Summary
Nuværende ex vivo modeller af glioblastom (GBM) er ikke optimeret til fysiologisk relevant undersøgelse af humant tumorinvasion. Her præsenterer vi en protokol til generering og vedligeholdelse af organotypiske skivekulturer fra frisk human GBM væv. En beskrivelse af time-lapse mikroskopi og kvantitative celle migrationsanalyse teknikker er tilvejebragt.
Abstract
Glioblastom (GBM) har fortsat en ekstremt dårlig klinisk prognose på trods af kirurgisk, kemoterapeutisk og strålebehandling. Progressiv tumorinvasion i omgivende hjerneparenchyma repræsenterer en varig terapeutisk udfordring. For at udvikle anti-migrationsterapier til GBM er det nødvendigt med modelsystemer, der giver en fysiologisk relevant baggrund for kontrolleret forsøg. Her præsenterer vi en protokol til generering af skivekulturer fra humant GBM væv opnået under kirurgisk resektion. Disse kulturer tillader ex vivo- eksperimentering uden passage gennem dyre-xenografter eller enkeltcellekulturer. Desuden beskriver vi brugen af time-lapse laser scanning konfokal mikroskopi i forbindelse med cellesporing for kvantitativt at studere tumorcellernes tilknyttede adfærd og tilhørende respons på terapeutik. Skiverne produceres reproducerbart inden for 90 minutter af kirurgisk vævsopkøb. Retroviralt medieret fluorescerende celle laBeling, konfokal billeddannelse og tumorcelle migrationsanalyser udføres efterfølgende inden for to ugers kultur. Vi har med succes brugt disse skivekulturer til at afdække genetiske faktorer i forbindelse med øget migrerende adfærd i human GBM. Desuden har vi valideret modelens evne til at detektere patientspecifik variation som svar på anti-migrationsbehandling. Flytning fremad er humane GBM skivekulturer en attraktiv platform til hurtig ex vivo vurdering af tumorfølsomhed over for terapeutiske midler for at fremme personlig neuro-onkologisk terapi.
Introduction
Laboratorieundersøgelsen af glioblastom (GBM) hindres af mangel på modeller, som trofast rekapitulerer de krævede patologiske karakteristika ved den menneskelige sygdom, nemlig tumorcellemigration og invasion. Sammenligningsundersøgelser af 2D- og 3D in vitro- invasionstest samt 3D-gnavere af slagtekulturer har afdækket mekanisk forskelligartede cellulære migrationsprogrammer i disse to sammenhænge, der potentielt begrænser translatabiliteten af fund fra 2D-systemer til den humane sygdom 1 , 2 , 3 . Det organotype tumorskivekultur- og billeddannelsesparadigm, der beskrives her, tillader undersøgelse af tumorcellemigration inden for skiver af humant tumorvæv ex vivo opnået fra kirurgisk resektion. Således tilvejebringer skivekulturer af kirurgisk resekteret tumorvæv i forbindelse med time-lapse-konfokalmikroskopi en platform til at studere tumorcelle-migration i den nativeMikro-miljø uden vævsopløsning eller kulturpassage.
Der er omfattende litteratur, der anvender gnavere hjerneskivekulturmodeller af GBM genereret fra humane tumor-xenotransplantater, retrovirale inducerede tumorer og cellulære overlejringer til undersøgelse af tumorinvasion 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . For nylig har flere grupper beskrevet genereringen af organotypiske skivekulturer direkte fra humant GBM væv 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Der er imidlertid markant variation blandt offentliggjorte protokoller med hensyn til udskæringsteknik og kulturmedier. Endvidere har anvendelsen af organotypiske skivekulturer fokuseret på statiske eksperimentelle endepunkter, der har medtaget ændringer i celle signalerNg, proliferation og død. Protokollen beskrevet heri udvider på tidligere skivekulturparadigmer ved at inkorporere tidsopløst observation af dynamisk tumorcelleadfærd ved hjælp af time-lapse laser scanning-konfokal mikroskopi. Nylig opdagelse af inter 11 og intratumoral 12 , 13 genetisk variation i humant GBM understreger vigtigheden af at forbinde denne heterogenitet med tumorcelleadfærd og dens implikationer på tumorrespons til terapi. Her rapporterer vi en strømlinet og reproducerbar protokol til brug af direkte skivekulturer fra et humant cancervæv til at visualisere tumorcelleindvandring i nær real-time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Inden indsamling af patientvævsprøver indledes, skal informeret samtykke indhentes fra hver patient under en godkendt Institutional Review Board (IRB) protokol. Forfatterne af denne protokol modtog samtykke til det arbejde, der er beskrevet under godkendte IRB-protokoller ved University of Colorado Hospital og Inova Fairfax Hospital. Data indsamlet fra disse skivekulturer blev ikke brugt til at styre patientbehandlingsbeslutninger.
1. Forskæring Fremstilling
- Forbered "tissue processing" medier og "slice culture maintenance" medier dagen før planlagt tumor resektion og vævsopsamling (eller udnytte tidligere genererede medier inden for 2 uger). Tilsæt 5 ml penicillin-streptomycinopløsning (10.000 U / ml) og 5 ml 1 M HEPES til 500 ml af en High-Glucose DMEM til dannelse af vævsbehandlingsmediet.
- Forbered 250 ml skivekulturvedligeholdelsesmedier under anvendelse af en base af neuronalt medium ( fx Neurobasal) witHout phenol rød. Suppler dette medium med 10 mM HEPES, 1x B-27 supplement, 400 μM L-glutamin, 600 μM L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 60 U / ml penicillin, 60 μg / ml streptomycin og 6 U / ml nystatin.
- Opbevar alle medier ved 4 ° C i højst 2 uger.
2. Kirurgi: Vævskøb
- På dagen for vævsopkøb skal 50-100 ml 1% og 2% (vægt / vol%) opløsninger af agarose med lav smeltetemperatur fremstilles i vævsbehandlingsmedier under anvendelse af autoklaveret glas og steril teknik i en laminær strømningshætte. Begge koncentrationer af agarose er nødvendige for at imødekomme uforudsigelig variation i tumorvævskonsistens.
- Opvarm agarosesuspensionen ved hjælp af en mikrobølgeovn, indtil der mærkes forsigtig kogning. Anbring agaroseopløsningen i et 37 ° C vandbad for at opretholde i flydende tilstand indtil brug.
- Placer 1 ml skivekulturvedligeholdelsesmedier i hver brønd i en 6-brønds plade.
- Brug en sterilTænger til at placere tomme PTFE kulturindsatser i hver brønd. Pladen anbringes i en fugtig, med vandkappe, vævsdyrkningsinkubator med en 5% CO2-atmosfære holdt ved 37 ° C.
- Anvendelse af en steril Pasteur-pipette i en laminær strømning, boble en blanding af 95% O2 / 5% CO2 gas i en kolbe indeholdende iskold vævsbehandling medier til ca. 15 til 30 min, før købet tumorvæv. Anvendelsen af supra-oxygenerede medier minimerer hypoxi i bulkvævet under behandlingen.
- Klargør mærkede 50 ml koniske rør (nok til ønsket antal individuelle tumorområder, der skal isoleres) indeholdende 20 ml alikvoter af sukkeroxiderede iskoldbehandlingsmedier til transportvæv mellem operationsrummet og skæreanlægget.
- I forbindelse med en neurosurgeon planlægger tumorområdet regionalt for prøveopkøb. Vælg et tumorområde med kontrastforøgelse som vist på patientens kliniske forestillingG (T1 efter-gadolinium magnetisk resonansbilleddannelses (MRI) sekvenser). Tidligere erfaringer tyder på, at dette område giver levedygtigt tumorvæv i modsætning til nekrotisk væv.
BEMÆRK: Generering af skiver fra det omgivende (peritumorale) hvide stof blev forsøgt; Imidlertid begrænsede baggrundsautofluorescens og nedsat tumorcelletæthed den eksperimentelle anvendelighed af disse skiver. - Hent tumorvæv mod begyndelsen af tumorresektion. Undgå indsamling af tumorvæv udsat for omfattende bipolar cautery, hvilket kan kompromittere vævsledbarhed sekundært til termisk skade. Vævsprøver erhvervet under stykkevis tumorresektion demonstrerer forbedret levedygtighed sammenlignet med væv erhvervet fra langvarig en bloc resektioner. Denne observation kan relateres til differentiel tumorvæv-deprivation af blodgennemstrømning som følge af kirurgisk resektion og forlænget tid til erhvervelse.
- Hvis det ønskes, mærke og opbevar tumorvæv i separate koniske rør for at isolere prøverFra forskellige tumorområder. ( Dvs. overfladisk mod dyb tumorvæv). Præcise vævssteder kan registreres, hvis / når intraoperativ kirurgisk navigation er tilgængelig.
3. Slice Culture Preparation
BEMÆRK: Denne protokol kræver anvendelse af frisk ublandet humant væv. Alle prøver antages at være smitsomme og bør håndteres i henhold til universelle blodbårne patogenprotokoller. Passende personlige værnemidler bør altid være forsynet med. Tænger og skalpeller bør udsættes for 15 min UV-lys før brug. Sprøjt værktøjet med 70% ethanol (EtOH) i brug, hvilket giver mulighed for at fordampe væsken før brug. Skæreprocessen udføres på en halv-steril måde ved anvendelse af en vandret laminær strømningshætte med filtreret luft.
- Placer tumorvævstykker i en petriskål med iskold behandlingsmedium. At vaske tumorvævet og minimere vedhængende røde blodlegemer, osEa pipette til forsigtigt at udskifte og kassere medierne i petriskålen tre gange.
- Brug en skalpel, skære tumorstykker i rektangulære boksformer. Trim vævsstykker til ca. 3 mm x 3 mm x 10 mm. Fjern forsigtigt eventuelle vedlagte skibe gennem excision eller blid trækkraft med fine tang.
- Pipette 5 - 7 ml 37 ° C agarose i en lille terningformet (~ 2 cm 3 ) plastindlejringsform. Bekræft temperaturen på agaroseopløsningen er ikke større end 37 ° C med et sterilt termometer før brug.
- Lad agarose sidde i ca. 1 min på en isbede.
- Placer 2 - 4 tumorvæv "strimler" i agarose med lang akse orienteret lodret.
BEMÆRK: Vævstrimler har tendens til at "synke" i agarosen før størkning. For at undgå denne komplikation skal du midlertidigt holde vævsstrimlen i lodret retning, indtil agarose er yderligere størknet. - Hold det vævsholdige agaroseskimmel på en isbede i 2 - 5 miN for at lette størkning.
- Fjern skimmel fra is og fjern forsigtigt agaroseblokken ved at skære siderne af formen med en skalpel. Undgå at placere overdreven kraft på blokken, hvilket kan bryde agarosen.
- Brug en generøs dråbe cyanoacrylatlim til at sætte agaroseblokken på vibratomeprojektionspladen. Lad lim indstilles i ca. 1 - 2 min.
- Fyld vibratomreservoiret med iskoldt behandlingsmedium for at nedsænke agaroseblokken fastgjort til prøvepladen.
- Bubbles 95% O 2 /5% CO 2 gasblanding i vibratomreservoiret under snittet gennem en trimmet steril plastpipette.
- Sæt vibratomskive tykkelsen til 300 - 350 μm.
- Juster bladets fremdriftshastighed og bladamplitude i overensstemmelse med vævskonsistens. "Stykker" GBM væv kræver langsommere bladhastighed og højere amplitude. Nøjagtige bladhastighed og amplitudeindstillinger varierer alt efter vibratome specifikationer.
- Overfør vævsskiver til petriskål med iskold forarbejdningsmateriale ved brug af en mikrospatel i rustfrit stål.
- Hent 6 brøndsplader med PTFE indsatser og ækvilibrerede skivekulturmedier fra inkubator (som fremstillet i afsnit 2, trin 4).
- Pladeservietskiver med en mikrospatel i rustfrit stål. Minimere direkte kontakt og manipulation af væv ved at bruge en lille fin børstepensel til at generere en "fluidbølge" for forsigtigt at skubbe skiven ud af spatelen aNd på kulturindsatsen.
BEMÆRK: Minimer mængden af behandlingsmedier indført oven på vævskulturindsatsen. Hvis der overføres store mængder medier, der får skiverne til at flyde, skal du bruge en steril Pasteur pipette til at fjerne medier. - Returnere 6-brønds plader indeholdende tumor skiver til en inkubator holdt ved 37 ° C med en 5% CO2-atmosfære.
BEMÆRK: Hele indlejrings- og skæreprotokollen skal udfyldes inden for 90 minutter af tumorvævsopkøb fra operationsstuen.
4. Skive Kultur Vedligeholdelse
- Efter 12 - 24 timer overføres skivekulturerne ved at gribe hver indsatsfælge med sterile tang og overføre til plader indeholdende friske skivekulturvedligeholdelsesmedier. Sørg for, at skivekulturvedligeholdelsesmediet alikvoteret i hver brønd ækvilibrer i inkubatoren i mindst 15 min før overførsel af indsatser.
- Flyt indsatser til nye 6-brøndsplader med frisk ækvilibreret skiveTure medier hver 48 timer.
- Om ønsket, alikvot gammelt skivekulturmedium med en pipette til øjeblikkelig anvendelse i biokemiske analyser ( dvs. ELISA) eller frys ved -80 ° C til senere brug.
5. Tumorcelle-mærkning via grønt fluorescensprotein, der udtrykker retrovirus
BEMÆRK: Time-lapse-mikroskopi til analyse af tumorcellemigration kræver stabil, langsigtet fluorescensmærkning af celler inden for skivekulturen. Anvendelse af retrovirus foreslås, fordi det selektivt inficerer delende celler, hvorved berigende fluorescerende mærkning i tumorcellepopulationen i modsætning til microglia eller andre celletyper, der er til stede inden for skiven, er beriget. Standardisering af infektion antyder, at en viraltiter af 10 4 CFU'er / μL resulterer i tilstrækkelig grøn fluorescerende proteinekspression til sporing og analyse af celle-migration. Øget viral titer, anvendelse af ikke-selektiv virus ( dvs. adenovirus, lentivirus) eller otHendes middel til mærkning af alle celler kan udelukke identifikation af klare cellegrænser under migration, hvilket således komplicerer analyse. Brug af alternative fluorescerende markører kan udnyttes og optimeres efter behov.
- Hent retrovirus til infektion af tumorskiver enten via standardprotokoller 5 , 14 eller fra en kommercielt tilgængelig kilde. Fortynd den virale supernatant ved at tilsætte det passende volumen til usupplementeret neuronalt medium for at opnå en viraltiter på 10 4 CFU'er / μL.
- Mellem 7 - 10 dages kultur inficerer tumorskivekulturer af interesse med 5 - 10 μL virus (10 4 CFU'er / μL). Placer virussen forsigtigt dropwise på overfladen af hver vævsskive. Reducer supernatantvolumen tilsat, hvis skiven flyder på indsatsens overflade. Returplader indeholdende skivekulturer til inkubator.
- Vurder skiverne for mærkede tumorceller, der starter 24 timer efter Viral infektion (se afsnit 6). Denne tidsforsinkelse vil variere afhængig af viral inkorporering og fluorescensgenekspressionskinetik. For de her anvendte virale konstruktioner var 72 h påkrævet for at observere robust fluorescerende signal med et standard epifluorescensmikroskop.
BEMÆRK: Skærer viser sjældent en overordnet perifer fordeling af viralt mærket celler, som kan komplicere konfokal billeddannelse. For at undgå denne komplikation skal du forsøge at reducere skive tykkelse og tykkelse variation over skiven. Hvis skivekulturen har en tykkere region nær centrum, kan dette forhindre tilstrækkelig næringsindtrængning og dermed begrænse befolkningen i aktivt at dele tumorceller. Et kvalitativt assay til screening for denne komplikation er tilsætningen af et tetrazoliumfarvestofreagens ( dvs. MTT) til skivekulturmediet. Områder af skiven, der ikke bliver blå efter tilsætning af reagenset, indikerer mangel på metabolisk aktivitet og kompromitteret skivehelse.
BEMÆRK: Efter vellykket transduktion og helbred af kulturen er bekræftet, kan celler afbildes under kontrolbetingelser efterfulgt af en ligevægtig billeddannelse under behandlingsbetingelser. Ved hjælp af denne protokol blev cellerne succesfuldt billedet og sporet i 12 timer i hver tilstand. Imidlertid kan kortere eller længere perioder med billedbehandling og miljømanipulation også være informativ.
- Ilægning af mikroskop
- Før billeddannelse skal du placere 1 ml friske skiver i en glasbunds skål.
- Lad medierne i glasbundens skål equilibrere i en inkubator i 15 minutter.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan opløselige mærkningsmidler, såsom fluorescenskonjugerede lectiner ( dvs. isolectin IB 4 til microglia-mærkning) eller ligandkonjugerede kvantepunkter tilsættes til skivekulturmediet til identifikation af celleUlar subpopulations under billeddannelse. - Overfør indsatsen, der skal afbildes til en glasbunds skål ved hjælp af sterile pincet i en laminær flowhætte. Transport skålen til mikroskopfasen.
- Opretholde skive kulturer ved 37 ° C og 5% CO2-atmosfære i en forseglet mikroskopobjektbord-top inkubator. Udnytte sterilt H2O befugtning af rugekammeret hvis tilgængelig til at forhindre overdreven medier fordampning (især vigtigt for længere billeddannelse eksperimenter).
- Brug et konfokalmikroskop med lang arbejdsstørrelse 10X luftmål og laser excitation til single-foton og / eller multi-foton.
BEMÆRK: Sørg for, at objektivet til mikroskopets objektiv giver en passende arbejdsafstand. Som et resultat af den ekstra højde fra stage-top-inkubatoren er glasbundsskålen og vævskulturindsatsen, lange arbejdsafstandsmål kritiske. - Fastgør glasbundpladen, fjern plastikdækslet, og dæksel med en gas-Permeabel membran.
- Billedforsamling
- Brug mikroskopet til visuelt at inspicere skiven og find et passende felt med tilstrækkelig tæthed af fluorescensmærkede tumorceller mellem skivekanten og midten. Undgå billedfelt ved kanten af skiven på grund af øget modtagelighed af vævsskift under billeddannelsen. Vævskiveharpe kan anvendes til at begrænse dette skift.
- Brug billedbehandling software i multidimensionel analyse tilstand til at indstille de første (nederste) og sidste (øverste) Z-stack grænser, således at alle positioner, der skal billedbehandles, indeholder synligt fluorescerende celle signal. Billeddannelse gennem 150 - 200 μm af skiven, med en konstant Z-trin på 10 μm, gav passende opløsning til sporing af celleveje (dette kan tilpasses individuelle billedbehov).
- Hvis mikroskopet har et motoriseret trin, skal der sikres, at der er tilstrækkelig tid til hver Z-stack-opkøb. Indstil tidsintervallet mellem opkøb til ligeScanningstid pr. Position x antal positioner til billede ( dvs. afbildede tumorområder).
BEMÆRK: Ved samtidig excitering af de grønne og røde fluoroforer udnytter du et dobbeltlinjet laserlinje-scanningsprogram med samtidig 488 nm og 633 nm excitation. Bølgelængden af den valgte laser excitation vil variere i overensstemmelse med individuelle fluorescerende proteiner udtrykt. - Opretholde ensartet laserkraft og konfokale pinholeindstillinger mellem de afbildede tumorområder. Udnyt den laveste laserkraftsindstilling, der er nødvendig for at tydelig afgrænse tumorcellerne og processerne for at begrænse fototoksicitet. Specifikke billedparameterenheder ( dvs. strøm- og konfokale pinhole-indstillinger) varierer alt efter specifikationerne for mikroskop og laser.
- Kompensere for potentielle medier fordampning ved at tilføje 2 - 3 "buffer" Z-stack trin i fokalplanerne fremad mod målet. Dette forhindrer effektivt vævet i at forlade rækkevidden af Z-stack-opkøbIoner i lodret plan.
7. Image Post-Processing og Tumor Cell Tracking
BEMÆRK: Mange konfokale billedbehandlingssystemer er udstyret med proprietær billedbehandlingssoftware. De behandlingsstrin, der diskuteres nedenfor, omfatter en generel protokol, som kan udføres på tværs af softwareplatforme. Specifikke instruktioner vil blive givet til open-source platforme, NIH ImageJ og MTrackJ 15 .
- Åbn en Z-stack-fil. I ImageJ skal du klikke på "Image → Stacks → Z Project." Vælg den første og sidste Z-stack til at inkludere, og vælg "Max Intensity" som projektionstype. Resultatet er en gengivelse kaldet maksimalintensiv fremskrivning (MIP). Opret en MIP fra hvert sæt af Z-stack-billeder, der er fanget i hver afbildet region.
- Sammenkoble MIP'erne fra hver region for at oprette en tidsserie. Klik på "Image → Stacks → Images to Stack."
- Manuelt identificere placeringenAf cellelegemet "centroid" ved at vælge det visuelt tilnærmede centrumpunkt af tumorcellekroppen. Dette opnås ved at klikke på cellekroppen ved hjælp af "add" -sporfunktionaliteten af MTrackJ (en open-source plugin-in til NIH ImageJ).
- Klik for at afgrænse placeringen af cellekroppen i hver ramme af serie af billeder. Dette skaber et unikt "spor" for hver celle. Marker efterfølgende cellepositionerne i den næste celle. Gentag denne proces, indtil alle celleoverførselsstier spores.
- Når en population af celler er sporet i en given tumor mikro region, eksportere alle celle spor koordinater ved hjælp af "measure" funktionen af MTrackJ. Gem filen som et .xls-format, så de rå data kan analyseres ved hjælp af regneark eller brugergenereret software.
- Brug de koordinater, der er optaget for hvert punkt langs en celle migrationsspor, til at udføre kvantitative analyser, herunder afledning af migrationshastighed, retningsretning og anden migrationMetrics, som beskrevet i Parker et al. 16 .
BEMÆRK: Alle beregnede afstande og hastigheder er undervurderinger af faktiske værdier. Dette er iboende ved omdannelsen af tredimensionale billeder (og migrationsstier) til todimensionale data ved generering af maksimale intensitetsfremskrivninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores gruppe har med succes genereret skivekulturer fra over 50 patienter under igangværende GBM resektion. Denne skive generation, kultur, retroviral-mærkning, billeddannelses- og migrationsanalyseprotokol er blevet strømlinet i en reproducerbar arbejdsgang ( figur 1 ). Kritisk viser disse organotypiske GBM-skiver overensstemmelse med det oprindelige tumorvæv gennem hele kulturen, herunder vedligeholdelse af patologiske kendetegn og mikroglia op til 15 dage i kultur ( figur 2 ). Derudover har vi udnyttet dette system til at udføre funktionelle analyser af tumorrespons til mikro-miljømæssige ændringer. Som en måling af fysiologisk integritet, vi undersøgt, hvordan GBM skivekulturer reagerede på hypoxi (1% O2) ved måling af produktion af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), en proces, der forekommer rigeligt inden for GBM mikromiljø in vivo 17,"> 18. Vi viste, at skiverne ved at placere skivekulturerne i hypoxiske forhold monterede et hurtigt fysiologisk respons, hvilket inducerede VEGF-frigivelse i medierne ( figur 3 ).
For at evaluere kvalitative og kvantitative aspekter af tumorcellemigrering anvendte vi tid-lapse-billederne til at generere detaljerede migrationskort. Disse kort afgrænser alle GBM-celler, der spores inden for rammerne af tumormikroregioner (1 mm 2 ), hvilket giver en statisk visualisering af tumorpopulationens dynamiske migrationsadfærd. Kvantitative målinger af migrationshastighed og retningsretning (celleforskydning / total distance tilbagelagt) blev beregnet for hver celle, hvilket muliggør undersøgelse af ændringer i migrationsparametre over tumorområder, tumorprøver og som svar på behandling ( figur 4 ).
Celle mærkning og billeddannelsesprotokol desBeskrevet her tilvejebringer også tilstrækkelig rumlig og tidsmæssig opløsning til at evaluere ændringer i cellemorfologi under migration gennem det native tumormikromiljø. Vi observerede tilstedeværelsen af morfologisk særskilte motile tumorceller og mikroglial blandet i skivekulturen ( Figur 5A ). Tumorcellebevægelsen blev kendetegnet ved en "søgning og sprængning" -proces, som involverede gentagne fremspring og tilbagetrækning af filopodier fra en statisk celle efterfulgt af en kort periode med effektiv bevægelse. Imaging skive regioner ca. hver 10 min gav også en passende tidsmæssig opløsning til optagelse af tidsforskydning billeder af tumorceller undergår celledeling. Disse delende celler blev standset fra migration, afsluttet mitose, og dattercellerne genoptaget migrering uden forsinkelse, alt inden for en 3-timers tidsramme ( Figur 5D ). I modsætning hertil migrerer microglia med en højere og mere konsekvent hastighed med lavere retning end hosliggende tumorceller,Demonstrerer deres relativt ineffektive migration ( figur 5C, 5E-G ). Sådanne observationer kan være vigtige for at få indsigt i de biologiske underliggende patient- eller celle-specifikke reaktioner på behandlingen.
Endelig anvendte vi denne protokol til at demonstrere patient-til-patient variabilitet i celleindvandringsparametre på populationsniveauet, herunder en korrelation af epidermal vækstfaktorreceptor ( EGFR ) genomisk amplifikation med forstærket migrerende potentiale hos tumorceller 16 . Derudover viste tidsfaldsmikroskopi af tumorskiver før og efter behandling med det antiinvasive lægemiddel, gefitinib, en signifikant reduktion i migration, hvilket var specifikt for EGFR- amplificerede tumorskiver 16 .
Figur 1: Human GBM Organotypic Slice Kultur Infektion, Imaging og Cell Migration Analysis Workflow. Tumorvæv er lokaliseret til en specifik region via intraoperativt navigationsudstyr. En uge efter udskæring sættes det ZsGreen-udtrykkende retrovirus til skivekulturerne for at mærke de mitotisk aktive tumorceller. 3 dage efter infektion fremstilles skiver til konfokal billeddannelse. 3D-billeddannelsesdataene efterbehandles til 2D-billeder til sporing af celleoverførselsspor, generering af tumorcellemigrationskort og beregning af tumorcelleindvandringsparametre. Dele af denne figur blev oprindeligt offentliggjort i Parker et al. , 2013 16 og gengivet med tilladelse fra Oxford University Press. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Humane GBM organotypiske skiver bevarer histologiske egenskaber gennem Ex Vivo- kultur. ( A ) T1-kontrastforstærkede MRI-sekvenser blev brugt til at lokalisere og dokumentere regionen (er) af vævsopsamling (pil). ( B ) H & E-farvning af initialt donorvæv (OR) og skiver på dag 8 af dyrkning fra en skivekultur frembragt fra væv opnået fra regionen fremhævet i A. ( C ) Mikro-miljømæssige patologiske og cellulære træk af GBM in vivo opretholdes I hele skive kultur. (I, II) Immunohistokemi for CD68, en mikroglia / makrofagmarkør ved lav (top) og høj (bund) forstørrelse demonstrerer mikroglial persistens i skiver efter 15 dages dyrkning. H & E-farvning på dag 4 af skivekulturen bekræfter vedligeholdelse af pseudopalliserende nekrose, en patoLogisk kendetegn for GBM, både ved lav (iii) og høj (iv) forstørrelse. Skalestænger = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Human GBM Slice Cultures Sekretér VEGF som reaktion på hypoxi. ( A ) Forsøget anvendte individuelle dyrkningsindsatser indeholdende 3 lignende størrelsesstykker af skiver dannet fra samme tumorregion. Skiverne blev opretholdt i normoxi i 12 timer efterfulgt af to 12 h intervaller med hypoxi, med nye medier tilsat før hvert interval. ( B ) VEGF-sekretion i medierne målt ved ELISA (gennemsnit ± standardafvigelse) fra skivekulturer genereret fra to repræsentative tumorer blev signifikant forøget unDer hypoxi end normoxi (p <0,05). ( C ) En samlet analyse af skivekulturer fra 4 forskellige tumorer viste øget VEGF-sekretion efter sekventielle 12 h intervaller af hypoxi sammenlignet med normoxi (p <0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tumor Cell Path Track Data tillader kvantitativ bestemmelse af cellehastighed og retning. ( A ) Tumorceller med en retningsretning på 1 repræsenterer perfekt effektivitet langs en lige vektor, hvorimod de med lavere retning indgriber i ineffektive meanderingsveje, som repræsenteret i denne skematiske 16 . Genoptrykt med tilladelse fra Oxford UniversityTrykke. ( B ) Analyse af repræsentative bane spor data ("lav" opløsning ~ 55 min celle sporingsintervaller) demonstrerer mobil variabilitet i hastighed og retning. ( C ) Directionality versus migrationshastighed for hvert cellespor er tegnet for at visualisere migrationsadfærd på tværs af cellepopulationen (hver prik repræsenterer en individuel celle). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Microglia inden for GBM Slice Cultures er karakteriseret ved høj migrationshastighed og lav retningsdygtighed i forhold til tumorceller. ( A ) Replikerende tumorceller selektivt ekspression af ZsGreen retrovirus og microglia mærket med en isolectin-I B 4 -647 konjugat eksisterer blandet i en repræsentativ tumormikroregion fra en repræsentativ skivekultur. ( BC ) Stierne af individuelt sporet GBM ( B ) og microglia ( C ) i samme tumormikroregion viser uoverensstemmende migrationsadfærd. Skalestænger = 200 μm. ( D ) En aktivt migrerende tumorcelle pauser, trækker sine processer tilbage (arrowhead), undergår celledeling, og to datterceller migrerer væk i modsatte retninger (pile). Skalestænger = 50 μm. ( E og F ) Microglia viser øget migrationshastighed (p <0,0001) og nedsat retningsstyrke (p <0,0001) sammenlignet med tumorceller i samme region. (G) Fordelingen af tumor og mikroglialceller baseret på hastighed og retningsevne demonstrerer de unikke migrationsfænotyper af de to cellepopulationer.Et = "_ blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organotypiske skivekulturer fra humant kræftvæv giver en attraktiv og underudnyttet platform til præklinisk translationel eksperimentering. Forståelse af befolkningsniveauadfærd hos tumorceller med hensyn til migration, proliferation og celledød i det naturlige tumormikromiljø mangler. Kritisk kan undersøgelse af tumorrespons på terapi på en dynamisk, tidsopløst måde på celleadfærdens niveau afdække nye mekanismer for behandlingsresistens. Humane tumorskivekulturer tilvejebringer en forbindelse mellem den humane sygdomsproces og nuværende ex vivo og in vivo modelleringsteknikker 19 . Vi har for nylig valideret den her beskrevne teknik som en metode til at studere GBM-migration, der rapporterer for første gang målbare inter-tumorale variationer i celle-migrationsadfærd relateret til EGFR-amplifikation og signalering 16 . Denne undersøgelse udnyttede også skivekulturmodellen til at teste patieNt-specifikke effektivitet af EGFR-hæmmeren, gefitinib, som en potentiel anti-invasiv terapi til GBM 16 .
Flere af de fælles faldgruber under vævsskæring, retroviral infektion, billeddannelse og billedanalyseparadigma er blevet diskuteret ovenfor. Imidlertid garanterer retroviralinfektionsprotokollen yderligere opmærksomhed. I betragtning af patient-til-patient variation kan det vise sig udfordrende at titrere tætheden af viralt mærket tumorceller inden for hver skive. Hvis utilstrækkelige antal celler er mærket af den virale konstruktion, tilsættes yderligere 5-10 μl alikvoter af retroviral supernatant til overfladen af hver skive dagligt, indtil ønsket koncentration af mærkede tumorceller er opnået. I primære skivekulturer er procentdelen af replikerende celler generelt lavere end i transformerede cellelinier og begrænser således delmængden af celler, der er permissive til retroviral inkorporering på et hvilket som helst tidspunkt. Alternativt, hvis for mange celler er mærket, forhindrer accUrat-afgrænsning af celle-migrationsveje, fortynd den virale supernatant med neuronmedier for at opnå en lavere effektiv titer. Tumorassocieret microglia inkorporerede det fluorescerende protein-udtrykkende retrovirus med en frekvens på ca. 1% af alle mærkede celler. Vi kunne visuelt isolere disse celler til separat analyse ved brug af et microglia bindende lectin til post-imaging data analyser ( Figur 5 ).
Tumormikromiljøet, herunder aspekter af næringsstofafgivelse, cellecelleinteraktioner og ekstracellulær matrix alle spiller en rolle i patogenesen af GBM 20 . Direkte humane GBM skivekulturer eliminerer behovet for passage i små dyremodeller eller dissemineret cellekultur, samtidig med at der tilvejebringes en nær rekapitulation af det humane tumor mikroemiljø. Endvidere giver skivekulturer ensartet adgang til næringsstoffer over prøverne, samtidig med at cellerne og celle-ECM-interaktioner opretholdes. Ved at reducere varIationer i cellulær adgang til næringsstoffer, der er kendt for at forekomme inden for tumorer, foreslår vi observerede forskelle i kulturerne, kaster lys på egentlige forskelle mellem tumorcelleadfærd ( dvs. migration) på befolkningsniveau. Fortolkning af data indsamlet på tværs af skivekulturer frembragt fra humane tumorer kompliceres imidlertid af iboende inter- og intra-tumorisk heterogenitet. Kritisk er der behov for yderligere undersøgelse for at karakterisere de potentielle genetiske og epigenetiske forskydninger, der kan forekomme under ex vivo vedligeholdelse af humane tumorskivekulturer.
Anvendelsen af humane tumorskivekulturer parallelt med fase I / II kliniske forsøg er en lovende strategi for at korrelere skiveparametre med patientens kliniske resultater. Validering af disse potentielle prædiktive / prognostiske parametre er nødvendig, inden skivekulturer kan bruges til at personalisere onkologisk terapi. Vores arbejde, såvel som andres, viser muligheden for biomarkør validering <Sup class = "xref"> 21 samt hurtig ex vivo test af terapeutiske midler i skivekulturer fra GBM 9 , 16 . Lignende humane skivekulturteknikker ved anvendelse af lung 22 , tyktarm 22 , hoved og hals 23 , bryst 24 og prostatakræft 25 væv tyder på, at denne fremgangsmåde er generaliserbar på tværs af humane cancere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Lee Niswander og Dr. Rada Massarwa for deres tekniske ekspertise og bidrag til den skivekultur-konfokale billedprotokol, der beskrives her. Yderligere tak til Dr. Kalen Dionne, der gav ekspertise vedrørende optimering af hjernevaskesplitning og kulturparametre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
References
- Beadle, C., et al. The role of myosin II in glioma invasion of the brain. Mol Biol Cell. 19, 3357-3368 (2008).
- Farin, A., et al. Transplanted glioma cells migrate and proliferate on host brain vasculature: a dynamic analysis. Glia. 53, 799-808 (2006).
- Panopoulos, A., Howell, M., Fotedar, R., Margolis, R. L. Glioblastoma motility occurs in the absence of actin polymer. Mol Biol Cell. 22, 2212-2220 (2011).
- Ivkovic, S., et al. Direct inhibition of myosin II effectively blocks glioma invasion in the presence of multiple motogens. Mol Biol Cell. 23, 533-542 (2012).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
- Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. J Neurosci Methods. 164, 261-270 (2007).
- Grube, S., et al. Overexpression of fatty acid synthase in human gliomas correlates with the WHO tumor grade and inhibition with Orlistat reduces cell viability and triggers apoptosis. J Neurooncol. 118, 277-287 (2014).
- Hovinga, K. E., et al. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neurooncol. 15, 670-681 (2013).
- Xu, J., et al. Vorinostat modulates cell cycle regulatory proteins in glioma cells and human glioma slice cultures. J Neurooncol. 105, 241-251 (2011).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities. in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer cell. 17, 98-110 (2010).
- Gill, B. J., et al. MRI-localized biopsies reveal subtype-specific differences in molecular and cellular composition at the margins of glioblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 12550-12555 (2014).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer cell. 20, 810-817 (2011).
- Kakita, A., Goldman, J. E. Patterns and dynamics of SVZ cell migration in the postnatal forebrain: monitoring living progenitors in slice preparations. Neuron. 23, 461-472 (1999).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Sem Cell Dev Biol. 20, 894-902 (2009).
- Parker, J. J., et al. Gefitinib selectively inhibits tumor cell migration in EGFR-amplified human glioblastoma. Neurooncol. 15, 1048-1057 (2013).
- Brat, D. J., et al. Pseudopalisades in glioblastoma are hypoxic, express extracellular matrix proteases, and are formed by an actively migrating cell population. Cancer Res. 64, 920-927 (2004).
- Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359, 843-845 (1992).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, 502-514 (2012).
- Di Cristofori, A., et al. The vacuolar H+ ATPase is a novel therapeutic target for glioblastoma. Oncotarget. 6, 17514-17513 (2015).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci USA. , 8352-8356 (2010).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110, 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66, 253-255 (2013).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Lab Invest. 94, 208-221 (2014).
