsentens instruksjoner.
    7. Sett opp Gibson monterings reaksjoner 29-30 ved å bruke lineariserte vektor gRNA og mål-fragment fra trinn 1.2.3 som følger: 1 ul av lineær gRNA vektor (50 ng / ul), 1 ul av mål-fragment, 10 ul av 2x Gibson sammenstilling masterblanding og 8 ul vann. Inkuber reaksjoner ved 50 ° C i 60 min.
  3. Transformasjon av E.coli celler med montert gRNA Vector.
    1. Bland 1 mL av den sammensatte gRNA vektor fra 1.2.7og 50 ul av DH5a (E. coli-stamme) celler i et rør. Transformere DH5a-celler ved varmesjokk metode ved å eksponere cellene til 42 ° C i 45 sek.
    2. Snap avkjøle rørene på is i 5 min; deretter legge til 400 pl av SOC-medium og inkuber ved 37 ° C i 45 minutter i en rysteinkubator.
    3. Spre 100 ul av de DH5a-celler på en LB-kanamycin (50 ug / ml) plate for positiv utvelgelse av transformerte celler og inkuber O / N ved 37 ° C.
  4. Screening Positiv E.coli Colonies for gRNA Sett inn.
    1. Plukke et kanamycin resistent koloni og resuspendere i 3 ml LB inneholdende 50 ug / ml kanamycin. Gjenta det samme for 6-8 kolonier og inkuber alle rør ved 37 ° CO / N i en risteinkubator.
    2. Pakk plasmider fra O / N voksen kultur ved hjelp av plasmid mini prep kit ved å følge produsentens manual.
    3. Forbered en EcoRI fordøyelse reaksjonsblanding for å se etter gRNA sekvens innsatsi plasmidet. For hver prøve fremstille reaksjonsblandingen som følger: 2 ul av enzymbuffer, 1 pl av EcoRI, 15 ul vann. Aliquot av reaksjonsblandingen i 1,5 ml rør og tilsett 2 pl plasmid. Inkuber rørene ved 37 ° C i 2 timer.
    4. Kjør fordøyd produktet på en 1,5% agarosegel.
      Merk: Prøvene med innsats vil vise et 475 bp bandet størrelse som er 100 bp høyere enn kloner uten innsatser.
      Merk: Alternativt kan de positive kloner blir screenet ved en koloni PCR ved anvendelse av Sp6 (fremover) og T7 (revers) primerne (tabell 7) som binder til vektorsekvensen for å gi et 642 bp størrelse fragment i nærvær av et gRNA innsats. Kolonien PCR tilnærmingen er fordelaktig når det er et EcoR I-restriksjonssete innen den gRNA sekvensen.
  5. Bekreft Sekvens av gRNA Sett av DNA Sekvensering Bruke T7 Primer.

2. Transfeksjon

notat:Elektroporering er en effektiv metode for transfeksjon av plasmider inn i ES-celler. Den metode som er beskrevet her anvender microporator transfeksjon teknologi.

  1. Vokse F1 ES-celler i en 10 cm gelatin-belagte Skål inneholdende 10 ml ES celle medium (tabell 1) ved 37 ° C / 5% CO2. Når cellene nå 85% konfluens tar ut mediene, og tilsett 2 ml trypsin. Inkuber ved 37 ° C i CO2-inkubator i 5 min.
    Merk: F1 ES-celler ble hentet fra Barbara panorering 24 og er tilgjengelig på forespørsel.
  2. Nøytralisere trypsin ved tilsetning av 10 ml sentrifuge media (tabell 2). Pipetten flere ganger for å løsne cellene helt.
  3. Samle alle cellene i en 15 ml tube og spinne på 300 xg i 5 min. Resuspendere i 3 ml PBS og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer eller automatisk celleteller.
  4. Pellet 1 x 10 6 ES-celler i et 1,5 ml rør ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter og resuspendert i 100 ul R (resuspensjon) buffer som leveres av kit produsenten.
  5. Tilsett 5 ug hver av pCas9_GFP (en gave fra Kiran Musunuru; Addgene plasmid # 44719) 31, 5 'og 3' gRNA plasmider for sletting av målområdet og bland forsiktig med en pipette for å unngå innføring av bobler.
  6. Bruk elektronisk pipette til å suge 100 ul av elektroporeringsmetoden mix, er forsiktig med å unngå en boble i spissen.
  7. Programmer volt, bredde og pulser for electroporation. For F1 ES-celler, bruker 1400 V, 10 msek for 3 pulser.
  8. Mens elektroporeringsmetoden kjører observere spissen for å se etter eventuelle gnister i løsningen. En gnist indikerer tilstedeværelsen av en luftboble og vil interferere med transfeksjon.
  9. Støte ut de transfekterte ES-celler i en 10 cm gelatin-belagt skål med 10 ml ES-cellemedium (Tabell 1) og inkuber ved 37 ° C / 5% CO2.

3. FACS sortering transfekterte celler

  1. Etter 48 timer, løsne cellene ved tilsetning av 2 ml trypsin og inkuber ved 37 ° C i CO2-inkubator i 5 min.
  2. Nøytralisere platen ved tilsetning av 10 ml av samlingen buffer (tabell 3). Samle cellene i et 15 ml rør og sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter.
  3. Kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml sortering buffer (tabell 4). Telle celler og fortynnet basert på sorteringen plattformen. Fortynn cellene til 0,5-1 x 10 6 celler / ml for sortering i 15 ml rør og for sortering av individuelle celler direkte inn i 96-brønners plater, fortynn cellene til 2-5 x 10 6 celler / ml.
  4. Sorter Cas9-GFP + ES-celler ved hjelp av en FACS flowcytometer 32. Samle celler i bulk i rør med 2 ml gjenopprettingsmediet (tabell 5) og platen som beskrevet i 3.5 for koloni plukking, eller sortere individuelle celler direkte inn i gelatin-belagte 96-brønners plater inneholdende 100 ul ES celle media / brønn (
  5. Seed 1-1,5 x 10 4 GFP + ES-celler i en 10 cm gelatin-belagt skål med 10 ml ES-cellemedium (Tabell 1). Plating på dette lav tetthet vil lette å plukke enkelt ES-cellekolonier.

4. Dyrking Clones for genotyping, Expression analyse og Frysing Cell Stocks

  1. På dag 4-5 etter sortering, score hver brønn av direkte sortert 96-brønners plater for tilstedeværelse av ES-cellekolonier.
    1. Distansere ES-cellekolonier ved å fjerne media og legge 30 mL av trypsin. Inkuber ved 37 ° C i 5 minutter. Nøytralisere trypsin ved å tilsette 170 ul av ES-cellemedium (tabell 1), og pipettere opp og ned for fullstendig dissosiering av kolonien inn i enkeltceller. Grow cellene ved 37 ° C / 5% CO 2 til de fleste brønnene er over 70% sammenflytende (vanligvis 2-3 dager).
  2. Alternativt plukke enkelt ES-cellekolonier fra 10 cm retter ved hjelpet invertert mikroskop. Etter aspirering av kolonien inn i pipettetuppen følger trinn 4.1.1 plassere hver koloni i en brønn av en 96-brønns plate, forbehandlet med gelatin og inneholdende 30 pl av trypsin.
    Merk: Colonies kan sitte i trypsin ved RT mens en hel rad av kolonier er plukket.
  3. Når alle kolonier har blitt plukket og dissosiert i media dyrke cellene ved 37 ° C i CO 2 inkubator før de fleste brønnene er over 70% sammenflytende (vanligvis 2 dager).
  4. Når 96-brønners plater er klare for splitting, fjerne media, tilsett 30 ul trypsin og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter. Nøytralisere den trypsin ved å legge 180 mL av ES celle media (tabell 1) til hver brønn og pipette opp og ned for fullstendig dissosiasjon i enkeltceller.
  5. Fra det resulterende 210 ul, frø 70 ul i tre gelatin belagte 96-brønners plater som hver inneholdt 130 ul av ES-celle media / brønn (tabell 1). Bruk disse platene til genotyping, uttrykk analyse og frysing celle aksjer for hver klon som beskrevet nedenfor.
  6. Når genotyping plate når 70-85% samløpet, behandle platen som beskrevet i kapittel 6 "genotyping slettingen".
  7. Når uttrykket analyse plate når 70-85% samløpet, tar ut mediene, forsegle plate med forseglingstape og oppbevares ved -80 ° C inntil kloner er blitt genotypet.
    Merk: Uttrykket analyse plate er nyttig for å analysere endringer i genuttrykk ved tidlige passasjer av kloner. Genekspresjonsanalyser fra den 96-brønns plate er mulig, men som cellenumrene er lave en RNA-ekstraksjon mikro kit anbefales.
  8. Utarbeidelse av 96-brønns plate Freeze lager:
    1. Når platen for frosne celle bestander (lager-1) når 70-85% konfluens, aspireres media, tilsett 30 ul trypsin og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter.
    2. Nøytralisere trypsin ved å tilsette 100 ul av ES-cellemedium (Tabell 1) to hver brønn og pipette opp og ned for fullstendig dissosiering inn i enkeltceller.
    3. Overføring 15 pl av suspenderte celler fra hver brønn til to gelatin belagte 96-brønners plater, hver inneholdende 185 ul av ES-cellemedium (Tabell 1) og tillater å vokse ved 37 ° C / 5% CO2.
      Merk: Dette er for lager-2 og -3 plater som er ekstra back-up-kloner i tilfelle gjenopplive cellene fra lager-en er ikke vellykket.
  9. I mellomtiden, til 100 ul av de gjenværende celler i 96-brønns plate (stock-1), tilsett 100 ul 2x frysemediet (tabell 6). Tett plate med en tettende bånd og raskt å snu platen opp 4-5 ganger for riktig blanding. Oppbevar platen ved -80 ° C inntil kloner blir genotypet.
  10. Når lager-2 og lager-3 plater er klare for frysing aspireres media, tilsett 30 ul trypsin og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter. Nøytralisere den trypsin ved å legge til 70 mL av ES celle media (Tstand 1) til hver brønn og pipette opp og ned for fullstendig dissosiering inn i enkeltceller.
  11. Tilsett 100 ul av 2x frysemedier, tette plate med skjøtebånd og raskt å snu platen opp ned 4-5 ganger for riktig blanding. Oppbevar platen ved -80 ° C inntil disse platene er nødvendig.

5. Allele spesifikke Primer Design

  1. Design 4 sett med primere (figur 1C) for å skjerme de kloner for ønsket slette: inside primere, utenfor primere, og gRNA flankerer primere (for både 5 'og 3' gRNA målse) som beskrevet nedenfor.
    1. Skaff SNP spor som tilsvarer de 129 og Cast genotyper på http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html. Den oppgitte sporet viser basis erstatninger mellom 129 og Cast på koordinatene i MM9 musen genomet montering.
      Merk: linken ovenfor området vil viderekoble til UCSC genom nettleser og legge til en tilpasset spor som inneholder SNPs mellom 129 og Cast genomes.
    2. Skriv inn koordinatene i regionen som skal slettes. Zoome inn på en region på omtrent 500 bp i midten av den ønskede delesjon inneholdende> 3 SNP'er.
    3. Gå å se> DNA i alternativ og klikk få DNA for å laste målsekvensen i alle store bokstaver format.
    4. Lag to FASTA sekvenser; en for 129 og en for støpning av basesubstitusjon ved SNP stilling. Marker SNPs med små bokstaver.
    5. Gå til Primer3 pluss (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) og lim den SNP byttet 129 sekvens. Bruk standardinnstillingene for å designe primere.
    6. Å designe innsiden allel-spesifikke primere velge Primer_List på oppgave drop-menyen og klikk på Pick Grunning. Velg en forover eller revers primer som har en SNP enten i 3 'enden eller innen 4 baser fra 3' og faller inne i regionen som skal slettes.
      Merk: Primere som har en SNP ved 3'end skjermen økt allel spesifisitet i qPCR.
    7. For å velge den andre primer tilbake til hovedsiden, velger Detection i oppgave drop-menyen og lim den første primer sekvens i den aktuelle boksen nederst på siden. I kategorien Generelle innstillinger endre innstillingen for produktet størrelsesområdet til 80-200 bp og klikk Pick Grunning. Valgte en primer sett fra de børsnoterte primerpar; disse vil være 129 inne allel-spesifikke primere.
    8. Gjenta trinn 5.1.5 til 5.1.7 for å designe primere for Cast allel.
    9. Gå tilbake til UCSC genom nettleser og skriv inn koordinatene i regionen som skal slettes. Gå å se> DNA i alternativ under Sequence Retrieval Region alternativer legge 1000 bp oppstrøms og nedstrøms klikk få DNA for å laste målsekvensen.
    10. Marker gRNA målsekvens i parentes. Lagre hele denne sekvensen før du fortsetter.
    11. Å designe utsiden primere fjerne sekvens mellom de to gRNA målsekvenser. Gjenta trinn 5.1.4-5.1.8 å designe utsiden allel-spesifikk primers men endre den størrelsen 400-800 bp.
    12. Splitte sekvensen oppnådd i trinn 5.1.10 i to sekvenser, hver med 500 bp 5 'og 3' av gRNA målsekvensen. Gjenta trinn 5.1.5 til 5.1.7 designe ikke-allel spesifikke primere for gRNA flankerende områder, men endre den størrelsen 400-800 bp.
      Merk: For ikke-allel spesifikke primere, enten 129 eller felles sekvens kan brukes og primere bør velges som ikke inneholder en SNP. Det anbefales å sette et produkt størrelse på 400-800 bp for å utforme utenfor og gRNA flankerer primere. Dette gjør det mulig for forsterkning, selv om bare en liten indels er til stede.
  2. Test innsiden primere for allelet spesifisitet ved qPCR ved hjelp av ren 129 og Cast belastning genomisk DNA på 2 ng / mL. Følg trinn 06.02 til 06.04 for å sette opp qPCR reaksjon.
    Merk: Hvis 129 genotype i målregionen er den samme som C57BL / 6J, DNA fra C57BL / 6J kan brukes i stedet for 129 DNA. Allel-spesifikke primere skal vise minst 5 sykluserForskjellen mellom Ct (syklus terskel) verdi på riktig vs. feil genotype. Utenfor primere kan bli testet for å sikre at de forsterke den sletting ved hjelp av Cas9 / gRNA transfekterte ES-celler, og F1-genomisk DNA som henholdsvis positive og negative kontroller. Allelet-spesifisiteten av eksterne primere kan testes når monoallelic kloner har blitt identifisert.

6. Genotyping av sletting

  1. Utdrag genomisk DNA fra den genotyping 96-brønners plate ved bruk av plate fra trinn 4.6 som er generert etter koloni ekspansjon.
    1. Klargjør genomisk DNA-ekstraksjon mix: 89 ul vann, 10 ul 10x buffer og 1 mL av Ekstraksjonsreagens (levert av produsenten). Tilsett 100 ul av genomisk DNA-ekstraksjon blanding til hver brønn og forsegle plate med et tettende bånd.
    2. Inkuber platen ved 75 ° C i 5 minutter etterfulgt av 95 ° C i 5 min.
    3. La maskinen kjøles ved inkubering på is i noen få minutter end deretter kort sentrifuger til å avgjøre enhver kondens til bunnen av brønnen. Dette fungerer som templat-DNA plate for sletting screening.
  2. Sett opp qPCR reaksjoner i to eksemplarer for hver klon som følger: 5 ul 2x SYBR qPCR mix, forover og bakover primer (3 mm) hver en fil og 1 ul vann. Bruke en multikanal pipette for å legge til 2 mL av templat-DNA etterfulgt av 8 pl av reaksjonsblanding til hver brønn i en 384-brønners plate.
  3. Tett plate med forseglingstape og spinn ved 600 xg for 2 min for å blande innholdet. Plasser 384-brønners plate matrise i sanntid cycler.
  4. Programmet sanntid cycler for et 2-trinns PCR, etterfulgt av smeltekurve analyse med deteksjon på følgende måte: en syklus ved 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 15 s, 62 ° C i 30 sek med platelese og 95 ° C i 10 s, 65 ° C til 95 ° C med økning på 5 ° C i 5 sekunder + plate lest.
    Merk: I tillegg til primer design, qPCR mix og syklusparametrene bidrar også til primer spesifisitet. Parametrene som er beskrevet ovenfor og reagenser som er oppført i det materiale oftere, hvilket ga allel-spesifikk amplifikasjon.
  5. Analysere qPCR resultater
    1. Sjekk hver allelet for forsterkning med innvendig allel-spesifikke primere. Ingen forsterkning av ett allel eller høy Ct verdiforskjeller (> 5 sykluser) mellom alleler foreslå disse klonene bære en heterozygot sletting av allelet med høy / fraværende Ct verdi. Ingen forsterkning av begge alleler tyder på at de bærer en homozygot delesjon.
    2. Sjekk hver allelet for forsterkning med utenfor allel-spesifikke primere. Når målet slettingen er større enn 1 kb forsterkning med utenfor primere oppstår bare når en sletting er til stede. En Ct verdi på 22-28 bekrefter slettingen. For målet slettinger mindre enn 1 kb, bekrefter amplicon størrelse ved elektroforese.
      Merk: Hvis de eksterne primere viser bare moderat allel-spesifisitet (se Figure 2), kan amplikonene oppnås med begge alleliske primersett i monoallelic klonene på grunn av for høyt amplifikasjon av de eksterne primere. I dette tilfellet er en Ct-verdien forskjell mellom de to alleler av minst fem sykluser bør bekrefte den korrekte allelet (lavere Ct-verdien) blir slettet basert på resultatene oppnådd fra de indre primere. Hvis på målet versus utenfor mål allele Ct forskjellen er mindre enn fem sykluser designe nye allel spesifikke utenfor primere.
    3. I monoallelic delesjonskloner kontrollere integriteten av den ikke-slettede allel ved hjelp av den sekundære screening, gRNA flankerende primere.
      Merk: Indels av> 25 bp størrelse rundt gRNA målområde kan identifiseres ved å observere et skifte i smeltekurve i qPCR for 400-800 bp amplikonene. Alternativt kan de amplikonene fra de gRNA flankerende primere bli sekvensert for å detektere små indels av <25 bp.
      1. Utfør qPCR med 2 sett med gRNA flankerer primere dvs. 5 'og 3' gRNA brukes til å generere CRISPR sletting. Ingen amplifisering med disse settene av primere indikerer indels større enn den qPCR fragment er til stede i gRNA målstedet på den ikke-slettede allel av monoallelic delesjonskloner. Forkast kloner inneholdende disse store indels fra videre analyse som resultatene kan være vanskelige å tolke uten å vite utstrekningen av slettingen.
  6. Rense amplikonene hentet fra utsiden primer qPCR reaksjon ved hjelp av en PCR rydde opp sensoren ved å følge produsentens anvisninger.
  7. Bekrefte sekvensen til den slettede allelet ved DNA-sekvensering av det rensede PCR-produktet fra det foregående trinnet. Bruk qPCR amplifiseirngsprimere for forover og bakover sekvensering.
    Merk: På dette stadiet SNPs innenfor amplicon fungere som en sekundær bekreftelse av genotype av den slettede allel.

7. Analysere Expression med allelet spesifikke primere

  1. Tine 96-brønn celle lager plspiste lagret ved -80 ° C (stock-en fra trinn 4.9) ved å plassere den på en varm perle bad. Når mer enn halvparten av brønnene i platen blir tint, sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter.
  2. Nøye, fjerne forseglingstapen og raskt overføre cellene fra delesjons positive brønner i gelatinbelagt, 12-brønners plater inneholdende 1 ml av ES-cellemedium (tabell 1) og inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2.
  3. Når platen når 70-85% konfluens, passasje cellene og dele dem opp i tre brønner i en gelatin-belagte, 6-brønns plate, hver inneholdende 2 ml ES celle medium (tabell 1). Bruk to brønner for å forberede 2 hetteglass med frosne celle aksjer for langsiktig lagring i flytende nitrogen (beskrevet i trinn 8) og den tredje brønnen for RNA ekstraksjon.
  4. Pakk RNA ved hjelp av et RNA ekstraksjon kit.
  5. Konverter 100-500 ng av RNA til cDNA ved revers transkribere (RT) RNA ved hjelp av cDNA syntese sensoren ved å følge produsentens protokoll. Inkluder en RT negative reaksjon for hver RNA-prøve for å overvåke mengden av forurensende DNA i RNA prøver.
  6. Fortynn cDNA før qPCR i et forhold på mellom 1: 2 og 1: 4; avhengig av ekspresjonsnivået av målgenet i ES-celler.
  7. Still qPCR som beskrevet ovenfor, innbefattende F1 genomisk DNA som standardkurve (5 gangers fortynninger fra 250 til 0,08 ng / mL) for absolutt mengdebestemmelse av transkripsjonsnivåer. Sammenligne ekspresjon av hvert allel av genet av interesse i hvert bekreftet klon slettet til en egnet kontroll genet, for eksempel GAPDH (primere er oppført i tabell 7).
    Merk: Kontroll genet primere trenger ikke å være allel bestemt. Allel-spesifikk primer utformingen er den samme for RT-qPCR primere som beskrevet for genotyping primere med unntak av målområdet for forsterkning. Gensekvensen bør brukes; ved bruk av primere for et enkelt ekson eller et exon-intron grensene (for å overvåke primære transkript) F1 genomisk DNA kan anvendes forstandardkurven. For ytterligere informasjon om RT-qPCR henvises til Forlenza et al. 2012 33.

8. Freeze Stock Forberedelse for langvarig oppbevaring av ES-celler

  1. Tilsett 300 ul av trypsin til hver seks-brønns (fra trinn 7,3) og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. Tilsett 2 ml spin media (tabell 2) for å nøytralisere trypsin og pipette opp og ned flere ganger for å distansere inn enkeltceller.
  2. Overfør cellene inn i et 15 ml rør og sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter.
  3. Aspirer supernatanten og tilsett 500 mL av ES celle media (tabell 1). Pipetter opp og ned for å resuspendere cellene.
  4. Overføre innholdet til et 1,5 ml kryoampulle rør og tilsett 500 mL av 2x ES cell frysing media (tabell 3). Bland godt ved å snu røret og sett røret inn et alkoholfritt celle frysing container. Plasser denne celle frysebeholdere ved -80 ° C i minst 12 timer før transferring inn i en flytende nitrogen-lagringstanken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen er beskrevet her bruker F1 ES-celler til å studere cis -regulation av genuttrykk i monoallelic enhancer slettet celler generert ved hjelp CRISPR / Cas9 genom redigering (figur 1). Den gRNA og allel-spesifikk primer design for genotyping og genekspresjon er de viktigste faktorene i denne tilnærmingen. Hver allel-spesifikk primer sett må valideres av qPCR å bekrefte allel spesifisitet. Allel-spesifikke primere som forsterker bare deres respektive genomisk DNA target er ideelle (figur 2). Ideelt disse primere har en SNP ved deres 3'-ende. Primere med mindre allel-spesifisitet kan anvendes dersom de viser minst en 5 Ct verdi forskjell i deres forsterkning av den korrekte vs. feil genotype 25. Primere som bærer en SNP mer 5 'enn 4 th base fra 3' enden vanligvis ikke klarer å stille allel spesifisitet og forsterke begge genotyper med lik effektivitet,avslørende viktigheten av SNP stilling i primeren 34. I tillegg er en substitusjon purin / purin- eller pyrimidin / pyrimidin har vist seg å ha en større innvirkning på T m differansen av to primere i forhold til et purin / pyrimidin substitusjon 25.

Primær screening av en 96-brønns plate av DNA isolert fra ES-cellekloner er utført med allel-spesifikke inne primere for å identifisere kloner som bærer en delesjon på en eller begge alleler. Disse slettede kloner blir videre undersøkt med utenfor allel-spesifikke primere for å bekrefte hver sletting. Eksempelet her er fra en effektiv gRNA par som resulterte i 46% av kloner som bærer en sletting på 129, Cast, eller begge alleler (figur 3). Sekundær screening er gjort for bekreftede monoallelic sletting kloner for å identifisere indels rundt gRNA målse på ikke-slettede allel som hyppigheten av Indel har funnet sted,het på gRNA målet nettstedet er høy 23. Indels rundt gRNA ikke kan identifiseres i den primære screeningen, idet disse klonene viser ingen sletting med innsiden primere og ikke forsterke med utsiden primere (figur 4). Monoallelic delesjonskloner som gir forsterkning med begge sett av venstre- og høyre gRNA flankerende primere som har sine andre allel i stor grad intakt da de ikke inneholder en delesjon som er større enn den 5 'eller 3' flankerende gRNA amplikoner. Sekvensering amplikonene fra gRNA flankerer primere vil identifisere indels mindre enn gRNA flankerer amplikonene som kanskje ikke er merkbar i qPCR. De monoallelic sletting kloner som ikke gir forsterkning i begge regioner i det sekundære screening er ikke tatt med for ytterligere genekspresjon analyse. Som gRNA målområder er valgt utenfor regionen mistenkt for å ha Enhancer funksjon, indels mindre enn gRNA flankerer amplikonene er ikke sannsynlig å påvirke forsterkningsfunksjon og kloner conholdende disse kan inkluderes i ytterligere analyse.

For å begrense en stor sletting ett allel en gRNA kan velges som overlapper en SNP i frøet region eller PAM. Beskrevet her er et eksempel på en høy effektivitet sletting (53%) på 129 allel på grunn av en SNP i PAM for 3 'gRNA på Cast allelet (figur 5). Denne slettingen fjernet SCR, en nylig beskrevet Sox2 bestemt forsterker i ES-celler 18,22. Selv om innføringen av den store slettingen ble sterkt redusert på Cast allelet ble tre kloner (1, 11, 75) identifisert med en stor sletting på Cast allelet (figur 5). Av disse tre kloner to (1, 11) inneholdt 3 'brytepunkter innenfor 50 bp av den 3' gRNA målregionen. For det tredje klone var vi ikke i stand til å identifisere den 3 'pause punkt og konkluderte med at slettingen var større enn 11 kb 18. Delesjoner med en eller begge avir brytepunkter lokalisert> 100 bp fra enten den 5 'til 3' gRNA målregionen er vanskelige å genotype, utgjør vanligvis 15-30% av alle kloner, og forblir uncharacterized i den primære screening som slettingen ikke er forsterket med utsiden primere.

Når kloner med monoallelic sletting er identifisert de analyseres for allel-spesifikk genekspresjon bruker absolutt kvantifisering av revers transkripsjon qPCR. Genekspresjon fra kloner som bærer en monoallelic delesjon av den kritiske Sox2 enhancer region, SCR, er vist her, sammenlignet med ekspresjon i villtype F1 ES-celler (figur 6). Spesielt kloner bærer et sletting av forøker regionen på 129 allelet viste en nedgang i 129 transkripsjonsnivåer mens kloner som bærer en sletting på Cast allelet viste en nedgang i Cast transkripsjonsnivåer. Allelet spesifikke genuttrykk analyse viste thpå dette distal Enhancer regionen, SCR, er en kritisk cis -regulator av Sox2 i ES-celler 18.

Figur 2
Figur 2. Testing allelet-spesifisitet på 129 og Cast allel-spesifikke primere. (A) Amplification fra primere for 129 genotype. (B) Amplification fra primere for Cast genotype. I både A og B vises linjene forsterkningsprofilene for C57BL / 6 genomisk DNA som har den samme genotype som 129-DNA ved disse spesielle SNPs; linjene med åpne sirkler vise forsterkningsprofiler for Cast genomisk DNA. Amplifisering som følge av primersett med den mest allel-spesifisitet er vist i grønt (Allele-spesifikke primer-1), et primersett som viser en 5 Ct forskjell er vist i purpur (Allele-spesifikke primer-2) og et primersett som viser en minimal forskjell i Ct verdien er represented rødt (Allele-spesifikke primer-3, primer detaljer i tabell 7). Den røde primer sett ville ikke være passende for allel-spesifikk screening. RFU betegner relative fluorescens enheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Resultater oppnås etter screening en 96-brønns plate med allel-spesifikke innenfor og utenfor primere. (A) qPCR resultatene fra skjermen med innsiden primere (Enh_del_IS_F1_129, Enh_del _IS_F1C, Enh_del _IS_R1) B) qPCR resultatene fra skjermen med utvendig primere (Enh_del_OS_F1, Enh del_OS_R1_129, Enh_del_OS_F2C, Enh_del_OS_R3, primer detaljer i tabell 7). I begge grå stolper representerer forsterkning fra Cast-spesifikke primere og svarte stripene representerer forsterkning fra 129 spesifikke prim ers. Legg merke til at bare kloner med en delesjon på ett eller begge alleler er vist med de ytre primere. Den relative forsterkning av hvert allel ble beregnet ved hjelp av to -CT å tilnærme den opprinnelige konsentrasjonen og deretter uttrykke hvert allel som en prosentandel av summen av de to alleler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Kloner med monoallelic sletting blir screenet for å identifisere store indels på gRNA målse. Grunning flankerer gRNA målområder brukes til å bekrefte at den ikke-slettede allel er intakt. Bare monoallelic kloner uten store indels på målse på de ikke-slettede allel er brukt i den påfølgende uttrykk analyse. tp_upload / 53552 / 53552fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Clones hentet fra Sox2 SCR slettingen. Vist er de qPCR resultatene fra en skjerm med innvendig primere (pr111R, pr111F_129, pr111F_Cast, detaljer i tabell 7). Grå stolper representerer forsterkning fra Cast-spesifikke primere og svarte stripene representerer forsterkning fra 129-spesifikke primere. Legg merke til at slettingen er sterkt forskjøvet mot 129 allelet på grunn av tilstedeværelsen av en SNP i PAM av 3'- gRNA målområdet på Cast-allelet. Den relative forsterkning av hvert allel ble beregnet ved anvendelse av 2 -CT til tilnærmet den opprinnelige konsentrasjon, og deretter uttrykke hvert allel som en prosentandel av summen av de to allelene. filer / ftp_upload / 53552 / 53552fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. SCR sletting reduserer dramatisk uttrykk for Sox2. Representative resultater fra 129 eller Cast SCR slettet kloner. Røde søylene representerer uttrykk for Sox2 Cast allel og blå linjen representerer forsterkning av Sox2 129 allelet. Sletting av SCR på 129 allelet redusert uttrykk for Sox2 (129), mens sletting av SCR på Cast allelet redusert uttrykk for Sox2 (Cast). Dataene som vises er et gjennomsnitt av tre tekniske replikater, feilfelt som ikke er vist. Primere som brukes til Sox2 uttrykk analyse [Sox2_F, Sox2 (129) _R, Sox2 (Cast) _R] er oppført i tabell 7.pload / 53552 / 53552fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

reagens Stock konsentrasjon Volum Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP
Glutamax 200 mm 6 ml 2 mm
2-mercaptoethanol 10 mm 6 ml 0,1 mm
MEM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) 10 mm 6 ml 0,1 mm
Sodium Pyruvate 100 mm 6 ml 1 mm
Penicillin / streptomycin 10.000 enheter 3 ml 50 U / ml
FBS 90 ml 15% CHIR99021 * 10 mm 3 mikrometer
PD0325901 * 10 mm 1 mikrometer
LIF * 10 7 enheter / ml 1000 U / ml
# For å forberede ES celle media, legger de ovennevnte komponentene til 500 ml høy glukose DMEM. ES cell media bør ikke lagres i mer enn 4 uker, og med hemmere * ikke mer enn 2 uker.

Tabell 1. ES celle medier.

reagens Stock konsentrasjon Volum Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP
Glutamax 200 mm 5 ml 2 mm
Penicillin / streptomycin 10.000 enheter 5 ml 100 U / ml
FBS 50 ml 10%
# For å forberede Spin media, legger de ovennevnte komponentene til 500 ml høy glukose DMEM.

Tabell 2. Spin media.

reagens Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP Volum (50 ml)
1 x PBS uten Ca / Mg 2+ 42,0 ml
BSA fraksjon V (7,5%) 15% (v / v) 7,5 ml
0,5 M EDTA > 5 mm 0,5 ml

Tabell 3. Collection buffer.

reagens Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP Volum (50 ml)
1x HBSS 47.25 ml
1M HEPES 25 mm 1,25 ml
0,5 M EDTA 5 mm 0,5 ml
BSA fraksjon V (7,5%) 1% (v / v) 0,5 ml
FBS 1% (v / v) 0,5 ml

Tabell 4. Sortering buffer.

måter "> ES-celle media 60% FBS 40%

Tabell 5. Recovery medier.

ES-celle media 60%
FBS 20%
DMSO 20%

Tabell 6. 2x frysemediet.

Tabell 7a
Tabell 7b
Tabell 7. Liste over primere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CRISPR / Cas9 formidlet genom redigering teknologien gir en enkel, rask og billig metode for genom modifikasjon. Metoden beskrevet her for å generere og analysere monoallelic Enhancer sletting for funksjonell Enhancer karakterisering dro fordel av SNPs i F1 museceller. Fordelene med denne typen metode er: 1) monoallelic enhancer delesjoner ikke frembringer samtidig andre virkninger som oppstår når et kritisk enhancer er slettet fra begge allelene, det vil si, en stor reduksjon i protein nivåene av det regulerte genet som fører til celle dødelighet eller endret fenotype; 2) hvis frekvensen av monoallelic sletting er lav skaffe en homozygot delesjon er mindre sannsynlig; imidlertid, ved anvendelse av allel-spesifikke primere i genekspresjonsanalyser kan man analysere kloner med en monoallelic delesjon; 3) ved hjelp av fire sett med primere for å skjerme monoallelic slettinger tillater eliminering av kloner som inneholder delvis eller store strykninger som forvirrenedstrøms analyse.

Allel-spesifikk primer design er avgjørende for genotyping mono / biallelic CRISPR slettinger og analysere effekten på genuttrykk i et allel-spesifikk måte. Dette er lettere oppnås når F1-celler brukes inneholder hyppigere SNPs som tillater diskriminering av de to alleler. Her ES celler generert fra en Mus musculus 129 x Mus castaneus kors brukes; imidlertid, kan andre celler brukes hvis SNP'er mellom de to alleler tillate for allel-spesifikk delesjon screening og uttrykk analyse, og hvis tilstrekkelig data eksisterer for å forutsi regioner aktive forsterker å være rettet i den valgte celletype. Derfor kan denne fremgangsmåte tilpasses til en hvilken som helst cellelinje hvor informasjon om allelisk SNP'er er tilgjengelig. En av begrensningene i protokollen er avhengigheten av SNPs på bestemte steder. Noen målområder bære færre SNPs som gjør utforme allel-spesifikk utenfor primere som forsterker en <800 bp fragment utfordrende. I slike tilfeller er en PCR-metode kan brukes som et alternativ til qPCR screening slik at for et større fragment. I tillegg kan det være SNP tilhørende forskjeller i fenotypen til F1 ES-celler; for å bekrefte funksjonen av bestemte forsterkere i flere genotyper homozygote delesjoner kan bli utført i standard ES linjer. Spesifisiteten av SpCas9 nuklease er et viktig tema både i forhold til potensielle bruksområder i kliniske tilnærminger. Undersøkelse av SpCas9 spesifisitet har vist at både 6-12 nt frø region av gRNA gjenkjenningssekvensen og den tilstøtende PAM er viktige for nukleaseaktivitet 13-14,17. For målet mutasjoner kan bli minimalisert ved å sørge for at frøet regionen og tilstøtende PAM er unike i genomet blir modifisert 14,16.

En monoallelic sletting tilnærmingen som er beskrevet her kombinert med allel spesifikke RNA-seq kan definitivt avsløre genet eller genene regulert av en bestemt enhancer 18. Disse eksperimentene er viktig for forståelse genom funksjon som sletting av enda reporter-analyse validert enhancers ikke alltid påvirke genuttrykket 18. Videre enhancers kan ikke regulere det nærmeste genet i genomet eller kan regulere flere enn ett gen 1,20,35. Som et resultat av dette er tap-av-funksjon-analyse den mest informative tilnærming for å bestemme funksjonen av en enhancer-regionen. Dette kan raskt oppnås ved hjelp CRISPR / Cas9-mediert monoallelic sletting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har lest Jove politikk om interessekonflikt, og det er ingen konflikter å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L
gRNA_Cloning Vector Addgene 41824 A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid
pCas9_GFP Addgene 44719 Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid
AflII NEB R0520S
EcoRI NEB R3101S
Neon Transfection System 100 µL Kit Life Technologies MPK10096 Microporator transfection technology
prepGEM ZyGEM PT10500 genomic DNA extraction reagent
Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
High-Speed Plasmid Mini Kit Geneaid PD300
Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free  Geneaid PME25
SYBR select mix for CFX Life Technologies 4472942 qPCR reagent
iScript cDNA synthesis kit Bio-rad 170-8891 Reverse transcription reagent
0.25% Trypsin with EDTA Life Technologies 25200072
PBS without Ca/Mg2+ Sigma D8537
0.5 M EDTA Bioshop EDT111.500
HBSS Life Technologies 14175095
1 M HEPES Life Technologies 13630080
BSA fraction V (7.5%) Life Technologies 15260037
Max Efficiency DH5α competent cells Invitrogen 18258012
FBS ES cell qualified FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency
DMSO Sigma D2650
Glutamax Invitrogen 35050
DMEM Life Technologies 11960069
Pencillin/Streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360
Non-essential aminoacid Invitrogen 11140
β-mercaptoethanol Sigma M7522
96-well plate Sarstedt 83.3924
Sealing tape Sarstedt 95.1994
CoolCell LX Biocision BCS-405 alcohol-free cell freezing container
CHIR99021 Biovision 1748-5 Inhibitor for F1 ES cell culture
PD0325901 Invivogen inh-pd32 Inhibitor for F1 ES cell culture
LIF Chemicon ESG1107 Inhibitor for F1 ES cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132, (4), 797-803 (2005).
  2. Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. Long-range gene control and genetic disease. Adv Genet. 61, 339-388 (2008).
  3. Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, (7261), 199-205 (2009).
  4. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337, (6099), 1190-1195 (2012).
  5. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459, (7243), 108-112 (2009).
  6. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature. 488, (7409), 116-120 (2012).
  7. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316, (5830), 1497-1502 (2007).
  8. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, (6), 1408-1419 (2011).
  9. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153, (2), 307-319 (2013).
  10. Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics. 13, (1), 152 (2012).
  11. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30, (3), 265-270 (2012).
  12. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nat Biotechnol. 30, (3), 271-277 (2012).
  13. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, (6096), 816-821 (2012).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  15. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, (6121), 823-826 (2013).
  16. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, (9), 827-832 (2013).
  17. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24, (1), 132-141 (2014).
  18. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, (24), 2699-2711 (2014).
  19. Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease. Nucleic Acids Res. 41, (20), e187 (2013).
  20. Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, (8), 2554-2558 (1989).
  21. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Dev Cell. 16, (1), 47-57 (2009).
  22. Li, Y., et al. CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 9, (12), e114485 (2014).
  23. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J Biol Chem. 289, (31), 21312-21324 (2014).
  24. Mlynarczyk-Evans, S., et al. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation. PLoS Biol. 4, (6), e159 (2006).
  25. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59, (10), 1470-1480 (2013).
  26. Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 20, (17), 4567-4573 (1992).
  27. Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477, (7364), 289-294 (2011).
  28. Yalcin, B., et al. Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome. Nature. 477, (7364), 326-329 (2011).
  29. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  30. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7, (11), 901-903 (2010).
  31. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12, (4), 393-394 (2013).
  32. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  33. Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).
  34. Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension. J Microbiol Methods. 77, (3), 267-275 (2009).
  35. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489, (7414), 109-113 (2012).
Generering CRISPR / Cas9 mediert Monoallelic Slett å studere Enhancer funksjon i mus embryonale stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moorthy, S. D., Mitchell, J. A. Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (110), e53552, doi:10.3791/53552 (2016).More

Moorthy, S. D., Mitchell, J. A. Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (110), e53552, doi:10.3791/53552 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter