Introduction
פיתוח דגמים חדשים של פגיעה בילדים או מחלה באמצעות מכרסמים לעתים קרובות קשה בשל היכולת המדהימה של שני החולדות והעכברים להתאושש במהירות מפציעת נוירולוגיות. לכן, על מנת לאמת את כל מודל מחל ילדים חדש, ביסודיות בחינת שינויים התאיים ומולקולריים חייבים ללכת יד ביד עם תוצאות התנהגותיות. במובנים רבים, התאוששות התנהגותי פונקציונלית עשויה להיות חשובה יותר מאשר שינויים הסלולר בסיסיים מבחינת הרלוונטיות טיפולית או translational. ככל שהחוקרים לומדים יותר על פגיעה המבוגר הילוד, ברור כי התגובות שלהם שונות מאוד ולא ניתן להסיק בין השניים. לדוגמה, עכברים בילוד להציג רמות שונות של גורם הגדילה העצבי, גורם נוירוטרופי שמופק מהמוח, neurotrophin-3 ותא גליה גורם נוירוטרופי קו הנגזרות הבאים פגיעה בחוט השדרה 1,2. בנוסף, יש בילודים דליפת מחסום הדם-מוח משמעותית לאחר שבץ 3, דemonstrate התארגנות נוירון קורטיקלי לאחר פגיעה עצבית היקפית 4, ויש לי astrogliosis מתעכב או האטה בעקבות פגיעה בחוט השדרה היפוקסיה-איסכמיה 5,6. לכן, חשוב כי מחקר ילדי translational להשתמש דגמים דומים מבחינה התפתחותית וכי מודלים אלה מוערכים לשני שינויי הסלולר / המולקולריים בדיקות התנהגותיות מותאם לגיל.
שיתוק מוחין (CP) היא הפרעה מוטורית המשפיעה 3: 1000 לידות חי בשנה (NIH). ילדים עם שיתוק מוחות להפגין מגוון של סימפטומים ותנאי שיתוף חולני, בהתאם לחומרת המחלה. קושי עם תנועה וקואורדינציה הם הסימנים הנפוצים ביותר, יחד עם בעיכובים בהגעה לאבני הדרך ההתפתחותיות המנוע. סימנים אחרים כוללים טונוס שרירים תקין (הגדלה או הקטנה), הקטינה מוטוריקה עדינה, קשיי הליכה, ריור יתר ובליעה, ועיכובים דיבור (NIH). סיבת CP הבסיסית היא ככל הנראהחוסר החמצן ו / או זרימת דם למוח בתקופת טרום או peripartum, או עד לאחר הלידה של שנה אחת. בנוסף, דלקת הוא האמין עכשיו להיות מרכיב מרכזי בהתפתחות של CP.
רוב מקרי CP המשויכים נזק בחומר הלבן סביב החדרים, המכונה לויקומלציה periventricular (PVL). סימן היכר נוירולוגיות הדבר מצביע על כך העלבון הראשוני המובילה לעמדת פיקוד מתרחש בתקופה של התפתחות המוח כאשר oligodendrocytes הפגיע ביותר להעליב. תקופת הצמיחה המהירה oligodendrocyte אדם, גם בתקופה שבה oligodendrocytes הם רגישים ביותר על פשע, הוא בין 24 - 32 שבועות הריון. המכרסם, בתקופה המקבילה היא שלאחר לידת ימים 2 - 7 7, והוא כאשר CP מושרה במודל זה.
מודל העכבר בילוד של CP כי שמש לנהל את הבדיקות המתוארות כאן משלב היפוקסיה ו איסכמיה עם דלקת ליצור injאורי מחקה תגבור הניוון המוחיה לראות CP אדם. מודל זה כמה כתובות של החסרונות המשמעותיים נצפו במודלים של בעלי חיים אחרים של CP, אשר חסרים גירעונות מנוע ברורים דומים חולי CP אדם, כמו גם ניזק בחומר לבן ברור. מחקרים קודמים על ידי משתף פעולה באמצעות אותו מודל הוכיחו כי תוספת של דלקת משפר נזק בחומר הלבן, ובכך טוב יותר מחקה את PVL אצל ילדים עם CP 8. בונה על הנתונים הקודמים, נייר זה מציג סוללה מקיפה של בדיקות מנוע בילוד כדי להעריך את שינויי התנהגות מוטורית כפי הגילים החיים.
Protocol
הערה: כל הניתוחים בבעלי חיים בוצעו בהתאם אוניברסיטת טמפל של תואר בלבד מחלקת ומדיניות IACUC והנהלים. C57BL / 6 סכרים sires נרכשו מ צ'ארלס ריבר מעבדות ו שוכנו כלובי-הגידול עם מחזור אור 12 שעות / חושך (אור על 7:00 - 19:00) עם גישה חופשית למזון ומים. זוגות רבייה מיוצרים בגדלי המלטה בין 5 - 10 גורים.
1. ניתוח אינדוקציה שיתוק מוחין
- הערה: שיתוק מוחין הושרה באמצעות שלאחר הלידה יום (PND) 6 גורים עכבר, כפי שתואר לעיל 8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia).
- מניח גור בקערת זכוכית על קרח עם מעבדה לנגב כדי להגן על העור של הגור. בדקו אם מטוס הרדמה מתאים ברגל קמצוץ וחוסר התנועה. הזז את הגור על שקית קרח מרופדת לניתוח.
- לעקר את העור של הגור באמצעות 70% אתנול. כאשר יבש, להשתמש בלה ניתוח סטרילי 11 #דה ולעשות חתך 1 ס"מ בצוואר.
- באמצעות מיקרוסקופ כירורגי סטריאוסקופית, לבודד את עורק התרדמה המשותף תקין עם וו קטן ולליבון באמצעות cauterizer ניידים המוחזק ביד. ראייה מאשר כי העורק האפיל. ניתוח דמה כולל ויזואליזציה ובידוד של עורק התרדמה המשותף ללא צריבה.
- ליישר מחדש את העור וקרוב דבק תפר באמצעות (n-בוטיל cyanoacrylate).
- מניחים את הגור על כרית חימום C 34 o למשך 30 דקות כדי לפקח לנשימה ספונטנית תנועה נורמלית.
- החזר את הגור (ים) לסכור למשך 30 דקות.
- מניח את הגורים על כרית חימום או מכשיר התחממות אחר נקבע על 34 מעלות צלסיוס בתוך תא היפוקסיה נקבע חמצן 6% במשך 35 דקות. חמצן מוחלפת חנקן. לעקוב מקרוב אחר רמת החמצן בתא וטמפרטורה עבור תוצאות פגיעה עקבית.
- הסר את הגורים מאולם היפוקסיה ולהחזירם כרית החימום.
- Intraperitoneally להזריק lipopolysaccharide מדולל מלח סטרילית ב 1 מיקרוגרם / ק"ג ולהחזיר את הגור אל הסכר. זריקות שאם הם זריקות של תמיסת מלח בלבד.
2. בדיקות הילודים Motor
הערה: על PND 8, 48 שעות לאחר אינדוקצית CP, גורי עכבר נבדקים לפיתוח נוירו-התנהגותיות. גורים נבדקים בתוך בלוק hr 4 לפני הצהריים כדי לחסל זמן של הבדלי יום בהתנהגות. גורים יוסרו מן הסכר עבור לא יותר מ -15 דקות בכל פעם, כדי למנוע איבוד מהיר של בעיות חום גוף ורעבה / פרדה. בנוסף, גורים מותר לנוח בין בדיקות כך שמאמצים מקסימאליים יהיו שהושרו על כל בדיקה. הבסיס של בדיקות מנוע בילוד מותאם באמצעות הסוללה של הפוקס של בדיקות 10,11 ו לאימוצו של Wahlsten של הבדיקות של פוקס 12, וכן התייחס-NMD ופרסומי התנהגות אחרת (כפי שצוין בטקסט עבור כל בדיקה). הסוללה של בדיקות של הפוקס מתאימה PND 2 - 21. הבדיקות של פוקס, הבלילהy מייצג כאן כולל: ליישר רפלקס, אחיזת רפלקס, geotaxis השלילי (נקרא מבחן מסך אנכי הסוללה של פוקס) וכוח אחיזה ארבעה גפיים (שונה מן פוקס Wahlsten בדיקות טיפוס מסך של). הנה, ambulation, מול גפת כוח, וכוח hindlimb נבדקים גם להבחין התנהגות מוטורית רפלקסיבית בין גורי עכבר זיוף ו CP. כדי לחסל שיפורים על בדיקות עקב למידה, בדיקות הוגבלו עד למקסימום של 3 ניסויים שבהם צוין אחרת. כל הבדיקות האחרות היו רק משפט אחד לכל חיה.
- Ambulation (איור 1) (עיבוד פרוטוקול עכברוש 13):
הערה: זחילה היא התנהגות פתחה מוקדם את הגור והעכבר בין PND 5 - 0, ובנקודת עכברים מתחילים לעבור הליכה, בין 5 - 10 ימים בת 14. בשעת PND 8, מבחן ambulation מנצל כמובן זמן מעבר זה. Ambulation ניתן, עם זאת, להיות בקיע לאורך כל החיים של עכבר ניתן לקבוע בכל גיל.מאחר ואין פוטנציאל ללמידה, המבחן ambulation ניתן לחזור כמה פעמים לפי הצורך באמצעות מהלך הניסוי.- עכברי מקום במארז ברור לאן עכברים גלויים מלמעלה כמו גם בצד. השתמש דרבון עדין ידי נגיעת הזנב של הגור להניע את הגור ללכת.
- ציון ambulation 3 דקות באמצעות הסולם הבא: 0 = אין תנועה, 1 = שורץ תנועת איבר סימטרית, 2 = זחילה איטית אך תנועת איבר סימטרית, ו -3 = מהר זוחל / הליכה.
הערה: כאן, תנועת איבר סימטרית מתוארת שם hindpaws לפגוש frontpaws במהלך כל שלב, וכל צעד חלק מעבר לשלב הבא. עכבר המוצג תנועת איבר סימטרית למיקום כפה יציב ומעברי משלב אחד למשנו אינם חלקים.
איור 1. המעברזחילה ל'הליכה ניתן להבחין על ידי התבוננות Hindpaw, כמו גם את הראש והזנב. (א) במהלך זחילה, כולו בחזרה כפה, מן הבהונות אל העקב, נוגע בקרקע כאשר ambulating, כמו כונה על ידי (*). דפוס הליכה מבוגר אפשר לראות כאשר רק הבהונות ואת החלק הקדמי של hindpaw לגעת בקרקע (העקב מוגבה, deonoted ידי [**]). (ב) ראש וזנב של עכבר זוחל הוא סמוך לקרקע. הראש מתחיל לעלות במהלך המעבר שבין זחילת הליכה. המעבר יושלם כאשר הוא את הראש והזנב מרומם ורק החלק הקדמי של hindpaw נוגע בקרקע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- Hindlimb רגל זווית (איור 2)
הערה: ישנה שינוי התפתחותי לכאורה בתנוחת hindlimb כמו mousדואר מתבגר שבין זחילת הליכה, שבו hindlimbs ממוקם מתחת לגוף בעת הליכה ואת הזווית בין hindlimbs היא פחות הזווית לראות זחילה. למרות זווית hindlimb הרגל משתנית במשך זמן, גורי עכבר בנים אותו הגיל עם פציעה או מחלות שונות ניתן להשוות. בדומה למבחן ambulation (3.1), אין פוטנציאל ללמידה. לפיכך, המבחן זווית hindlimb רגל ניתן לחזור כמה פעמים לפי הצורך באמצעות מהלך הניסוי.- כך או בקופסה בשטח פתוח ברורה או במתחם סגור, הר מצלמת וידאו מלמטה ומעלה, בהתאמה, כדי להקליט את הגור כפי שהוא נע סביב השדה. השתמש דרבון עדין ידי נגיעת הזנב של הגור להניע את הגור ללכת. שיא עבור שתי דקות.
- באמצעות הקלטות וידאו, למדוד את זווית הרגל של הגורים על ידי ציור קו מהסוף של העקב / במותנו אל קצה הבוהן (באמצע) הארוך ביותר. רק לקחת את המדידה כאשר הגור מבצע צעד מלאבקו ישר ואת שתי הרגליים שטוחות על הרצפה. אל תיקח מדידות בעוד הגור הוא נייח או בעוד הגור מסתובב.
- מודד שלושה חמש קבוצות של זוויות רגל ולחשב את הזווית הממוצעת עבור כל גור נבדק.
איור 2. Hindlimb רגל זווית יכולה לשמש כדי לקבוע חריגות בהליכה. זווית הרגל יכול להימדד על ידי ציור קו מאמצע העקב דרכה במרכז (הארוכה) ספרות. בעלי חיים פצועים יש זווית רגל גדולה יותר בהשוואה למצב נורמלי (ראה נציג תוצאות, רגל זווית). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- ליישר שטח (איור 3):
הערה: רפלקס ליישר הוא היכולת המוטורית עבור גור עכבר כדי להיות מסוגל לעשות היפוך על רגליו מעמדת שכיבה. הגיל הממוצע של רפלקס ליישר להופיע במכרסמים הוא PND 5 עם טווח שנע בין PND 1 -. 10 15 כפי המבחן הזה הוא רפלקס, אין מרכיב למידה וזה ניתן לחזור לאורך כל תקופת התנסות.- מניח גורים על גבם על כרית סדין או ספסל כותנה והחזק אותו במקומו למשך 5 שניות.
- שחרר את הגורים ולהקליט את משך הזמן שלוקח את הגור לחזור אפרקדן, כמו גם בכיוון של תיקון (ימינה או שמאלה). סה"כ דקות אחד ניתן עבור כל ניסוי, אם יש צורך בכך.
- חזור עבור סכום כולל של שלושה ניסויים.
ליישר Surface איור 3.. בדיקה זו דורשת שליטת מטען ועשויה לבדוק חוסר איזון ביציבה. חולי CP אדם יכולים להיות גירעונות הליבה שלהם.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- Geotaxis שלילי (איור 4)
הערה: הגיל הממוצע עבור רפלקס geotaxis השלילי להופיע במכרסמים הוא PND 7 עם טווח שנע בין PND 3 - 15 15 מבחן geotaxis השלילי מעריך קואורדינציה מוטורית בעכברים צעירים.. עכברים ממוקמים מול במורד מדרון, עקב רמזי שיווי משקל כובד, גורים מפנים את פניהם במעלה המדרון. התגובה לגירוי, או מוניות, היא התנהגות מולדת.- מניחים את הגור עם ראשו מזדקר כלפי מטה על מדרון 45 o והחזק אותו במשך 5 שניות.
- שחרר את הגור ולהקליט את הזמן וכיוון את הגור פונה כלפי מעלה. זמן הבדיקה הכולל הוא 2 דקות.
- חזור עבור סכום כולל של שלושה ניסויים. עכברים שנופלים במדרון או אינם מצליח לייצר יכולים להיות מחדש נבדקים, בוטלו, או מקבלים ציון אפס.
הערה: החלטה זו הינה lהעברה בנקאית אל הבוחן, כמו לעתים גורים יגלגלו במורד השיפוע עקב ישנוני ולא חולשה. לאחר קבלת ההחלטה על איך להבקיע גורים שנופלים במדרון, יצוין בשיטות וצריכים להיות עקבי לאורך הבדיקה של כל הנושאים.
איור 4. שליליות geotaxis. מנועיים קלט שיווי המשקל נדרש בעכבר כדי לזהות את האוריינטציה שלו על מדרון ולהסתובב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- מתלה קדמית גפה (איור 5) 16; עיבוד 17, 18:
הערה: ההשעיה גפה קדמית לבחון את מידת חוסנה forelimb של הגורים, כולל הזרוע וכוח כפה. T הבדיקה שלו אינה מומלצת גורים מתחת לגיל PND 10 15. Pups רשאים לתפוס חוט שנמתח על פני אובייקט יציב ולתלות על חוט עם שתי כפות רגליו הקדמיות. אזור הבדיקות נגמר אזור צניחה מרופד. הבדיקה יכולה לזהות הבדלי כוח צד ימין / שמאל. לימוד והיעדר חיזוק שלילי יכול להוביל לאי-השתתפות מוגברת. עכברים נופלים מייד כאשר שוחררו או חוסר היכולת להבין כאשר הניח על החוט מעידים על אי-השתתפות.- החזק את הגורים בתקיפות על ידי הגוף ולאפשר להם לתפוס את חוט עם שתי כפות רגליו הקדמיות.
- שחרר את הגור. באמצעות טיימר או סטופר, להקליט את סך כל הזמן ליפול, כמו גם חולשה כפה.
הערה: חולשת Paw נקבעה אם גור נופל באופן עקבי מן החוט עם כפה אחד לפני השני ולא משחרר מן החוט עם שני כפותיו בעת ובעונה האחת. - חזור על בדיקה עבור סכום כולל של שלוש פעמים.
er.within-page = "1"> 
איור 5. מתלה קדמי גפה. השעיה זו בדיקה גורמת מתח forelimbs עד עייפות שרירים. עם גישה זו, כוח ההתחלתי של forelimbs מבוסס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- השעית Hindlimb (איור 6):
הערה: בדיקת השעיה זו קובעת כוח hindlimb. זוהי בדיקה תוכננה במיוחד עבור תינוקות ו שמשה בתחילה על בעלי חיים בין PND 2 - 12 19,20, אבל יכולה להיות מותאמת עבור עכברים עד PND 14. בדיקה זו יכולה לזהות הבדלי כוח hindlimb ימין / שמאל וכן פונקציה תוקפת. בצורת קונוס 50 מיליליטר תקן משמש, מרופד מגבוני מעבדה. בדומה למבחן המתלה הקדמי גפה, בדיקה זו ניתן ללמוד, במיוחד חטאce אין תוצאה שלילית כדי נפילה. לפיכך, גדל אי-השתתפות, כפי שניתן לראות על ידי עכברים נופלים ברגע שוחרר או כישלון להישאר כאשר הניחו על קצה הצינור, ניתן לציין.- שימוש גור 50 מיליליטר חרוטים, מקום עם הפנים כלפי מטה בעדינות לתוך הצינור עם הרגליים האחוריות שלה תלוי מעל השפה.
- שחרר את הגור. שים את היציבה hindlimb.
- ציון יציב על פי הקריטריונים הבאים.
הערה: ציון של 4 מציינת פרדת hindlimb נורמלית עם הזנב המורם; ציון של 3 פירושו חולשה ניכרת ו hindlimbs הם קרובים יותר זה לזה, אבל הם לעתים רחוקות נוגעים זה בזה; ציון של 2 מציין hindlimbs הם קרובים זה לזה ולעיתים קרובות נוגע ללב; ציון של 1 מציג חולשה ניכרת ואת hindlimbs הוא כמעט תמיד בעמדה שלובה עם הזנב המורם; ציון של 0 מציין חיבוק מתמיד של hindlimbs עם הזנב וריד או הכישלון להחזיק את הצינור לכל תקופת זמן. - הרוזן מושך במידת הצורך. לגימה היא qualified כאשר הגור מנסה להרים את הגוף שלה באמצעות hindlimbs שלה בעודה מושהה בצד של צינור החרוטים.
- באמצעות טיימר או סטופר, להקליט חביון ליפול.
- חזור על הבדיקה כולה בשלושה עותקים.
איור 6. השעיה Hindlimb. (א). מבחן השעיה זה גורם מתח hindlimbs עד עייפות שרירים. כוח והיציבה Baseline ב hindlimbs מבוססים. (B). ניקוד. הערת המספרים מעל עכברי נציג הוכחת התוצאה היציבה האפשרית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- כוח האחיזה (איור 7):
הערה: בדיקה זו תבחן את הים כפהtrength של ארבע רגליים בעת ובעונה אחת. A 16 x חוט מסך 18 פיברגלס משמש. הגיל הממוצע עבור מכרסם להיות מסוגל לתפוס מסך אופקי הוא PND 8 עם טווח שנע בין PND 5 - 15 15 פוקס בשימוש מבחן המסך אופקי ארבעה איבר מן PND 2 -.. 21 10 בדיקה זו היא שונה מן הסטנדרט אופקי מבחן בד; המסך כאן הוא הסתובב באיטיות מתוך אופקי למצב אנכי, לקרוא תיגר על אחיזה של כל ארבעת הגפיים 21; עיבוד קורטי S 16. אם העכבר נאחז מסך הרשת כאשר הפוכים ל -180 מעלות, להקליט חביון לנפול. כמו כן, שים את משקל הגוף. דחף תלויים ניתן לחשב את [משקל (גרם) חביון x ליפול (sec)] המשקף את הכוח הדרוש כדי להתנגד לכוח הכבידה.- באמצעות פיסת רשת תיל, למקם את הגור על המסך. אפשר את הגור להסתגל לסביבה זה למשך כ 5 שניות.
- הפוך את המסך לאט ל -180 מעלות. רשום את angl המשוערדואר של המסך כאשר הגור נופל.
- חזור עבור סכום כולל של שלושה ניסויים ומחשבים את הממוצע של הניסויים.
איור 7. גריפ כוח. עכברים נדרשים לקיים מתח שרירים בכל ארבעת הגפיים כמו עליות כוח הכבידה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- אחזתי רפלקס (איור 8)
הערה: רפלקס האחיזה מופיעה בדרך כלל במכרסמים ב PND 7 עם טווח שנע בין PND 3 - 15 15 כפה כל נבדק בנפרד, ובכך הבדיקה יכולה לחשוף בעיות קדמיות או hindlimb, כמו גם בנושאים צדדיים.. כמו כן, הוא רפלקס, בדיקה זו ניתן לחזור עד רפלקס מופיע. זה לא נוטה ללמוד. בתור אזהרה חשובה, המבחן הזה אינו מבחין כוח אחיזה, רק יכולת, חייב להיבדק לפני 15 ימים של גיל כאשר עכברים לנוער מתחילים לתפוס בשל חשש תגובה.- החזק את העכבר על ידי בעורפו שלה, בדומה לאופן שבו גור עכבר מתבצע על ידי הסכר. אחיזה זו גורמת את הגור להיות נייח אינסטינקטיבית ורגוע, המאפשר על מנת להקל על הבדיקה.
- שבץ כל כפה של הגור עם קהה, מעוגל בצד של סכין גילוח.
- בדוק כל כפה בנפרד ולהקליט את קיומו או אי קיומו של אחיזה וציון 1 נקודה לכל כפה שבה בלגימות העכבר.
הערה: הניקוד עבור העדפת כפה ימנית הוא 100% עבור העדפת כפה ימנית, - - -100% עבור העדפת כפו שמאלית, 50% עבור שני כפותיו אחיזה, ו 0% ללא כפות אחיזה. המשוואה כדי לקבוע את המספרים האלה היא [(כפה ימנית - כפו השמאלית) / (כפה ימנית + שמאל כפה + שני כפותיו)] x 100%.
/53569/53569fig8.jpg "/>
איור 8. אחזה רפלקס. כי אין עכברים בילוד תגובת פחד חזק, בדיקה זו בהחלט קובע את רפלקס בבינסקי / כף היד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- קליף שנאה (איור 9):
הערה: בדיקות סלידה קליף מבוך רפלקסים, כמו גם כוח וקואורדינציה והוא יכול לשמש כדי לבדוק את הגורים מן PND 1-14 22. תיבה טרום ריחנית (קופסה שבה מינימום של 5 עכברים כבר מותר לשוטט בחופשיות) עם מדף מוגבה שטוח משמשת את הגור ממוקם עם הספרות בלבד של הרגליים הקדמיות שלהם החוטם שלהם ממוקם מעבר לקצה. ניקוד מבוצע על ידי ספירת הזמן הכולל הנדרש את הגור כדי להתרחק הצוק להניע את הכפות ולחרטום מהקצה. אם אין תגובה נתפסת לאחר 30 שניות, הבדיקה מסתיימת.אם הגור נופל מחוץ לקצה, משפט נוסף יחיד יכול להתבצע.- באמצעות מבט מצד, למקם את הגור על המקצה הרחב מראש בניחוח, ולוודא כי הקדמית, ספרות החוטם הם החלקים רק מעבר לקצה.
- שחרר גור ולהתחיל טיימר.
- לאחר שני החוטם ואת הכפות הוסרו מהקצה, לעצור את הזמן טיימר ולהקליט.
- חזור על בדיקה עבור סכום כולל של 3 ניסויים. אם הגור לא להתרחק צוק תוך 30 שניות, ללא ציון הוא נתון.
הערה: הקביעה אם הגור הוא-משתתף שאינו לעומת פגום שנותר עד פי שיקול דעתו של הבוחן. גובה המצוק ניתן מותאם לגיל של הגור כדי להבטיח את בטיחותם של הגור. לגובה קטן ניתן להשתמש עם "רצפה" שחורה לחקות לגובה רב יותר.
Figurדואר 9. קליף שנאה. חוסר איזון שיווי משקל נמדד באמצעות מבחן סלידת צוק. הנה, העיניים של הגור עדיין סגורות כך שפחד הוא לא הגורם המניע להפנות משפת המצוק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. מובהקות סטטיסטיות
- באמצעות תוכנה סטטיסטית לנתח את התוצאות. אין מהיר הנתונים כממוצע ± תקן שגיאה של הממוצע (SEM). מבחנים הם פרמטרית וכך בחנו את הנתונים באמצעות מבחן t מנתח.
הערה: ניסויים לא נועדו לבחון הבדלים בין המינים. הבדלים נחשבים משמעותי מבחינה סטטיסטית כאשר p <0.05.
Representative Results
עכברים נבדקו מ P7 (24 שעות לאחר ניתוח) כדי P13 (1 שבוע לאחר ניתוח), באמצעות עכברים שונים עבור כל נקודת זמן, כך ללמוד פרדיגמה בחינה לא היה משתנה מבלבל. P8 נבחר נציג תוצאות, כמו עכברים הראו הגירעונות הגדולים בנקודת זמן זו.
מעבר שבין זחילת רגליים מתעכבת עכברי CP ילודים
יש חולי CP אדם מומי הילוך, החל הליכת בוהן הילוך שחתר. כפי CP זה מציג מודל בהליכה גירעונות דומים לבני אדם, ambulation הוערכה. עכברים דורגו על סימטרית הליכה ותנועת איבר-כפה במהלך הליכה ישרה. בשעה 48 שעות לאחר הניתוח (PND 8), עכברים CP רשאי לנוע איבר סימטרי פחות הילוך "זחילה" לעומת עמיתיהם דמה שלהם (ציון ambulation הממוצע: CP 1.083 ±.6337, N = 12 לעומת דמה 1.639 ± 0.4859, n = 9; p <0.05, איור 10). על ידי אחד בשבוע, הן CP ועכברים דמה שעברו ל הליכה (מידע לא מוצג).
Pups איור 10. CP עכבר לא ambulate וכן שמס. עכברים שאם (פס שחור) יש ציון ממוצע של 1.639 ± 0.4859 (n = 9), כלומר פיתוח אמבולטורי שלהם נופל בין תנועת איבר אסימטרי זחילה איטית. עכברי CP (בר אפור) מקבלים ציון ממוצע של 1.083 ± 0.6337 (n = 12), כלומר ambulation שלהם הוא פחות מפותח נוטים להיות בעלי תנועת איבר סימטרית. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM; * הוא p <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
יןdlimb רגל הזווית מוגברת CP
בנוסף ambulation, זווית הרגל hindlimb הוערכה. שמונה ימים בת גורי עכבר דמה ללכת עם hindpaws שלהם מכוון קדימה, בהשוואה לעכברי HIL, אשר פרושים hindpaws בעת ההליכה בקו ישר (איור 2; זווית ממוצעת: CP 77.48 ± 9.848, n = 9, לעומת 54.54 דמה ± 8.043, n = 11; p <0.0001, איור 11). זווית גדל זה עולה בקנה אחד עם חוסר יציבות בהליכה, שכן הגורים צריכים להגדיל את הזווית של הכפות האחורי שלהם כדי לייצב ההליכה שלהם ולסייע עם שיווי משקל וקואורדינציה.
איור 11. CP העכבר Pups נוטה החוצה Hindpaws שלהם בעת הליכה. עכברי CP (פסים שחורים) יש זווית ממוצעת בין hindlimbs שלהם של 77.48 ± 8.043 (n = 11), ואילו עכברי דמה (ב אפור ערס) יש זווית ממוצעת של 54.54 ± 9.848 (n = 9). הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM; **** הוא p <0.0001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עכברי CP אינו צג גירעונות כאשר ליישר Surface
המבחן ליישר שטח נכלל כמו חלק מחולי CP יש לקויים מלאי מטען (Heyrman et al., 2013). בנוסף, מערכת שיווי המשקל יש צורך לזהות את הצורך ליישר ויש גירעונות שיווי משקל אצל חלק מחולי CP 23. עכברי CP לא מראים גירעונות משמעותיים כאשר ליישר בהשוואה לקבוצת ביקורת דמה (מידע לא מוצג).
עכברים CP לבצע את אותה כמו שאם בנגטיב geotaxis בדיקה
t "FO: keep-together.within-page =" 1 "> geotaxis שלילי משמש לבדיקת קואורדינציה מוטורית גורים צעירים עכברים מאותגרים על ידי להיות מקום מול במדרון על משטח משופע עיכוב או אי במעלה ההר אוריינט יכול להצביע גירעונות.. בתיאום, איזון, או קלט שיווי משקל. עכברי CP מראים גירעונות כאשר קראו תיגר עם geotaxis השלילי בהשוואה לעכברי דמה (מידע לא מוצג). בנוסף, עכברי CP לא מראים העדפה לפנות לכיוון צד אחד לעומת אחר כאשר מחדש המכוונת .מבחן המתלה הקדמי גפה מתאים עכברים מבוגרים מ -10 ימים
חולי CP פחתו טונוס שרירי גירעונות מוטוריקה עדינה, כגון אחיזה. כדי לבדוק חולשה במודל העכבר הזה, השתמשנו במבחן מתלה קדמית גפה. יתר על כן, מודל זה עושה שימוש פגיעת איסכמית חד צדדיות נס צדדי ניתן לקבוע באמצעות בדיקת השעיה זו. בדיקה זועדיף 15 עבור עכברים מבוגרים מ -10 ימים. ב -8 בימים ההם, ימים בעקבות פציעה, לא היו הבדלים משמעותיים בין CP ועכברי דמה (מידע לא מוצג).
חוזק Hindlimb הוא ירד ב עכברי CP
חולי CP אדם בדרך כלל צריכים פלטה או מכשירי הליכה מסייעת בשל חוסר שליטה וכוח מנוע. על מנת להשוות את מודל CP מכרסם לבני אדם, כוח hindlimb הוערך באמצעות מבחן השעית hindlimb. כאשר מושעה מהצד של צינור חרוטים, עכברי CP הראו חולשת hindlimb, כפי שהוכח על ידי ירידה תלויה ציון (ציון תלוי hindlimb: CP 3.468 ± 0.5561, n = 13, לעומת דמה 3.891 ± 0.1329, n = 13; p < 0.05, איור 12). לא נצפה הבדל בזמן ההשעיה hindlimb (מידע לא מוצג). לפיכך, בדומה לחולי CP אדם, עכברי CP להפגין hindlחולשת IMB (רגל).
איור 12. עכברים שאם הם מעט אך משמעותיים חזקים hindlimbs שלהם מאשר עכברי CP. בשעת ציון תלייה ממוצעת של 3.891 ± 0.1329 (n = 13), עכברי דמה (פס שחור) להראות הפרדת hindlimb יותר, ולכן עמדה hindlimb חזקה, כאשר תלויים על קצה צינור מאשר עכברי CP (בר אפור) עם ציון תלייה ממוצע של 3.468 ± 0.5561 (n = 13). הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM; * הוא p <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כוח האחיזה יורד פגיעת CP הבאה בלבד
אחיזה עם ארבע רגליים חשוב עבור מכרסםמבחינת טיפוס וריצה על פני משטחים לא ישרים. גריפ דורש כוח מתמשך משמעותי, ולא כשרון או כוח ליניארית, בעיקר הספרות ו כפות 24. עכברים נדרשו להחזיק ממשקל גופם על מסך רשת תיל הפוך. עכברי CP לא היו מסוגלים לשמור על אחיזתם והעכברים הללו נפלו בזוויות נמוכות משמעותי (ארבע זווית ממוצע איבר: CP 75.627 ± 24.48, n = 11, לעומת 96.57 ± 10.836 דמה, n = 9; p <0.05, איור 13). נתונים אלה מלמדים כי יש גירעון משמעותי כוח אחיזה בעכברי CP.
איור 13. עכברים CP יש גריפ חלשה יותר שמס. עכברים שאם (פס שחור) יכול לתפוס בזווית הפוכה ממוצעת של 96.57 ± 10.836 (n = 9). עכברים CP (בר אפור) יכול להגיע בזווית הפוכה רק של 75.627 ± 24.48 (n = 11). הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM; * הוא p0; 0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
גירעונות רפלקס אחזה יבואו לידי ביטוי גם עכברים CP
יחד עם גירעונות מוטוריקה גסה, מוטוריקה עדינה תנועות גם נפגעות בחולים CP 25,26. רפלקס האחיזה בבני האדם קיים כבר בלידה ונעלם בסביבות 5 - 6 חודשים. עם זאת, שינויים רפלקס אחיזה, כגון מהירות מופרזת או עוצמת האחיזה, חוסר היכולת להבין, או הופעתו מחדש של רפלקס אחיזה לאחר 6 חודשים של גיל, כל אלה מעידים פגיעה במערכת העצבים. כדי להשוות אחיזה במודל CP, גירעונות אחיזה רפלקסיבית נקבעו.
בשעת 48 שעות לאחר פציעה, עכברי CP להפגין ירידת אחיזת רפלקס (כפות ממוצע תפסב 48 שעות: CP 2.429 ± 0.9376, n = 14, לעומת דמה 3.214 ± 0.8018, n = 14; p <0.05, איור 14 א). חלה עלייה קלה, אך לא משמעותית העדפה כפה ממש הקדמי (מידע לא מוצג). הייתה העדפת כפה ימנית משמעותית hindpaws (CP 75.0 ± 42.74, n = 14, לעומת דמה 17.86 ± 54.09, n = 14, p <0.005, איור 14B). שבוע לאחר פציעה, עכברי CP להראות גירעונות חמדניים (כפות ממוצע נאחז 1 בשבוע: CP 2.75 ± 1.035, n = 8, לעומת דמה 3.80 ± 0.6325, n = 10, p <0.05, 14 ג איור), ללא העדפת כפה בולטת .
יש גירעונות אחזו איור 14. עכברים CP, ב Hindpaws, נגדיים לאזור במוח הפצוע. (א) 48 שעות הפציעה הבאה (PND 8), עכברי CP (בר אפור) לתפוס מקל עם, בממוצע, כפות פחות מ anima דמהls (פס שחור). (ב) CP עכברים (בר אפור) להציג העדפת אחיזה עם hindpaw התקין (הנגדי לפגיעה) להבדיל באמצעות hindpaw השמאל (ipsilateral כדי פציעה). עכברים שאם (פס שחור) אינם מציגים העדפת כפת זכות זו. העדפת כפה ימנית חושב ([כפה ימין - שמאל כפה] / [כפה ימין + כפיתי שמאלי + שתי כפותיו] * 100) (ג) שבוע הפציעה הבאה, עכברי CP (בר אפור) עדיין להראות אחיזת גירעונות לעומת. שמס (פס שחור). הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM; * הוא p <0.05, ** הוא p <0.005. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עכברי CP להתרחק Edge במהלך שנאת קליף
מבחן סלידת הצוק מסתמך על הפחד הטבוע של העכברים לפנות AWAy ממצוק וראש תלול כלפי בטיחות. למרות שחלק מחולי CP יש קשיי שיווי משקל, כמו גם שליטה עם לקות מוטורית, עכברי CP לא הראו שום גירעונות על המבחן הזה.
Discussion
שימוש במודלים של בעלי חיים כדי לחקור מחלות אדם הוא רלוונטי רק אם יש חפיפה בין התגובה התאית ומולקולרית בין אדם מכרסם וכי הבדיקות התנהגותיות בצעו שייכות ישירה סימפטומי אדם. אחת הסוגיות העיקריות עם מחקרי מחלת ילדים הוא כי חוקרים רבים להשתמש מכרסמים מבוגרים כדי ליצור את המודל, כמו גם להערכה התנהגותית מכרסמת מבוגר, מבלי לקחת בחשבון את ההבדלים התפתחותי עשויים להיות חשוב עבור תהליך המחלה. בגלל הבעיות אלה, חשוב כי מחקר על שימוש מחלת ילדים לא רק בזמן נקודות התפתחותי המותאם המתאים (למשל, פיתוח CNS האנוש 28 - 32 שבועות שווה ביום שלאחר לידה 2 - 7 מכרסם יום) 7, אלא גם בדיקות התנהגותיות, אשר תבדוקנה מוטוריות מתאים, התנהגויות התפתחותי חושיות או רפלקסיבי. לכן, כמו כל מודל מחלה בילוד חדש מפותח, הוא חייב להיבדק בקפדנות כדי להבטיח כי הסלולרתגובות התנהגותיות תספוקנה את הנתונים לתרגום המתאימים ביותר בין מכרסמים ואנושיים.
שיתוק מוחין הוא הפרעה מוטורית, אשר נמשכות אל הבגרות. בעיה אחת עם רבים של מודלי שיתוק המוחין הזמינים כיום הוא היעדר בדיקת מנוע דיר, סטנדרטית כי ניתן לתאם עם הגירעונות לראות מטופלי ילדים. במודל חדש זה, משלב היפוקסיה, איסכמיה ודלקת עכבר בילוד, התנהגות מוטורית הוערכה באמצעות סוללה של בדיקות ספציפיות עבור עכברים בילוד. על מנת להקטין את הסובייקטיביות ולהגדיל את הדיווח הכמותי, מספר בדיקות שונו לכלול ספציפי מאוד, אבל קל להעריך אמצעים שניתנים טופל. בנוסף, ערכות קדמיות ואת hindlimb יכולות להתבצע בנפרד, שמאלה / הבדלים תקינים ניתן לקבוע. מערך זה של מבחנים הוא ספציפי עבור עכברים בילוד עד שבועיים של גיל.
דגם CP זו ממחישהקושי ללכת (ambulation, זווית רגל hindlimb), כמו גם חולשת איבר ספציפי (השעית איבר ארבעה, השעית hindlimb), וגירעונות ברפלקסים התפתחותית (אחיזת רפלקס). למרות שבמחקר זה, רק אחד timepoint נבחן, גירעונות אלה ניתן לעקוב לאורך זמן.
ישנן סוללות אחרות של בדיקות שניתן להשתמש בהם על הילוד, כגון הסוללה של פוקס של בדיקות או הערכה של אבני דרך התפתחותיות של Heyser 15. עם זאת, בדיקות אלו להשוות את הילוד על שמו של המבוגר, התגובות שלו לא יכול להיות זהה בגלל הילוד עדיין מתפתח. הסוללה של פוקס ובדיקות Assement של Heyser להסתמך על מידע סובייקטיבי תצפיתי עם דיכוטומית (כן או לא) הערכה, ולא נתונים אובייקטיביים (זווית, יציבה המבוססת על כוח, וכו '). בגלל subjectiveness של בדיקות אלה, מדענים רבים הסתגלו, הוסיפו, או סיר קריטריונים, ובכך תוצאותיהם שאין לאחרים ולהגבילing את השימושיות של הנתונים במונחים של הקמת גירעון בסיס למחלה או הפרעה מסוימת. על ידי הקמת קבוצה אחת של בדיקות מנוע סטנדרטיות הן איכותיים ומעוצב באופן ספציפי כדי לבדוק ילודים, תוצאות מקבוצות מחקר בודדות ניתן בצורה מדויקת ואמינה דיווחה ומשווות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | STRAIN CODE: 027 | C57BL/6NCrl is the exact strain we use |
| Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish | Corning Life Sciences Glass | 3140125 | Capacity: 25.03 oz. (740ml); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399). |
| Covered lead ring | Fisher Scientific | S90139C | Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish. |
| Scalpel Blade #11 | World Precision Instrucments, Inc. | 500240 | |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Micro Hook | Fine Science Tools | 10064-14 | |
| Vetbond Suture Glue | 3M | 1469SB | n-butyl cyanoacrylate adhesive |
| Lipopolysaccharide | Sigma Life Science | L4391 | Lipopolysaccaride from E.coli 0111:B4, gamma irradiated |
| 12 x 12 inch opaque box | Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics | C4022 | Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H; http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html |
| Camera/camcorder | JVC | GC-PX100BUS | Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder. |
| Covidien Tendersorb™ Underpads | Kendall Healthcare Products Co | 7174 | |
| WypAll L40 | Kimberly-Clark Professional | 5600 | Any surface with moderate grip will do |
| Surface at 45 degree incline | We use a cardboard box. | ||
| Thin wire from a pipe cleaner | Creatology | M10314420 | Any pipe cleaner from any craft store will work. |
| 50mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| Fiberglass Screen Wire | New York Wire www.lowes.com | 14436 | Any supplier can be used as long as their screen is 16 x 16 or 18 x 16 |
| Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work. |
| OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway | PLASKOLITE INC | 1AG2196A | Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2" x 2"; (3) 2" x 18"; (1) 2" x 15.5"; (1) 2" x 3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning. |
| Protractor | Westscott | ACM14371 |
References
- Nakamura, M., Bregman, B. S. Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury. Exp Neurol. 169 (2), 407-415 (2001).
- Widenfalk, J., Lundströmer, K., Jubran, M., Brene, S., Olson, L. Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid. J Neurosci. 21 (10), 3457-3475 (2001).
- Fernández-Lòpez, D., Faustino, J., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Cusick, C. G. Extensive cortical reorganization following sciatic nerve injury in adult rats versus restricted reorganization after neonatal injury: implications for spatial and temporal limits on somatosensory plasticity. Prog Brain Res. 108, 379-390 (1996).
- Barrett, C. P., Donati, E. J., Guth, L. Differences between adult and neonatal rats in their astroglial response to spinal injury. Exp Neurol. 84 (2), 374-385 (1984).
- Villapol, S., Gelot, A., Renolleau, S., Charriaut-Marlangue, C. Astrocyte Responses after Neonatal Ischemia: The Yin and the Yang. Neuroscientist. 14 (4), 339-344 (2008).
- Craig, A., Ling Luo, N., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Exp Neurol. 181 (2), 231-240 (2003).
- Shen, Y., Liu, X. B., Pleasure, D. E., Deng, W. Axon-glia synapses are highly vulnerable to white matter injury in the developing brain. J Neurosci Res. 90 (1), 105-121 (2012).
- Shen, Y., Plane, J. M., Deng, W. Mouse models of periventricular leukomalacia. J Vis Exp. (39), (2010).
- Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
- Tremml, P., Lipp, H. P., Müller, U., Ricceri, L., Wolfer, D. P. Neurobehavioral development, adult openfield exploration and swimming navigation learning in mice with a modified beta-amyloid precursor protein gene. Behav Brain Res. 95 (1), 65-76 (1998).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72 (2), 251-264 (1974).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Del Bigio, Long-term motor deficit following periventricular hemorrhage in neonatal rats: A potential model for human cerebral palsy. J Cerebr Blood F Met. , (2005).
- Williams, E., Scott, J. P. The Development of Social Behavior Patterns in the Mouse, in Relation to Natural Periods. Behaviour. 6 (1), 35-65 (1954).
- Heyser, C. J. Assessment of developmental milestones in rodents. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. Q., et al. Chapter 8, (2004).
- Corti, S. Grip strength TREAT-NMD: Experimental protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ (2014).
- Corti, S., Nizzardo, M., et al. Neural stem cell transplantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 118 (10), 3316-3330 (2008).
- Grondard, C., Biondi, O., et al. Regular exercise prolongs survival in a type 2 spinal muscular atrophy model mouse. J Neurosci. 25 (33), 7615-7622 (2005).
- El-Khodor, B. F. Behavioral Phenotyping for Neonates. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
- El-Khodor, B. F., Edgar, N., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212 (1), http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ 29-43 (2008).
- Venerosi, A., Ricceri, L., Scattoni, M. L., Calamandrei, G. Prenatal chlorpyrifos exposure alters motor behavior and ultrasonic vocalization in CD-1 mouse pups. Environ Health. 8 (12), (2009).
- Hill, J. M., Lim, M. A., Stone, M. M. Developmental milestones in the newborn mouse. Neuromethods 39: Neuropeptide Techniques. , Humana Press. New Jersey. (2008).
- Visual dependence influences postural responses to continuous visual perturbation in adults with spastic cerebral palsy. Yu, Y., Keshner, A. E., Tucker, C. A., Thompson, E. D., Lauer, R. T. Combined Sections Meeting of American Physical Therapy Association, Anaheim, CA, USA, , (2016).
- Carlson, G. The use of four limb hanging tests to monitor muscle strength and condition over time. Experimental Protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.005.pdf (2011).
- Gordon, A. M., Duff, S. V. Relation between clinical measures and fine manipulative control in children with hemiplegic cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 41 (9), 586-591 (1999).
- Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int J Pediat. , (2012).
