Introduction
Udvikling af nye modeller for pædiatrisk skade eller sygdom ved hjælp af gnavere er ofte vanskeligt på grund af den fantastiske evne både rotter og mus til hurtigt komme sig neurologisk skade. Derfor, for at validere en ny pædiatrisk sygdomsmodel, grundigt at undersøge de cellulære og molekylære ændringer skal gå hånd i hånd med adfærdsmæssige resultater. På mange måder kan funktionelle adfærdsmæssige opsving være vigtigere end de underliggende cellulære ændringer i form af terapeutisk eller translationel relevans. Da forskerne lære mere om skade i den voksne og nyfødte, er det klart, at deres svar er meget forskellige og ikke kan ekstrapoleres mellem de to. For eksempel neonatale mus vist forskellige niveauer af nervevækstfaktor, hjerneafledt neurotrofisk faktor, neurotrofin-3 og glialcellelinjeafledt neurotrofisk faktor efter rygmarvsskade 1,2. Derudover nyfødte har betydelig blod-hjerne-barrieren lækage efter slagtilfælde 3, demonstrate cortical neuron omlejring efter perifer nerveskade 4, og har en forsinket eller langsommere astrogliose efter rygmarvsskade og hypoxi-iskæmi 5,6. Derfor er det vigtigt, translationel pædiatrisk forskning bruge udviklingsmæssigt tilsvarende modeller, og at disse modeller er vurderet for både cellulære / molekylære ændringer og alderssvarende adfærdsmæssige tests.
Cerebral parese (CP) er en motor lidelse, der påvirker 3: 1000 levendefødte årligt (NIH). Børn med CP udviser en række symptomer og følgesygdomme, afhængigt af sværhedsgraden af sygdommen. Vanskeligheder med bevægelse og koordination er de mest almindelige tegn, sammen med forsinkelser i at nå motor udviklingsmæssige milepæle. Andre tegn omfatter unormal muskelspænding (enten øget eller nedsat), nedsat finmotorik, gangbesvær, overdreven savlen og synke, og tale forsinkelser (NIH). Den underliggende årsag til CP menes at væreen mangel på oxygen og / eller blodstrømmen til hjernen under præ- eller peripartum periode, eller op til et års post partum. Desuden er betændelse nu menes at være en vigtig komponent i udviklingen af CP.
Størstedelen af CP tilfælde er forbundet med hvid substans skader omkring ventriklerne, kendt som periventricular leukomalaci (PVL). Denne neurologiske kendetegnende antyder, at den oprindelige fornærmelse fører til CP optræder under perioden med hjernens udvikling når oligodendrocytterne er mest sårbare over insult. Den periode med hurtig vækst oligodendrocyt i et menneske, også den periode, hvor oligodendrocytter er mest modtagelige for skade, er mellem 24-32 ugers svangerskab. Hos gnavere, den tilsvarende periode er postnatale dage 2 - 7 7, og er, når CP induceres i denne model.
Den neonatale musemodel af CP, der blev brugt til at gennemføre de her skitserede test kombinerer hypoxi og iskæmi med betændelse at skabe en injUry at bedre efterligner neurodegeneration set i human CP. Denne model tager fat på nogle af de store mangler observeret i andre dyremodeller for CP, som mangler distinkte motoriske underskud, der ligner menneskelige CP patienter, såvel som forskellig hvid substans skader. Tidligere undersøgelser af en samarbejdspartner anvendelse af den samme model har vist, at tilsætning af inflammation øger hvide substans skader, hvilket bedre efterligner PVL ses hos børn med CP 8. Med udgangspunkt i de tidligere data, dette papir præsenterer en omfattende batteri af neonatale motoriske tests for at vurdere ændringer i motorisk adfærd som dyret aldre.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyr operationer blev udført i overensstemmelse med Temple Universitets ular afdeling og IACUC politikker og procedurer. C57BL / 6 dæmninger og fædre blev købt fra Charles River Laboratories og blev opstaldet i avl bure med en 12 timers lys / mørke cyklus (lys på 7:00 til 19:00) med fri adgang til mad og vand. Ynglepar produceret kuldstørrelser mellem 5 - 10 hvalpe.
1. cerebral parese induktion Surgery
- BEMÆRK: Cerebral parese blev induceret under anvendelse af post-natal dag (PND) 6 museunger, som tidligere beskrevet 8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia).
- Placer en hvalp i en glasskål på is med et laboratorium tørre at beskytte hvalpen hud. Check for passende bedøvelse fly fods knivspids og manglende bevægelighed. Flyt hvalpen til en polstret ispose til operation.
- Sterilisere huden af pup anvendelse af 70% ethanol. Når tør, brug en # 11 steril kirurgisk blade og gøre en 1 cm incision i halsen.
- Ved hjælp af en stereoskopisk kirurgisk mikroskop, isolere den rigtige fælles halspulsåren med en lille krog og ætse bruger en bærbar håndholdt cauterizer. Bekræft visuelt, at arterien okkluderes. Sham kirurgi omfatter visualisering og isolering af den fælles carotidarterie uden ætsninger.
- Justere huden og tæt ved anvendelse sutur lim (n-butyl cyanoacrylat).
- Placer hvalpen på en 34 ° C varmepude i 30 min for at overvåge for spontan vejrtrækning og normal bevægelse.
- Returnere pup (er) til dam i 30 min.
- Placer hvalpene på en varmepude eller anden opvarmning enhed indstillet på 34 ° C inde i en hypoxi kammer til 6% oxygen i 35 min. Oxygen erstattes af kvælstof. Nøje overvåge kammeret ilt-niveau og temperatur for ensartede skade resultater.
- Fjern hvalpene fra hypoxi kammer og returnere dem til varmepuden.
- Intraperitonealt injicere lipopolysaccharid fortyndet i sterilt saltvand ved 1 ug / kg og returnere pup til dæmningen. Simuleret injektioner er injektioner af kun saltvand.
2. Neonatal Motor Tests
BEMÆRK: På PND 8, 48 timer efter CP induktion, er musen hvalpe testet for neurologisk adfærd udvikling. Hvalpe testes inden for en 4 hr blok før middag for at eliminere tidspunktet på dagen forskelle i adfærd. Unger fjernes fra dæmningen for ikke mere end 15 min ad gangen for at forhindre hurtig tab af kropsvarme og sult / separation spørgsmål. Desuden er unger lov at hvile i mellem tests, så at maksimal indsats vil blive fremkaldt på hver test. Grundlaget for de neonatale motoriske tests er tilpasset ved hjælp af Fox batteri af tests 10,11 og Wahlsten s tilpasning af Fox tests 12, samt Treat-NMD og anden adfærd publikationer (som bemærket i teksten for hver test). Fox batteri af tests er passende for PND 2 - 21. Af Fox tests, dejeny stede her omfatter: oprettende refleks, gribe refleks, negative geotaxis (kaldet lodret skærm test i Fox batteri) og fire lemmer gribestyrke (modificeret fra Fox og Wahlsten skærm klatring test). Her er mobilisering, front-lemmer styrke og bagben styrke også testet til at skelne refleksiv motorisk adfærd mellem fingeret og CP mus hvalpe. For at eliminere forbedringer på test på grund af læring, blev tests begrænset til maksimalt 3 forsøg, hvor noteret. Alle andre forsøg havde kun én prøveperiode pr dyr.
- Ambulation (figur 1) (tilpasset fra en rotte protokol 13):
BEMÆRK: Crawling er en adfærd udviklet tidligt i musen hvalp mellem PND med 0 - 5, på hvilket tidspunkt mus begynder at overgangen til fods, fra 5 - 10 dage gamle 14. Hos PND 8, den ambulation test udnytter denne overgangsperiode tidsforløb. Ambulation kan imidlertid blive scoret hele levetid en mus og kan bestemmes på alle alderstrin.Da der ikke er potentiale for læring, kan det ambulation testen gentages så mange gange som nødvendigt gennem løbet af forsøget.- Placer mus i en klar kabinet, hvor mus er synlig fra toppen samt siden. Brug blid prodding ved at røre hvalpen hale at motivere hvalpen at gå.
- Score ambulation i 3 min ved hjælp af den følgende skala: 0 = ingen bevægelse, 1 = kravle med asymmetrisk bevægeapparatet, 2 = langsom gennemgang men symmetrisk bevægeapparatet, og 3 = hurtigt kravle / gå.
BEMÆRK: Her er symmetrisk bevægeapparatet beskrevet hvor bagpoter mødes frontpaws under hvert trin, og hvert trin jævnt overgange til det næste trin. En mus viser asymmetrisk bevægeapparatet har uberegnelige pote placering og overgange fra et trin til det næste er ikke lige.
Figur 1. Overgangen fraGennemgang til Gåture kan skelnes ved at observere bagpoten, samt hoved og hale. (A) Under kravle, hele ryggen pote, fra tæerne til hælen, rører jorden, når ambulating, som angivet med (*). En voksen gående mønster ses, når kun de tæer og forreste del af bagpoten røre jorden (hælen er forhøjet, deonoted af [**]). (B) Den hoved og hale af en kravlende mus er lav til jorden. Hovedet begynder at stige ved overgangen fra kravle til fods. Overgangen er færdig, når både hoved og hale er forhøjet, og kun den forreste del af bagpote rører jorden. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Bagbenet fodvinklen (figur 2)
BEMÆRK: Der er en tydelig udviklingsmæssig ændring i bagbenet arbejdsstillinger som muse modnes fra kravle til fods, hvor baglemmer er placeret under kroppen, når du går og vinklen mellem baglemmer er mindre end vinklen ses i kravle. Selvom bagbenet fodvinklen ændrer sig over tid, kan museunger på samme alder med forskellig skade eller sygdomme sammenlignes. Svarende til ambulation test (3.1), er der ingen mulighed for at lære. Således kan bagbenet fodvinklen test gentages så mange gange som nødvendigt gennem løbet af eksperimentet.- Enten i en klar åben mark boks eller et lukket område, montere et videokamera nedefra eller ovenfra, henholdsvis at optage pup når det bevæger sig rundt på området. Brug blid prodding ved at røre hvalpen hale at motivere hvalpen at gå. Optag til to minutter.
- Ved hjælp af videooptagelser, måle foden vinkel hvalpene ved at trække en linje fra enden af hælen / skinnebenet til spidsen af den længste (midten) tå. Kun tage målingen, når hvalpen udfører en fuld skridtlængdei en lige linje, og begge fødder hviler fladt på jorden. Du må ikke tage målinger, mens hvalpen er stationær eller mens hvalpen er ved at vende.
- Mål tre til fem sæt mund vinkler og beregne den gennemsnitlige vinkel for hver testet hvalp.
Figur 2. bagben Foot Vinkel kan bruges til at bestemme abnorm gangart. Foden vinkel kan måles ved at trække en linje fra midten af hælen gennem midten (længste) ciffer. Tilskadekomne dyr har en større mund vinkel i forhold til normal (se Repræsentative resultater, Foot Angle). Klik her for at se en større version af dette tal.
- Surface oprettende (figur 3):
BEMÆRK: oprettende refleks er motoren evne til en mus pup at kunne vende på sine fødder fra rygleje. Den gennemsnitlige alder for opretningsrefleksen vises i gnavere er PND 5 med et interval fra PND 1 -. 10 15 Da denne test er en refleks, der er ingen lære komponent og det kan gentages i hele eksperimenter periode.- Placer unger på ryggen på en bomuld ark eller bænk pad og holde i stilling i 5 sek.
- Slip hvalpene og registrere den tid det tager hvalpen at vende tilbage til bugleje, samt retningen af oprettende (venstre eller højre). er givet i alt et min for hvert forsøg, hvis det er nødvendigt.
- Gentag for i alt tre forsøg.
Figur 3. Surface oprettende. Denne test kræver trunk kontrol og kan teste for posturale ubalancer. Humane CP patienter kan have underskud i deres kerne.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
- Negativ Geotaxis (figur 4)
BEMÆRK: Den gennemsnitlige alder for negative geotaxis refleks at dukke op i gnavere er PND 7 med et interval fra PND 3-15 15 Den negative geotaxis test vurderer motorisk koordination hos unge mus.. Mus er placeret nedad en skråning, og på grund vestibulære tidskoder af tyngdekraften, unger slå til ansigt op ad skråningen. Svaret på stimulus, eller taxier, er en medfødt adfærd.- Placer hvalpen med hovedet pegende nedad på en 45 o hældning og holde den nede i 5 sek.
- Slip hvalp og registrere tid og retning hvalpen vender sig mod opad. Samlet testtid er 2 min.
- Gentag for i alt tre forsøg. Mus, der falder ned hældning eller udebliver, kan være enten re-testet, elimineret eller givet en nul score.
BEMÆRK: Denne beslutning er left til eksaminator, som lejlighedsvis hvalpe vil rulle ned hældning på grund af søvnighed snarere end svaghed. Når beslutningen er truffet om, hvordan man score unger, der falder ned hældning, skal det bemærkes, i de metoder, og bør være konsekvent gennem test af alle fag.
Figur 4. Negativ Geotaxis. Motor og vestibulære input er nødvendig for musen til at erkende sin orientering på en skråning og vende rundt. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Front-lemmer Suspension (figur 5) 16; tilpasset fra 17, 18:
BEMÆRK: Front-lemmer suspension tester forben styrken af unger, herunder arm og pote styrke. Thans test anbefales ikke til hvalpe yngre end PND 10 15. Hvalpe får lov til at gribe en wire spændt på tværs over en stabil objekt og hænge på tråden med begge forpoter. Afprøvningen område er over en polstret drop zone. Testen kan afsløre højre / venstre side styrke forskelle. Læring og fraværet af negativ forstærkning kan føre til øget ikke-deltagelse. Mus falder øjeblikkeligt, når frigivet eller manglende forstå når det bringes i tråd er tegn på manglende deltagelse.- Hold hvalpene fast i kroppen og sætte dem i stand til at tage fat i tråden med begge forpoter.
- Slip hvalp. Ved hjælp af en timer eller stopur, registrere den samlede tid til at falde, samt pote svaghed.
BEMÆRK: Paw svaghed bestemmes, hvis en pup konsekvent falder fra tråden med en pote før det andet i stedet for frigørelse fra tråden med begge poter på samme tid. - Gentag testen for i alt tre gange.
Figur 5. Front-Limb Suspension. Denne suspension test forårsager spændinger i forbenene indtil muskeltræthed. Med denne fremgangsmåde, baseline styrke i forbenene er etableret. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Bagben Suspension (figur 6):
BEMÆRK: Denne suspension test afgør bagben styrke. Det er en test designet specielt til nyfødte og blev oprindeligt brugt på dyr mellem PND 2-12 19,20, men kan tilpasses til mus op til PND 14. Denne test kan afsløre højre / venstre bagbenenes styrke forskelle samt neuromuskulære funktion. En standard 50 ml konisk bruges, polstret med laboratorie klude. Svarende til front-lemmer suspension test, kan denne test læres, især syndce er der ingen negativ konsekvens af faldende. Således steg manglende deltagelse, som det ses af mus falder så snart frigivet eller manglende bo, når placeret på kanten af røret, kan bemærkes.- Ved hjælp af en 50 ml konisk, sted pup forsigtigt med forsiden nedad i røret med bagbenene hang over kanten.
- Slip hvalp. Overhold bagben kropsholdning.
- Score kropsholdning efter følgende kriterier.
BEMÆRK: Score på 4 indikerer normal bagben adskillelse med hale hævet; score på 3 betyder svaghed fremgår og baglemmer er tættere sammen, men de sjældent rører hinanden; score på 2 angiver baglemmer er tæt på hinanden og ofte rørende; score på 1 viser en svaghed fremgår og baglemmer er næsten altid i en foldede position med halen rejst; en score på 0 indikerer konstant Lukning af baglemmer med halen sænket eller manglende holde på røret for enhver tidsperiode. - Tælle trækker om nødvendigt. En pull er qualceret, når hvalpen forsøger at løfte sin krop ved hjælp af sine bagben mens ophængt på siden af den koniske rør.
- Ved hjælp af en timer eller stopur, optage latenstiden til at falde.
- Gentag hele testen i tre eksemplarer.
Figur 6. bagben Suspension. (A). Denne suspension test forårsager spændinger i baglemmer indtil muskeltræthed. Baseline styrke og kropsholdning i baglemmer er etableret. (B). Scoring. Bemærk tallene over de repræsentative mus demonstrerer mulige arbejdsstillinger score. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Gribestyrke (figur 7):
BEMÆRK: Denne test vil undersøge pote strength af alle fire poter på samme tid. En 16 x 18 glasfiber skærm tråd anvendes. Den gennemsnitlige alder for en gnaver at kunne gribe en horisontal skærm er PND 8 med et interval fra PND 5 - 15 15 Fox brugt fire lemmer horisontale skærmen test fra PND 2 -.. 21 10 Denne test er modificeret fra den standard vandrette skærmen test; her skærmen drejes langsomt fra en vandret til lodret position, at udfordre gribe af alle fire lemmer 21; tilpasset fra Corti S 16. Hvis musen holder på den mesh sigte, når inverteret til 180 °, optage latenstiden til at falde. Bemærk også, kropsvægten. En hængende impuls kan beregnes som [vægt (g) x latenstid til at falde (sek)] afspejler den nødvendige kraft til at modstå tyngdekraften.- Ved hjælp af et stykke trådnet, placere hvalpen på skærmen. Lad hvalpen til at tilpasse sig dette miljø i ca. 5 sek.
- Vend skærmen langsomt til 180 grader. Optag den omtrentlige angle af skærmen, når hvalpen falder af.
- Gentag for i alt tre forsøg, og gennemsnittet af forsøg.
Figur 7. Gribestyrke. Mus er forpligtet til at opretholde muskelspændinger i alle fire lemmer som tyngdekraften stiger. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Gribe Reflex (figur 8)
BEMÆRK: gribe refleks normalt vises i gnavere ved PND 7 med et interval fra PND 3-15 15 Hver pote testes individuelt, således testen kan afsløre front- eller bagbenenes spørgsmål, samt ensidighed spørgsmål.. Da det er en refleks, kan denne test gentages, indtil refleks vises. Det er ikke tilbøjelige til at lære. Som et vigtigt forbehold, denne test skelner ikke gribe styrke, kun evner, og skal testes før 15 dage gammel, da unge mus begynder at fatte grund til at frygte respons.- Hold musen ved harmoniske af halsen, på samme måde en mus pup bæres af dæmningen. Dette hold får hvalpen til at blive instinktivt immobile og afslappet, der giver mulighed for nem test.
- Slagtilfælde hver pote af hvalpen med stump, afrundet side af et barberblad.
- Test hver pote individuelt og registrere tilstedeværelsen eller fraværet af gribe og score 1 point per pote med hvilken musen griber.
BEMÆRK: scoring til højre pote præference er 100% for højre pote præference, - - -100% for venstre pote præference, 50% for begge poter gribe, og 0% for ingen poter gribe. Ligningen til at bestemme disse tal er [(højre pote - venstre pote) / (højre pote + venstre pote + begge poter)] x 100%.
/53569/53569fig8.jpg "/>
Figur 8. gribe Reflex. Fordi neonatale mus ikke har en stærk frygt reaktion, denne test strengt bestemmer plantar / palmar refleks. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Cliff Aversion (figur 9):
BEMÆRK: Cliff aversion tests labyrint reflekser, samt styrke og koordination og kan bruges til at teste unger fra PND 1-14 22. En præ-duftende kasse (en boks, hvor mindst 5 mus har fået lov til frit at strejfe) med en flad forhøjet afsats bruges, og hvalpen er placeret med cifrene kun deres forpoterne og deres snude placeret over kanten. Scoring udføres ved at tælle den samlede tid, det tager hvalpen til at vende væk fra klippen og flytte sine poter og snude væk fra kanten. Hvis der ikke respons ses efter 30 sek, afbrydes testen.Hvis hvalpen falder ud over kanten, kan en enkelt ekstra forsøg skal udføres.- Ved hjælp af et billede fra siden, skal du placere hvalpen på kanten af den præ-duftende kasse, og sørg for, at forpoterne, tal og snude er de eneste dele over kanten.
- Slip hvalp og start timeren.
- Når både snude og poter er blevet fjernet fra kanten, stoppe timeren og rekordtid.
- Gentag testen for i alt 3 forsøg. Hvis hvalpen ikke bevæger sig væk fra klinten inden 30 sek, er ingen score givet.
BEMÆRK: Bestemmelsen om hvalpen er en ikke-Deltager versus nedskrevne, er overladt til skøn eksaminator. Højden af klinten kan justeres for en alder af hvalpen at sikre hvalpen sikkerhed. En mindre højde kan bruges med en sort "gulv" for at emulere en større højde.
Figure 9. Cliff Aversion. vestibulære ubalancer måles ved hjælp klinten aversion test. Her er den hvalp øjne stadig lukket, så frygt ikke er den drivende faktor for at vende sig væk fra klinten kant. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Statistisk Betydning
- Ved hjælp af en statistisk software analysere resultaterne. Udtrykke dataene som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (SEM). Tests er parametrisk og dermed undersøge de data ved hjælp af t-test analyser.
BEMÆRK: Eksperimenter blev ikke designet til at teste for kønsforskelle. Forskelle betragtes som statistisk signifikant, når p <0,05.
Representative Results
Mus blev testet fra P7 (24 timer efter kirurgi) til P13 (1 uge efter kirurgi) med forskelligt mus for hvert tidspunkt, således at lære et test paradigme var ikke en confounding variabel. P8 blev valgt som repræsentative resultater, som mus viste de største underskud på dette tidspunkt.
Overgang fra Crawling til Gåture er forsinket i CP Neonatal mus
Humane CP patienter har gangart abnormiteter, der spænder fra tå-walking til en scissored gangart. Da denne CP model viser gangart underskud svarende til mennesker, blev ambulation vurderet. Musene blev scoret på gangart symmetri og lemmer-pote bevægelse under en lige gåtur. På 48 timer efter operation (PND 8), CP mus havde mindre symmetrisk bevægeapparatet og en "crawling" gangart i forhold til deres falske modstykker (gennemsnitlig ambulation score: CP 1,083 ±0,6337, n = 12 vs sham 1,639 ± 0,4859, n = 9; p <0,05, figur 10). En uge, har både CP og sham mus skiftet til walking (data ikke vist).
Figur 10. CP Mouse Hvalpe ikke ambulate samt Shams. Sham mus (sort bjælke) har en gennemsnitlig score på 1,639 ± 0,4859 (n = 9), hvilket betyder deres ambulant udvikling falder mellem asymmetrisk bevægeapparatet og langsom gennemgang. CP mus (grå bar) modtager en gennemsnitlig score på 1,083 ± 0,6337 (n = 12), hvilket betyder at deres ambulation er mindre udviklet, og tendens til at have asymmetrisk bevægeapparatet. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM; * Er p <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Hindlimb Foot Vinkel øges i CP
Foruden ambulation, blev bagben mund- vinkel vurderes. Otte dage gamle fingeret musen hvalpe gå med deres bagpoter vender fremad, i forhold til HIL mus, der har spredte bagpoter, når du går i en lige linie (Figur 2; gennemsnitlig vinkel: CP 77,48 ± 9,848, n = 9, vs fingeret 54,54 ± 8,043, n = 11; p <0,0001, figur 11). Denne forøgede vinkel korrelerer med gangart ustabilitet, idet hvalpene skal øge vinklen af deres bagpoter for at stabilisere deres gangart og bistå med balance og koordination.
Figur 11. CP Mouse Hvalpe defekter deres bagpoter når du går. CP mus (sorte bjælker) har en gennemsnitlig vinkel mellem deres bagben af 77,48 ± 8,043 (n = 11), mens sham mus (grå b ars) har en gennemsnitlig vinkel på 54,54 ± 9,848 (n = 9). Data er udtrykt som middelværdi ± SEM; **** Er p <0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
CP Mus ikke Vis Underskud når Surface oprettende
Overfladen oprettende test blev inkluderet som nogle CP patienter har nedsat trunk kontrol (Heyrman et al., 2013). Derudover er det vestibulære system er nødvendigt for at detektere behovet for oprettende og der er vestibulære underskud i visse CP patienter 23. CP-mus viser ikke signifikante underskud, når oprettende sammenlignet med sham kontroller (data ikke vist).
CP Mus Udfør det samme som Sham i Negative Geotaxis Testing
t "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Negativ geotaxis bruges til at teste motorik hos unge hvalpe Mus udfordres ved at være sted vender ned ad bakke på en skrånende overflade Forsinkelse eller manglende orientere ad bakke kunne tyde underskud.. i koordination, balance, eller vestibulære input. CP mus viser ingen underskud, når udfordret med negative geotaxis sammenlignet med sham-mus (data ikke vist). Derudover CP mus viste ikke en præference for at vende sig mod den ene side versus en anden, når re-orientering .Front-Limb Suspension Test er Passende for Mus Ældre end 10 dage
CP patienter har nedsat muskeltonus og underskud i finmotoriske færdigheder, såsom at fatte. For at teste svaghed i denne musemodel, brugte vi en front-lemmer suspension test. Desuden er denne model bruger kunne bestemmes unilateral iskæmisk skade og sidet-ness ved hjælp af denne suspension test. denne tester bedre for mus ældre end 10 dage 15. På 8 dage gamle, to dage efter skaden, var der ingen signifikante forskelle mellem CP og sham mus (data ikke vist).
Bagben Strength er faldet i CP Mus
Humane CP patienter har ofte brug for seler eller hjælpemidler walking enheder på grund af manglende motorisk kontrol og styrke. For at sammenligne den gnaver CP model til mennesker, blev bagben styrke vurderet ved anvendelse bagben suspensionsprøvning den. Når ophængt fra siden af en konisk rør, viste CP mus bagben svaghed, som påvist ved et fald i hængende score (bagben hængende score: CP 3,468 ± 0,5561, n = 13, vs sham 3,891 ± 0,1329, n = 13; p < 0,05, figur 12). Ingen forskel blev observeret i bagbenet suspension tid (data ikke vist). Således ligner menneskelige CP patienter, CP mus demonstrerer hindlIMB (ben) svaghed.
Figur 12. Sham Mus er Lidt, men væsentligt stærkere i deres bagben end CP Mus. Ved en gennemsnitlig hængende score på 3,891 ± 0,1329 (n = 13), sham mus (sort bjælke) vis flere bagben adskillelse, og derfor en stærkere bagben standpunkt, når hængende på kanten af et rør end CP mus (grå bar) med en gennemsnitlig hængende score på 3,468 ± 0,5561 (n = 13). Data er udtrykt som middelværdi ± SEM; * Er p <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Grip Styrke er faldet efter CP Skade
Gribning med alle fire poter er vigtigt for en gnaver iform af klatring og løber tværs ujævne overflader. Grip kræver betydelige vedvarende styrke, snarere end behændighed eller lineær kraft, hovedsagelig i cifrene og poter 24. Mus blev kræves for at holde deres kropsvægt på en omvendt wire mesh sigte. CP-mus var ikke i stand opretholde deres greb og disse mus faldt til betydeligt lavere vinkler (fire lemmer gennemsnitlige vinkel: CP 75,627 ± 24,48, n = 11, vs sham 96,57 ± 10.836, n = 9; p <0,05, figur 13). Disse data viser, at der er et betydeligt underskud i gribestyrke i CP-mus.
Figur 13. CP Mus har Svagere Grip end Shams. Sham mus (sort bjælke) kan fatte til en gennemsnitlig omvendt vinkel på 96,57 ± 10,836 (n = 9). CP mus (grå bar) kan kun nå en omvendt vinkel på 75,627 ± 24,48 (n = 11). Data er udtrykt som middelværdi ± SEM; * Er p0; 0.05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Gribe Reflex Underskud er tilsyneladende i CP Mus
Sammen med grovmotoriske underskud, er finmotoriske bevægelser også forringet i CP patienter 25,26. Den gribe refleks hos mennesker er til stede ved fødslen og forsvinder omkring 5 - 6 måneder. Men ændringer i gribe refleks, såsom overdreven hastighed eller styrken af greb, manglende fatte, eller reemergence af gribe refleks efter 6 måneders alderen, tyder alle skader på nervesystemet. At sammenligne gribe i CP model blev refleksive grådige underskud bestemmes.
På 48 timer efter skaden, CP mus demonstrerer et fald i gribe refleks (gennemsnit poter fattetpå 48 timer: CP 2,429 ± 0,9376, n = 14, vs fingeret 3,214 ± 0,8018, n = 14; p <0,05, figur 14A). Der var en lille, men ikke signifikant stigning i højre pote præference i forpoterne (data ikke vist). Der var en signifikant højre pote præference i bagpoter (CP 75,0 ± 42.74, n = 14, vs sham 17,86 ± 54,09, n = 14; p <0,005, figur 14B). En uge efter skade, CP mus viser gribe underskud (gennemsnit poter greb efter 1 uge: CP 2,75 ± 1,035, n = 8, vs sham 3,80 ± 0,6325, n = 10; p <0,05, figur 14C), uden bemærkelsesværdig paw præference .
Figur 14. CP Mus har gribe underskud, i bagpoter, kontralateral til den forurettede Brain Region. (A) 48 timer efter skade (PND 8), CP mus (grå bar) fatte en pind med i gennemsnit færre poter end fingeret animals (sort bjælke). (B) CP mus (grå bar) viser en præference for at gribe med højre bagpote (kontralateral til skade) i modsætning til ved hjælp af den venstre bagpote (ipsilaterale til skade). Sham mus (sort bjælke) ikke vise denne højre pote præference. Right pote præference er beregnet som ([højre pote - venstre pote] / [right pote + venstre pote + begge poter] * 100) (C) En uge efter skade, CP mus (grå bar) viser stadig fatte underskud i forhold til. Shams (sort bar). Data er udtrykt som middelværdi ± SEM; * Er p <0,05, ** er p <0,005. Klik her for at se en større version af dette tal.
CP Mus vende væk fra Edge Under Cliff Aversion
Klinten aversion test er afhængig af iboende frygt for mus til at vende awaå fra en stejl klippe og hovedet mod sikkerhed. Selv om nogle CP patienter har vestibulære problemer samt forringet motorisk kontrol, har CP musene ikke vise underskud på denne test.
Discussion
Brug dyremodeller til at studere humane sygdomme er kun relevant, hvis der er overlap mellem den cellulære og molekylære respons mellem menneske og gnaver, og at de adfærdsmæssige test udført har direkte relevans for menneskelige symptomer. Et af de store problemer med pædiatriske undersøgelser sygdom er, at mange forskere bruger voksne gnavere til at skabe den model, samt voksne gnaver adfærdsmæssige vurdering, uden at overveje de udviklingsmæssige forskelle, der kan være vigtige for sygdomsprocessen. På grund af disse problemer, er det vigtigt, at forskning i pædiatrisk brug sygdom ikke kun den rette justerede udviklingsmæssige tidspunkter (f.eks menneskelig CNS udvikling på 28 - 32 uger svarer til en post-natal dag 2 - 7 dage gnaver) 7, men også adfærdsmæssige test, der vil undersøge passende motor, sensoriske eller refleksive udviklingsmæssige adfærd. Således som hver ny neonatal sygdom model er udviklet, skal det grundigt testet for at sikre, at den cellulæreog adfærdsmæssige reaktioner vil give den mest hensigtsmæssige oversættes data mellem gnaver og menneske.
Cerebral parese er en motor lidelse, der fortsætter ind i voksenalderen. Et problem med mange af de cerebral parese modeller til rådighed i dag, er manglen på gentagelig, standardiseret motor test, der kan korrelere med underskud set i pædiatriske patienter. I denne nye model, der kombinerer hypoxi, iskæmi og inflammation i en neonatal mus, blev motorisk adfærd evalueret under anvendelse af et batteri af tests specifikke for neonatale mus. For at mindske subjektivitet og øge den kvantitative rapportering, har flere undersøgelser blevet modificeret til at omfatte meget specifikke, men let at evaluere foranstaltninger, som kan standardiseres. Desuden kan front- og bagbenenes evalueringer udføres separat, og venstre / højre forskelle kan bestemmes. Dette batteri af tests er specifik for neonatale mus op til to uger.
Denne CP model demonstrerergangbesvær (mobilisering, bagben fod vinkel), samt led-specifik svaghed (fire lemmer suspension, bagben suspension), og underskud i udviklingsmæssige reflekser (gribning refleks). Selv om der i denne undersøgelse kun én tidspunkterne blev undersøgt, kan disse underskud spores over tid.
Der er andre batterier af tests, der kan bruges på den nyfødte, såsom Fox batteri af tests eller Heyser vurdering af udviklingsmæssige milepæle 15. Men disse tests sammenligner den nyfødte til voksne, hvis responser kan ikke være den samme, fordi den nyfødte stadig er under udvikling. Fox batteri og Heyser s Assement tests stole på observationelle subjektive oplysninger med dichotomous (ja eller nej) vurdering, snarere end objektive data (vinkel, kropsholdning baseret på styrke, osv). På grund af den subjektivitet fra disse tests, har mange forskere tilpasset, tilsat eller fjernet kriterier, og dermed gøre deres resultater uforlignelige til andre og grænseing nytten af data i form af oprettelse af en baseline underskud for en bestemt sygdom eller lidelse. Ved at etablere et sæt af standardiserede motoriske tests, der er kvalitative og specielt designet til at teste nyfødte, kan resultaterne fra de enkelte forskergrupper nøjagtigt og pålideligt rapporteret og sammenlignet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | STRAIN CODE: 027 | C57BL/6NCrl is the exact strain we use |
| Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish | Corning Life Sciences Glass | 3140125 | Capacity: 25.03 oz. (740ml); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399). |
| Covered lead ring | Fisher Scientific | S90139C | Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish. |
| Scalpel Blade #11 | World Precision Instrucments, Inc. | 500240 | |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Micro Hook | Fine Science Tools | 10064-14 | |
| Vetbond Suture Glue | 3M | 1469SB | n-butyl cyanoacrylate adhesive |
| Lipopolysaccharide | Sigma Life Science | L4391 | Lipopolysaccaride from E.coli 0111:B4, gamma irradiated |
| 12 x 12 inch opaque box | Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics | C4022 | Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H; http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html |
| Camera/camcorder | JVC | GC-PX100BUS | Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder. |
| Covidien Tendersorb™ Underpads | Kendall Healthcare Products Co | 7174 | |
| WypAll L40 | Kimberly-Clark Professional | 5600 | Any surface with moderate grip will do |
| Surface at 45 degree incline | We use a cardboard box. | ||
| Thin wire from a pipe cleaner | Creatology | M10314420 | Any pipe cleaner from any craft store will work. |
| 50mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| Fiberglass Screen Wire | New York Wire www.lowes.com | 14436 | Any supplier can be used as long as their screen is 16 x 16 or 18 x 16 |
| Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work. |
| OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway | PLASKOLITE INC | 1AG2196A | Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2" x 2"; (3) 2" x 18"; (1) 2" x 15.5"; (1) 2" x 3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning. |
| Protractor | Westscott | ACM14371 |
References
- Nakamura, M., Bregman, B. S. Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury. Exp Neurol. 169 (2), 407-415 (2001).
- Widenfalk, J., Lundströmer, K., Jubran, M., Brene, S., Olson, L. Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid. J Neurosci. 21 (10), 3457-3475 (2001).
- Fernández-Lòpez, D., Faustino, J., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Cusick, C. G. Extensive cortical reorganization following sciatic nerve injury in adult rats versus restricted reorganization after neonatal injury: implications for spatial and temporal limits on somatosensory plasticity. Prog Brain Res. 108, 379-390 (1996).
- Barrett, C. P., Donati, E. J., Guth, L. Differences between adult and neonatal rats in their astroglial response to spinal injury. Exp Neurol. 84 (2), 374-385 (1984).
- Villapol, S., Gelot, A., Renolleau, S., Charriaut-Marlangue, C. Astrocyte Responses after Neonatal Ischemia: The Yin and the Yang. Neuroscientist. 14 (4), 339-344 (2008).
- Craig, A., Ling Luo, N., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Exp Neurol. 181 (2), 231-240 (2003).
- Shen, Y., Liu, X. B., Pleasure, D. E., Deng, W. Axon-glia synapses are highly vulnerable to white matter injury in the developing brain. J Neurosci Res. 90 (1), 105-121 (2012).
- Shen, Y., Plane, J. M., Deng, W. Mouse models of periventricular leukomalacia. J Vis Exp. (39), (2010).
- Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
- Tremml, P., Lipp, H. P., Müller, U., Ricceri, L., Wolfer, D. P. Neurobehavioral development, adult openfield exploration and swimming navigation learning in mice with a modified beta-amyloid precursor protein gene. Behav Brain Res. 95 (1), 65-76 (1998).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72 (2), 251-264 (1974).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Del Bigio, Long-term motor deficit following periventricular hemorrhage in neonatal rats: A potential model for human cerebral palsy. J Cerebr Blood F Met. , (2005).
- Williams, E., Scott, J. P. The Development of Social Behavior Patterns in the Mouse, in Relation to Natural Periods. Behaviour. 6 (1), 35-65 (1954).
- Heyser, C. J. Assessment of developmental milestones in rodents. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. Q., et al. Chapter 8, (2004).
- Corti, S. Grip strength TREAT-NMD: Experimental protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ (2014).
- Corti, S., Nizzardo, M., et al. Neural stem cell transplantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 118 (10), 3316-3330 (2008).
- Grondard, C., Biondi, O., et al. Regular exercise prolongs survival in a type 2 spinal muscular atrophy model mouse. J Neurosci. 25 (33), 7615-7622 (2005).
- El-Khodor, B. F. Behavioral Phenotyping for Neonates. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
- El-Khodor, B. F., Edgar, N., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212 (1), http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ 29-43 (2008).
- Venerosi, A., Ricceri, L., Scattoni, M. L., Calamandrei, G. Prenatal chlorpyrifos exposure alters motor behavior and ultrasonic vocalization in CD-1 mouse pups. Environ Health. 8 (12), (2009).
- Hill, J. M., Lim, M. A., Stone, M. M. Developmental milestones in the newborn mouse. Neuromethods 39: Neuropeptide Techniques. , Humana Press. New Jersey. (2008).
- Visual dependence influences postural responses to continuous visual perturbation in adults with spastic cerebral palsy. Yu, Y., Keshner, A. E., Tucker, C. A., Thompson, E. D., Lauer, R. T. Combined Sections Meeting of American Physical Therapy Association, Anaheim, CA, USA, , (2016).
- Carlson, G. The use of four limb hanging tests to monitor muscle strength and condition over time. Experimental Protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.005.pdf (2011).
- Gordon, A. M., Duff, S. V. Relation between clinical measures and fine manipulative control in children with hemiplegic cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 41 (9), 586-591 (1999).
- Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int J Pediat. , (2012).
