Summary
Gjeldende ex vivo- modeller av glioblastom (GBM) er ikke optimalisert for fysiologisk relevant studie av humant tumorinvasion. Her presenterer vi en protokoll for generering og vedlikehold av organotypiske skivekulturer fra fersk, human GBM-vev. En beskrivelse av tidsforskjellmikroskopi og kvantitative cellemigreringsanalyseteknikker er gitt.
Abstract
Glioblastom (GBM) fortsetter å bære en ekstremt dårlig klinisk prognose til tross for kirurgisk, kjemoterapeutisk og strålebehandling. Progressiv tumor invasjon i omkringliggende hjerneparenchyma representerer en varig terapeutisk utfordring. For å utvikle anti-migreringsterapier for GBM, er modellsystemer som gir en fysiologisk relevant bakgrunn for kontrollert eksperimentering avgjørende. Her presenterer vi en protokoll for generering av skivekulturer fra humant GBM-vev oppnådd under kirurgisk reseksjon. Disse kulturer tillater eks vivo- eksperimentering uten å passere gjennom dyr-xenografter eller enkeltcellekulturer. Videre beskriver vi bruken av tidsforskjell laserscanning konfokal mikroskopi i forbindelse med celleoppfølging for kvantitativt å studere svangerskapsvirkningen av tumorceller og tilhørende respons på terapi. Skiver genereres reproducerbart innen 90 minutter av kirurgisk vevsoppkjøp. Retroviralt mediert fluorescerende celle laBeling, konfokal imaging og tumorcelle migreringsanalyser blir deretter fullført innen to ukers kultur. Vi har med hell brukt disse skivekulturer for å avdekke genetiske faktorer knyttet til økt migrerende atferd i menneskelig GBM. Videre har vi validert modellens evne til å oppdage pasient-spesifikk variasjon som svar på anti-migrasjonsbehandlinger. Fremover er menneskelige GBM-stykkulturer en attraktiv plattform for rask eks vivo- vurdering av svulstfølsomhet overfor terapeutiske midler, for å fremme personlig neuro-onkologisk terapi.
Introduction
Laboratorieundersøkelsen av glioblastom (GBM) hindres av mangel på modeller som trofast rekapitulerer de nødvendige patologiske egenskapene til den menneskelige sykdommen, nemlig tumorcellemigrasjon og invasjon. Sammenligningsstudier av 2D- og 3D- in vitro- analyser samt 3D-gnagerekulturmodeller har avdekket mekanisk forskjellig cellulære migrasjonsprogrammer i disse to sammenhenger, som potensielt begrenser translatabiliteten av funn fra 2D-systemer til den humane sykdommen 1 , 2 , 3 . Det organotype tumorskivekulturen og avbildningsparadigmet beskrevet her tillater studier av tumorcellemigrasjon i skiver av humant tumorveve fra ex vivo oppnådd fra kirurgisk reseksjon. Dermed gir skivekulturer av kirurgisk resektert tumorvev i forbindelse med konfidensmikroskopi med tidsforskyvning en plattform for å studere tumorcelle-migrasjon i den nativeMikromiljø uten vevsoppløsning eller kulturpassasje.
Det er omfattende litteratur som benytter gnagere hjerneskivekulturmodeller av GBM generert fra humane tumor-xenografter, retroviral-induserte svulster og cellulære overlegg for å studere tumorinasjon 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Nylig har flere grupper beskrevet genereringen av organotypiske skivekulturer direkte fra humant GBM-vev 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Det er imidlertid markert variasjon blant publiserte protokoller med hensyn til kuttteknikk og kulturmedier. Videre har bruken av organotypiske skivekulturer fokusert på statiske eksperimentelle endepunkter som har inkludert endringer i celle signalerNg, spredning og død. Protokollen beskrevet heri utvider seg på tidligere slice kultur paradigmer ved å inkorporere tidsløst observasjon av dynamisk tumor celle oppførsel gjennom time-lapse laser scanning konfokal mikroskopi. Nylig oppdagelse av inter 11 og intratumoral 12 , 13 genetisk variasjon i human GBM understreker viktigheten av å knytte denne heterogeniteten til tumorcelleadferd og dens implikasjoner på tumorrespons på terapi. Her rapporterer vi en strømlinjeformet og reproduserbar protokoll for bruk av direkte skivekulturer fra et humant kreftvev for å visualisere tumorcellemigrasjon i nær sanntid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før oppsamlingen av pasientvevprøver påbegynnes, må informert samtykke hentes fra hver pasient i henhold til en godkjent Institutt for gransking av Instituttets gjennomgang (IRB). Forfatterne av denne protokollen mottok samtykke til arbeidet beskrevet under godkjente IRB-protokoller ved University of Colorado Hospital og Inova Fairfax Hospital. Data som er samlet inn fra disse skivekulturer, ble ikke brukt til å bestemme pasientbehandlingsbeslutninger.
1. Pre-slicing Preparation
- Forbered "tissue processing" media og "slice culture maintenance" media dagen før planlagt tumor reseksjon og vev samling (eller bruk tidligere generert media innen 2 uker). Tilsett 5 ml Penicillin-Streptomycin-oppløsning (10 000 U / mL) og 5 mL 1 M HEPES til 500 mL av en High-Glucose DMEM for å generere vevsbehandlingsmediet.
- Forbered 250 ml stykkulturvedlikeholdsmedier ved bruk av en base av nevronmedium ( f.eks . Neurobasal) witHout fenol rød. Tilsett dette mediet med 10 mM HEPES, 1x B-27 supplement, 400 μM L-glutamin, 600 μM L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 60 U / ml penicillin, 60 μg / ml streptomycin og 6 U / ml nystatin.
- Oppbevar alt medium ved 4 ° C i ikke mer enn 2 uker.
2. Dag for kirurgi: Oppsamling av væv
- På dagen for vevsoppkjøp, tilbered 50-100 ml 1% og 2% (vekt / vol%) oppløsninger av lavt smeltetemperatur agarose i vevsbehandlingsmedier ved bruk av autoklavert glass og steril teknikk i en laminarflytende hette. Begge konsentrasjoner av agarose er nødvendig for å imøtekomme uforutsigbar variasjon i tumorvevskonsistens.
- Varm agarosesuspensjonen ved hjelp av en mikrobølgeovn, til det er observert forsiktig koking. Plasser agaroseoppløsningen i et 37 ° C vannbad for å opprettholde i flytende tilstand til bruk.
- Plasser 1 ml skivekulturvedlikeholdsmedier i hver brønn på en 6-brønnplate.
- Bruk en sterilTanger for å plassere tomme PTFE kulturinnsatser i hver brønn. Sett platen i en fuktet, med vannkappe, vevskulturinkubator med en 5% CO2 atmosfære holdt ved 37 ° C.
- Ved hjelp av en steril Pasteur pipette i en laminær strømningshette, boble en blanding av 95% O2 / 5% CO2 gass inn i en kolbe inneholdende is kald vev bearbeidingsmedium i ca. 15 til 30 minutter, før tumorvev anskaffelse. Bruken av supra-oksygenerte medier minimerer hypoksi i bulkvævet under bearbeiding.
- Klargjør merkede 50 ml koniske rør (nok til ønsket antall individuelle tumorområder som skal isoleres) inneholdende 20 ml alikvoter av sukker oksygenert iskalt behandlingsmedium til transportvev mellom operasjonsrommet og skilleanlegget.
- I forbindelse med en nevrokirurg planlegger man preoperativt tumorområdet for prøveinnsamling. Velg en svulsteregion med kontrastforbedring som vist på pasientens kliniske forestillingG (T1 post-gadolinium magnetisk resonans imaging (MRI) sekvenser). Tidligere erfaring tyder på at dette området gir levende tumorvev i motsetning til nekrotisk vev.
MERK: Generering av skiver fra den omkringliggende (peritumoral) hvite saken ble forsøkt; Bakgrunnsautofluorescens og redusert tumorcelletetthet begrenset imidlertid eksperimentelle bruksmuligheter av disse skivene. - Oppnå tumorvev mot begynnelsen av svulstreseksjon. Unngå innsamling av svulstvev utsatt for omfattende bipolar kauter, noe som kan kompromittere vevets levedyktighet sekundært til termisk skade. Vevsprøver ervervet under stykkevis tumorreseksjon påvise forbedret levedyktighet når sammenlignet med vev ervervet fra omstende en bloc beregninger. Denne observasjonen kan forholde seg til differensielt svulstvevsvansker av blodstrøm som et resultat av kirurgisk reseksjon og forlenget tid til oppkjøp.
- Merk om ønskelig og lagre tumorvev i separate koniske rør for å isolere prøverFra forskjellige tumorområder. ( Dvs. overfladisk mot dyp tumorvev). Nøyaktige vevssteder kan registreres hvis / når intraoperativ kirurgisk navigasjon er tilgjengelig.
3. Slice Culture Preparation
MERK: Denne protokollen krever bruk av friskt ublandet menneskevev. Alle prøver antas å være smittsomme, og skal håndteres i henhold til universelle blodbårne patogenprotokoller. Passende personlig verneutstyr skal til enhver tid donned. Klemper og skalpeller bør bli utsatt for 15 min UV-lys før bruk. Spray verktøyene med 70% etanol (EtOH) under bruk, slik at væsken kan fordampe før bruk. Skareprosessen utføres på halv-steril måte ved bruk av en horisontal laminær strømnings hette med filtrert luft.
- Plasser svulstvevsbiter i en petriskål med iskallbehandlingsmedier. Å vaske svulstvevet og minimere vedhengende røde blodlegemer, ossEa pipette for å bytte ut og kaste mediet i petriskålen tre ganger.
- Ved hjelp av en skalpell, kutte svulsterstykker i rektangulære boksformer. Trim vevstykker til omtrentlig 3 mm x 3 mm x 10 mm. Fjern forsiktig eventuelle vedhengende fartøy gjennom excision eller forsiktig trekk med fine tang.
- Pipette 5 - 7 ml 37 ° C agarose i en liten terningformet (~ 2 cm 3 ) plastbøyleform. Bekreft temperaturen på agaroseoppløsningen er ikke større enn 37 ° C med et sterilt termometer før bruk.
- La agarose sitte i ca. 1 min på en isbunn.
- Plasser 2-4 tumorvev "strips" i agarose med lang akse orientert vertikalt.
MERK: Vevstrimler vil pleie å "synke" i agarosen før størkning. For å unngå denne komplikasjonen holdes vevstrimmelen midlertidig i vertikal orientering til agarose er ytterligere størknet. - Hold det vevsholdige agaroseformet på en isbunn i 2 - 5 miN for å lette størkning.
- Fjern mugg fra is og fjern forsiktig agaroseblokken ved å kutte sidene av formen med en skalpell. Unngå å plassere overdreven kraft på blokken, som kan bryte agarosen.
- Bruk en generøs dråpe cyanoakrylatlim for å feste agaroseblokken til vibratomeksemplarplaten. La lim settes i ca 1 - 2 min.
- Fyll vibratomreservoaret med iskaldt behandlingsmedium for å senke agaroseblokken festet til prøveplaten.
- Under skiving, boble 95% O 2 /5% CO 2 gassblanding inn i vibratomreservoaret gjennom en trimmet steril plastpipette.
- Sett vibratome skive tykkelsen til 300 - 350 μm.
- Juster bladets fremdriftshastighet og bladamplitude i henhold til vevets konsistens. "Stivere" GBM-vev krever langsommere bladhastighet og høyere amplitude. Eksakt bladhastighet og amplitudeinnstillinger vil variere i henhold til vibratomspesifikasjoner.
- Overfør væskeskiver til petriskål med iskallbehandlingsmedium ved hjelp av en mikrospatel i rustfritt stål.
- Skaff 6 brønnplater med PTFE-innsatser og ekvilibrert skivekulturmedium fra inkubator (som fremstilt i avsnitt 2, trinn 4).
- Plate vev skiver med en mikrospatel i rustfritt stål. Minimere direkte kontakt og manipulering av vev ved å bruke en liten fin børstepensel for å generere en "væskebølge" for forsiktig å skyve skiven av spatelen aNd på kulturinnsatsen.
MERK: Minimere mengden behandlingsmedier introdusert på toppen av vevskulturinnsatsen. Hvis overdreven mengder medier overføres, slik at skivene flyter, bruk en steril Pasteur pipette for å fjerne media. - Returner 6-brønners plater inneholdende svulstbiter til en inkubator som holdes ved 37 ° C med en 5% CO2 atmosfære.
MERK: Hele innlemmings- og snittprotokollet skal fylles ut innen 90 minutter fra oppsamling av svulstvev fra operasjonsrommet.
4. Slice Culture Maintenance
- Etter 12 - 24 timer overfører du skivekulturen ved å gripe hver innsatsfel med sterile pincet og overføre til plater som inneholder friske skivekulturvedlikeholdsmedier. Kontroller at skivekulturvedlikeholdsmediet er alikvotert i hver brønn likeverdig i inkubatoren i minst 15 minutter før overføring av innsatser.
- Flytt innsatsene til nye 6-brønnsplater med fersk ekvilibrert skiveflaskeTure media hver 48 timer.
- Hvis ønskelig, alikvot gammelt stykke kulturmedium med pipette for umiddelbar bruk i biokjemiske analyser ( dvs. ELISA) eller frys ved -80 ° C til senere bruk.
5. Tumorcellemerking via grønt fluorescensprotein som uttrykker Retrovirus
MERK: Time-lapse-mikroskopi for analyse av tumorcellemigrasjon krever stabil, langsiktig fluorescensmerking av celler i slicekulturen. Bruk av retrovirus er foreslått fordi det selektivt infiserer delende celler, og derved beriker fluorescerende merking i tumorcellepopulasjonen i motsetning til mikroglia eller andre celletyper som er tilstede innenfor skiven. Standardisering av infeksjon antyder at en viral titer på 10 4 CFUer / μL resulterer i tilstrekkelig grønn fluorescerende proteinuttrykk for sporing og analyse av cellemigrasjon. Økt viral titer, bruk av ikke-selektivt virus ( dvs. adenovirus, lentivirus), eller otHennes middel til merking av alle celler kan utelukke identifikasjon av klare cellegrenser under migrasjon, og dermed kompliserende analyse. Bruk av alternative fluorescerende markører kan utnyttes og optimaliseres etter behov.
- Hent retrovirus for infeksjon av tumorskiver enten via standardprotokollene 5 , 14 eller fra en kommersielt tilgjengelig kilde. Fortynn den virale supernatanten ved å tilsette det riktige volumet i usupplementert nevronmedium for å oppnå en viral titer på 10 4 CFUer / μl.
- Mellom 7-10 dager med kulturen infiserer tumorskivekulturer av interesse med 5 - 10 μL virus (10 4 CFUs / μL). Plasser viruset forsiktig dråpevis på overflaten av hvert vevstykke. Reduser supernatantvolumet tilsatt hvis skiven flyter på innsatsens overflate. Returplater som inneholder skivekulturer til inkubator.
- Vurder skiver for merkede tumorceller som begynner kl 24 timer etter Virusinfeksjon (se seksjon 6). Denne forsinkelsen vil variere avhengig av viral inkorporering og fluorescensgenekspressjonskinetikk. For de virale konstruksjonene som ble benyttet her, var det nødvendig med 72 timer å observere robust fluorescerende signal med et standard epifluorescensmikroskop.
MERK: Skårer viser sjelden en overordnet perifer fordeling av virus merkede celler, noe som kan komplisere konfokal bildebehandling. For å unngå denne komplikasjonen, prøv å redusere skive tykkelse og tykkelse variasjon over skiven. Hvis skivekulturen har en tykkere region nær senteret, kan dette forhindre tilstrekkelig næringsinntrenging, og dermed begrense befolkningen aktivt deling av tumorceller. En kvalitativ analyse for å skjerme for denne komplikasjonen er tilsetning av et tetrazoliumfargestoff reagens ( dvs. MTT) til skivekulturmediet. Områder av skiven som ikke blir blå etter at reagensen er tilsatt, indikerer mangel på metabolsk aktivitet og kompromittert skivehelse.
MERK: Etter at vellykket transduksjon og helse av kulturen er bekreftet, kan celler bli avbildet under kontrollbetingelser, etterfulgt av en like periode med avbildning under behandlingsbetingelser. Ved hjelp av denne protokollen ble cellene vellykket avbildet og sporet i 12 timer i hver tilstand. Imidlertid kan kortere eller lengre perioder med avbildning og miljømanipulering også være informativ.
- Laster mikroskopet
- Før bildebehandling legger du 1 ml friskt stykke media inn i en glassbunnskål.
- Tillat media i glassbunnretten å balansere i en inkubator i 15 minutter.
MERK: På dette tidspunkt kan oppløselige merkemidler, som fluorescenskonjugerte lektiner ( dvs. Isolectin IB 4 for mikroglia-merking) eller ligandkonjugerte kvantepunkter, tilsettes til skivekulturmediet for identifikasjon av celleUlar subpopulations under bildebehandling. - Overfør innsatsen som skal avbildes til en glassbunnplate ved hjelp av sterile pincett i en laminær hette. Transport oppvaskmaskinen til mikroskopfasen.
- Oppretthold snittkulturer ved 37 ° C og 5% CO2 atmosfære i et forseglet objektbord-topp inkubator. Benytte sterilt H2O fukting av inkubasjonen kammeret hvis det er tilgjengelig for å hindre overdreven fordampning media (spesielt viktig for lengre bildebehandling eksperimenter).
- Bruk et konfokalmikroskop med lang arbeidsavstand 10X luftmål og laser excitering for enkeltfoton og / eller flerfoton.
MERK: Kontroller at objektivet for mikroskop objektivet gir tilstrekkelig arbeidsavstand. Som et resultat av den økte høyden fra scene-top-inkubatoren, glassbunnretten og vevskulturinnsatsen, er lange arbeidsavstandsmål kritiske. - Fest glassbunnplaten, fjern plastdisplayet, og dekk med en gass-Permeabel membran.
- Bildeoppkjøp
- Bruk mikroskopet til å visuelt inspisere skiven, og lokaliser et egnet felt med tilstrekkelig tetthet av fluorescensmerkede tumorceller mellom skivekanten og senteret. Unngå bildefelt på kanten av skiven, på grunn av økt følsomhet for vevskift under bildebehandling. Vevskive harper kan brukes til å begrense dette skiftet.
- Bruk billedbehandling programvare i flerdimensjonal analyse modus for å angi de første (nederste) og siste (øverste) Z-stack grenser, slik at alle posisjoner som skal avbildes inneholde synlige fluorescerende cellesignal. Imaging gjennom 150 - 200 μm av skiven, med en konstant Z-trinn på 10 μm, ga tilstrekkelig oppløsning for å spore cellebaner (dette kan justeres for individuelle bildebehandlingsbehov).
- Hvis mikroskopet har en motorisert fase, sørg for at det er tilstrekkelig tid tillatt for hver Z-stack-oppkjøp. Sett tidsintervallet mellom oppkjøpene til likSkannetid per posisjon x antall stillinger til bilde ( dvs. avbildede svulsteregioner).
MERK: For samtidig eksitering av de grønne og røde fluorophorene, bruk et dobbeltlinjet laserlinjeskanningsprogram med samtidig 488 nm og 633 nm excitasjon. Bølgelengden av laserekspitasjon som er valgt, vil variere i henhold til individuelle fluorescerende proteiner som uttrykkes. - Opprettholde unike laserstrøm og konfokale pinholeinnstillinger mellom de avbildede svulsteregioner. Bruk den laveste laserkraftinnstillingen som er nødvendig for å tydelig avgrense tumorceller og prosesser for å begrense fototoxicitet. Spesifikke bildeparameterenheter ( dvs. strøm og konfokulære pinholeinnstillinger) vil variere i henhold til spesifikasjoner for mikroskop og laserkilde.
- Kompensere for potensiell media fordampning ved å legge 2-3 "buffer" Z-stack trinn i fokusplanene fremover mot målet. Dette forhindrer effektivt at vevet forlater rekkevidden av Z-stack-oppkjøpetIoner i vertikalplanet.
7. Bilde Etterbehandling og Tumor Cell Tracking
MERK: Mange konfokalsystemer er utstyrt med proprietær bildebehandlingsprogramvare. Prosesseringstrinnene som er omtalt nedenfor, omfatter en generell protokoll som kan utføres på tvers av programvareplattformer. Spesifikke instruksjoner vil bli gitt for open-source-plattformene, NIH ImageJ og MTrackJ 15 .
- Åpne en Z-stack-fil. I ImageJ klikker du på "Image → Stacks → Z Project." Velg den første og siste Z-stabelen for å inkludere, og velg "Max Intensity" som projeksjonstype. Resultatet er en gjengivelse kalt maksimal intensitetsprojeksjon (MIP). Opprett en MIP fra hvert sett med Z-stack-bilder tatt i hver region som er avbildet.
- Sammenkoble MIPene fra hver region for å lage en tidsserie. Klikk på "Bilde → Stabler → Bilder til Stack."
- Identifiser stedet manueltAv cellelegemet "sentroid" ved å velge det visuelt tilnærmede midtpunktet til tumorcellelegemet. Dette oppnås ved å klikke på cellekroppen ved hjelp av "add" -sporfunksjonaliteten til MTrackJ (en åpen kildekode-plugin for NIH ImageJ).
- Klikk for å avgrense plasseringen av cellenes kropp i hver ramme av serie bilder. Dette skaper et unikt "spor" for hver celle. Merk sekvensen av cellelokaliseringen til neste celle. Gjenta denne prosessen til alle celleoverføringsbaner spores.
- Når en populasjon av celler spores i en gitt tumormikro-region, eksporterer du alle cellebanekoordinater ved hjelp av "måle" -funksjonen til MTrackJ. Lagre filen som et .xls-format slik at de rå dataene kan analyseres ved hjelp av regneark eller brukergenerert programvare.
- Bruk koordinatene som er registrert for hvert punkt langs en celle migrasjonsspor, for å utføre kvantitative analyser, inkludert avledning av migrasjonshastighet, retningsretning og annen migrasjonBeregninger, som beskrevet i Parker et al. 16 .
MERK: Alle beregnede avstander og hastigheter er underestimater av faktiske verdier. Dette er innebygd i transformasjonen av tredimensjonale bilder (og migreringsbaner) til todimensjonale data gjennom generering av maksimalintensitetsprojeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår gruppe har vellykket generert skivekulturer fra over 50 pasienter som gjennomgår GBM-reseksjon. Denne segmenteringsgenerasjonen, kulturen, retroviral-merking, bildebehandling og migrasjonsanalyseprotokollen er blitt strømlinjet i en reproduserbar arbeidsflyt ( figur 1 ). Kritisk viser disse organotype GBM-stykkene samsvar med opprinnelsesvektvev i hele kulturen, inkludert vedlikehold av patologiske kjennetegn og mikroglia opptil 15 dager i kultur ( figur 2 ). I tillegg har vi benyttet dette systemet til å utføre funksjonelle analyser av svulstrespons til mikro-miljøendringer. Som en beregning av fysiologisk integritet, undersøkte vi hvordan GBM snittkulturer svarte til hypoksi (1% O2) ved å måle produksjonen av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), en prosess som forekommer rikelig i GBM mikromiljøet in vivo 17,"> 18. Vi viste at ved å plassere stykkulturene i hypoksiske forhold, monterte skivene en rask fysiologisk respons, som induserte VEGF-utgivelsen i media ( Figur 3 ).
For å evaluere kvalitative og kvantitative aspekter ved tumorcellemigrasjon brukte vi tidsavbruddsbildene til å generere detaljerte migrasjonskart. Disse kartene avgrenser alle GBM-celler spores innenfor grenser av tumormikroregioner (1 mm 2 ), og gir en statisk visualisering av tumorpopulasjonenes dynamiske migrerende oppførsel. Kvantitative tiltak for migrasjonshastighet og retningsstrekning (celleforskyvning / total avstandsreise) ble beregnet for hver celle, slik at det ble mulig å undersøke endringer i migrasjonsparametre over tumorområder, svulstprøver og som respons på behandling ( figur 4 ).
Cellemerking og bildebehandling desBeskrevet her, gir også tilstrekkelig romlig og tidsmessig oppløsning for å evaluere endringer i cellemorfologi under migrasjon gjennom det innfødte tumormikromiljø. Vi observerte nærværet av morfologisk særskilte motile tumorceller og mikroglial blandet i skivekulturen ( Figur 5A ). Tumorcellebevegelse ble preget av en "søk og brist" -prosess, som innebar gjentatt fremspring og tilbaketrekking av filopodier fra en statisk celle, etterfulgt av en kort periode med effektiv bevegelse. Imaging slice regioner omtrent hver 10. minutt ga også tilstrekkelig tidsmessig oppløsning for å registrere tidsavbruddbilder av svulstceller som gjennomgår celledeling. Disse delende cellene ble midlertidig stoppet fra migrasjon, fullført mitose, og dattercellene startet omgående migrering, alt innen en 3-timers tidsramme ( Figur 5D ). I motsetning til dette mikroglia migrerer med høyere og mer konsistent hastighet, med lavere retning enn tilstøtende tumorceller,Demonstrerer deres relativt ineffektive migrasjon ( Figur 5C, 5E-G ). Slike observasjoner kan være viktige for å få innblikk i biologien underliggende pasient- eller celle-spesifikke responser på behandlingen.
Endelig brukte vi denne protokollen til å demonstrere pasient-til-pasientvariabilitet i cellemigreringsparametere på populasjonsnivå, inkludert en korrelasjon av epidermal vekstfaktorreceptor ( EGFR ) genomisk forsterkning med forsterket migrerende potensial for tumorceller 16 . I tillegg viste tidsforskjellsmikroskopi av tumorskiver før og etter behandling med det anti-invasive stoffet, gefitinib, en signifikant reduksjon i migrasjon, som var spesifikk for EGFR- amplifiserte tumorskiver 16 .
Figur 1: Human GBM Organotypic Slice Kultur Infeksjon, Imaging, og Cell Migration Analysis Workflow. Tumorvev er lokalisert til en bestemt region via intraoperativt navigasjonsutstyr. En uke etter slicing legges ZsGreen-uttrykkende retrovirus til skivekulturer for å merke de mitotisk aktive tumorceller. 3 dager etter infeksjon, er skiver forberedt for konfokal bildebehandling. 3D-bildedata blir etterbehandlet til 2D-bilder for sporing av celleoverføringsbaner, generering av tumorcelleoverføringskart og beregning av tumorcelleoverføringsparametere. Deler av denne figuren ble opprinnelig publisert i Parker et al , 2013 16 og reprodusert med tillatelse fra Oxford University Press. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Humane GBM organotypiske skiver beholder histologiske egenskaper gjennom hele ex vivo- kulturen. ( A ) T1-kontrastforsterkede MR-sekvenser ble brukt til å lokalisere og dokumentere regionen (er) av vevsoppkjøp (pil). ( B ) H & E-farging av første donorvev (OR) og skiver på dag 8 av kultur fra en skivekultur fremstilt fra vev oppnådd fra regionen fremhevet i A. ( C ) Mikromiljøpatologiske og cellulære trekk ved GBM in vivo opprettholdes I hele stykke kultur. (I, II) Immunohistokjemi for CD68, en mikroglia / makrofagmarkør, ved lav (topp) og høy (bunn) forstørrelse, demonstrerer mikroglial persistens i skiver etter 15 dager med kultur. H & E-farging på dag 4 av skivekultur bekrefter vedlikehold av pseudopalliserende nekrose, en patoLogikkstempel for GBM, både ved lav (iii) og høy (iv) forstørrelse. Skalestenger = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Human GBM Slice Cultures Sekretere VEGF som respons på hypoksi. ( A ) Forsøket benyttet individuelle dyrkningsinnsatser som inneholdt 3 lignende størrelse svulster skiver generert fra samme tumorregion. Skivene ble opprettholdt i normoksi i 12 timer, etterfulgt av to 12 h intervaller med hypoksi, med nye medier tilsatt før hvert intervall. ( B ) VEGF-sekresjon i media målt ved ELISA (gjennomsnittlig ± standardavvik) fra skivekulturer generert fra to representative tumorer, ble signifikant økt unDer hypoksi enn normoksi (p <0,05). ( C ) En samlet analyse av skivekulturer fra 4 forskjellige tumorer viste økt VEGF sekresjon etter sekvensielle 12 h intervaller med hypoksi sammenlignet med normoksi (p <0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tumorcellebanespordata tillater kvantitativ bestemmelse av cellehastighet og retningsretning. ( A ) Tumorceller med retningsretning på 1 representerer perfekt effektivitet langs en rett vektor, mens de med lavere retninger engasjerer ineffektive meanderingsbaner, som representert i denne skjematiske 16 . Gjengitt med tillatelse fra Oxford UniversityTrykk. ( B ) Analyse av representative banespordata ("lav" oppløsning ~ 55 min. Celleoppfølgingsintervaller) demonstrerer mobil variabilitet i hastighet og retningsevne. ( C ) Direksjonalitet versus migrasjonshastighet for hvert cellespor er tegnet for å visualisere migreringsadferd i hele cellepopulasjonen (hver prikk representerer en individuell celle). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Microglia innenfor GBM Slice Cultures er karakterisert ved høy migrasjonshastighet og lav retningsevne i forhold til tumorceller. ( A ) Replikerende tumorceller selektivt uttrykker ZsGreen retrovirus og microglia merket med en isolectin-I B 4 -647 konjugat eksisterer blandet i en representativ tumormikro-region fra en representativ styrekultur. ( BC ) Banene til individuelt sporet GBM ( B ) og microglia ( C ) i samme tumormikroregion viser uoverensstemmende migreringsadferd. Skalestenger = 200 μm. ( D ) En aktivt migrerende svulstcelle pause, trekker inn sine prosesser (pilehode), gjennomgår celledeling, og to datterceller beveger seg bort i motsatt retninger (pilene). Skalestenger = 50 μm. ( E og F ) Microglia viser økt migrasjonshastighet (p <0,0001) og redusert retningsstrekning (p <0,0001) sammenlignet med tumorceller i samme region. (G) Fordelingen av tumor og mikroglialceller basert på hastighet og retningsevne demonstrerer de unike vandrende fenotyper av de to cellepopulasjonene.Et = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organotypiske skivekulturer fra humant kreftvev gir en attraktiv og underutilisert plattform for preklinisk translasjonell eksperimentering. Forståelse av befolkningsnivåbetegnelse av tumorceller med hensyn til migrasjon, proliferasjon og celledød i det naturlige tumormiljømiljøet mangler. Kritisk kan studiet av svulstrespons på terapi i en dynamisk, tidsbesparende måte på nivået av celleadferdighet, kaste lys på nye mekanismer for behandlingsmotstand. Humane tumorskivekulturer gir en sammenheng mellom den humane sykdomsprosessen og nåværende ex vivo og in vivo modelleringsteknikker 19 . Vi har nylig validert teknikken beskrevet her som en metode for å studere GBM-migrasjon, og rapporterer for første gang målbare inter-tumorale variasjoner i celle-migreringsadferd relatert til EGFR-amplifikasjon og signalering 16 . Denne studien benyttet også slice culture modellen til å teste patieNt-spesifikk effektivitet av EGFR-hemmeren, gefitinib, som en potensiell anti-invasiv terapi for GBM 16 .
Flere av de vanlige fallgruvene under veveskjæring, retroviral infeksjon, bildebehandling og bildeanalyseparamigram har blitt diskutert ovenfor. Imidlertid garanterer retroviral infeksjonsprotokollen ytterligere oppmerksomhet. Gitt pasient-til-pasientvariasjon, kan det vise seg utfordrende å titrere tettheten av viralt merkede tumorceller i hver skive. Hvis utilstrekkelig antall celler er merket av viruskonstruksjonen, tilsett ytterligere 5-10 ul alikvoter av retroviral supernatant til overflaten av hver skive daglig til ønsket konsentrasjon av merkede tumorceller oppnås. I primære skivekulturer er prosentandelen av replikerende celler generelt lavere enn i transformerte cellelinjer, og begrenser således delmengden av celler som er permisive til retroviral inkorporering på et hvilket som helst tidspunkt. Alternativt, hvis for mange celler er merket, forhindrer accUrat-avgrensning av celle-migreringsbaner, fortynn den virale supernatanten med nevronmedium for å oppnå en lavere effektiv titer. Tumor-assosiert mikroglia inkorporerte det fluorescerende protein-uttrykkende retrovirus ved en frekvens på ca. 1% av alle merkede celler. Vi kunne visuelt isolere disse cellene for separat analyse ved bruk av en mikroglia bindende lectin for post-imaging data analyser ( Figur 5 ).
Tumormikroenmiljøet, inkludert aspekter av næringsstofflevering, cellecelleinteraksjoner og ekstracellulær matrisen, spiller en rolle i patogenesen til GBM 20 . Direkte humane GBM slice kulturer eliminerer behovet for passasje i små dyr modeller eller spredt cellekultur, samtidig som de gir en nær rekapitulering av det humane tumor mikroemiljøet. Videre gir skivekulturer jevn tilgang til næringsstoffene på tvers av prøver, samtidig som celler og celle-ECM-interaksjoner opprettholdes. Ved å redusere varIasjoner i cellulær tilgang til næringsstoffer som er kjent for å forekomme innen svulster, foreslår vi observerte forskjeller i kultene, kaster lys på ekte forskjeller mellom tumorcelleadferdene ( dvs. migrasjon) på populasjonsnivå. Imidlertid er tolkning av data samlet over skivekulturer generert fra humane tumorer komplisert ved inneboende inter- og intra-tumoral heterogenitet. Kritisk er det nødvendig med videre studier for å karakterisere potensielle genetiske og epigenetiske skift som kan oppstå under ex vivo vedlikehold av humane tumorskivekulturer.
Bruken av humane tumorskivekulturer parallelt med fase I / II kliniske studier er en lovende strategi for å korrelere skiveparametere med pasientens kliniske resultater. Validering av disse potensielle prediktive / prognostiske parametrene er nødvendig før skivekulturer kan brukes til å tilpasse onkologisk terapi. Vårt arbeid, så vel som andre, demonstrerer muligheten for biomarkør validering <Sup class = "xref"> 21, samt rask ex vivo testing av terapeutiske midler i skivekulturer fra GBM 9 , 16 . Liknende humane skivekulturteknikker som bruker lung 22 , kolon 22 , hode og nakke 23 , bryst 24 og prostatakreft 25 vev antyder at denne tilnærmingen er generaliserbar på tvers av humane kreftformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Lee Niswander og Dr. Rada Massarwa for deres tekniske ekspertise og bidrag til slice culture confocal imaging protokollen beskrevet her. Videre takk til Dr. Kalen Dionne som ga kompetanse om optimalisering av hjernesvulstensnitt og kulturparametere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
References
- Beadle, C., et al. The role of myosin II in glioma invasion of the brain. Mol Biol Cell. 19, 3357-3368 (2008).
- Farin, A., et al. Transplanted glioma cells migrate and proliferate on host brain vasculature: a dynamic analysis. Glia. 53, 799-808 (2006).
- Panopoulos, A., Howell, M., Fotedar, R., Margolis, R. L. Glioblastoma motility occurs in the absence of actin polymer. Mol Biol Cell. 22, 2212-2220 (2011).
- Ivkovic, S., et al. Direct inhibition of myosin II effectively blocks glioma invasion in the presence of multiple motogens. Mol Biol Cell. 23, 533-542 (2012).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
- Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. J Neurosci Methods. 164, 261-270 (2007).
- Grube, S., et al. Overexpression of fatty acid synthase in human gliomas correlates with the WHO tumor grade and inhibition with Orlistat reduces cell viability and triggers apoptosis. J Neurooncol. 118, 277-287 (2014).
- Hovinga, K. E., et al. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neurooncol. 15, 670-681 (2013).
- Xu, J., et al. Vorinostat modulates cell cycle regulatory proteins in glioma cells and human glioma slice cultures. J Neurooncol. 105, 241-251 (2011).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities. in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer cell. 17, 98-110 (2010).
- Gill, B. J., et al. MRI-localized biopsies reveal subtype-specific differences in molecular and cellular composition at the margins of glioblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 12550-12555 (2014).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer cell. 20, 810-817 (2011).
- Kakita, A., Goldman, J. E. Patterns and dynamics of SVZ cell migration in the postnatal forebrain: monitoring living progenitors in slice preparations. Neuron. 23, 461-472 (1999).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Sem Cell Dev Biol. 20, 894-902 (2009).
- Parker, J. J., et al. Gefitinib selectively inhibits tumor cell migration in EGFR-amplified human glioblastoma. Neurooncol. 15, 1048-1057 (2013).
- Brat, D. J., et al. Pseudopalisades in glioblastoma are hypoxic, express extracellular matrix proteases, and are formed by an actively migrating cell population. Cancer Res. 64, 920-927 (2004).
- Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359, 843-845 (1992).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, 502-514 (2012).
- Di Cristofori, A., et al. The vacuolar H+ ATPase is a novel therapeutic target for glioblastoma. Oncotarget. 6, 17514-17513 (2015).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci USA. , 8352-8356 (2010).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110, 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66, 253-255 (2013).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Lab Invest. 94, 208-221 (2014).
