Introduction
Desenvolvimento de novos modelos de lesão ou doença pediátrica usando roedores é muitas vezes difícil, devido à incrível capacidade de ambos os ratos e camundongos para se recuperar rapidamente da lesão neurológica. Portanto, a fim de validar qualquer novo modelo de doença pediátrica, examinando exaustivamente as alterações celulares e moleculares deve ir de mãos dadas com os resultados comportamentais. Em muitos aspectos, a recuperação comportamental funcional pode ser mais importante do que as alterações celulares subjacentes em termos de relevância terapêutica ou de translação. Enquanto os investigadores aprendem mais sobre lesão no adulto e neonatal, é claro que as suas respostas são muito diferentes e não podem ser extrapolados entre os dois. Por exemplo, ratinhos neonatais apresentar diferentes níveis de factor de crescimento de nervo, factor neurotrófico derivado do cérebro, neurotrofina-3 e factor neurotrófico glial da linha de células obtido de acordo com lesão da medula espinal 1,2. Além disso, os neonatos têm fugas barreira hemato-encefálica significativa após acidente vascular cerebral 3, demonstrate cortical neurônio rearranjo após a lesão do nervo periférico 4, e ter um astrogliosis atrasado ou diminuiu após lesão medular e hipóxia-isquemia 5,6. Portanto, é importante que a investigação pediátrica translacional usar modelos developmentally equivalente e que esses modelos são avaliados para ambas as alterações moleculares / celulares e testes comportamentais apropriadas à idade.
Paralisia Cerebral (PC) é um distúrbio motor que afeta 3: 1000 nascidos vivos por ano (NIH). Crianças com PC exibem uma variedade de sintomas e condições co-mórbidas, dependendo da gravidade da doença. Dificuldade de movimento e coordenação são os sinais mais comuns, juntamente com atrasos para alcançar metas de desenvolvimento do motor. Outros sinais incluem o tônus muscular anormal (aumentada ou diminuída), reduziu as habilidades motoras finas, dificuldade para caminhar, salivação excessiva e deglutição, e atrasos de fala (NIH). A causa subjacente da CP se acredita sera falta de oxigênio e / ou fluxo sanguíneo para o cérebro durante o período pré ou periparto, ou até um ano pós-parto. Além disso, a inflamação é agora acreditava ser um componente chave no desenvolvimento de CP.
A maioria dos casos de PC estão associados com lesão da substância branca em torno dos ventrículos, conhecidos como leucomalácia periventricular (PVL). Esta característica neurológica sugere que o insulto inicial levando a CP ocorre durante o período de desenvolvimento do cérebro quando os oligodendrócitos são mais vulneráveis ao insulto. O período de crescimento oligodendrócitos rápida em um ser humano, também o período em oligodendrócitos são os mais suscetíveis a lesões, é entre 24 - 32 semanas de gestação. No roedor, o período é equivalente dias pós-natais 2 - 7 7, e é quando PC é induzida neste modelo.
O modelo de rato neonatal da CP que foi usado para realizar os testes descritos aqui combina hipoxia e isquemia com a inflamação de criar uma injUry que imita melhor a neurodegeneração visto em CP humano. Este modelo aborda algumas das principais deficiências observadas em outros modelos animais de CP, que não possuem déficits motores distintos que se assemelha a pacientes com PC humanos, bem como danos substância branca distinta. Estudos anteriores por um colaborador usando o mesmo modelo demonstraram que a adição de inflamação aumenta a lesão da substância branca, assim, emulando melhor o PVL visto em crianças com CP 8. Com base nos dados anteriores, este trabalho apresenta uma bateria completa de testes motores neonatais, a fim de avaliar as mudanças no comportamento do motor como o animal envelhece.
Protocol
NOTA: Todas as cirurgias em animais foram realizados de acordo com o departamento ular da Universidade de Temple e políticas IACUC e procedimentos. C57BL / 6 barragens e touros foram adquiridos de Charles River Laboratories e foram alojados em gaiolas de criação com um 12 hr ciclo claro / escuro (luz sobre 7:00-19:00) com livre acesso a comida e água. casais reprodutores produzidos tamanho das ninhadas entre 5 - 10 filhotes.
Cirurgia 1. Paralisia Cerebral Indução
- NOTA: A paralisia cerebral foi induzida utilizando dia pós-natal (PND) 6 filhotes de rato, como descrito anteriormente 8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia).
- Coloque um filhote de cachorro em uma tigela de vidro no gelo com um laboratório limpe para proteger a pele do filhote. Verificar a existência de plano anestésico adequado por pitada pé e falta de movimento. Mova o cachorro para um bloco de gelo acolchoada para a cirurgia.
- Esterilizar a pele do filhote usando 70% de etanol. Quando secar, use um # 11 bla cirúrgica esterilizadae de fazer uma incisão de 1 cm no pescoço.
- Usando um microscópio cirúrgico estereoscópica, isolar a artéria carótida comum direita com um pequeno gancho e cauterizar usando um cauterizador manual, portátil. Confirmar visualmente que a artéria está obstruída. Cirurgia simulada inclui a visualização e isolamento da artéria carótida comum, sem cauterização.
- Realinhar a pele e fechar usando sutura de cola (n-butil cianoacrilato).
- Coloque o filhote em um 34 o aquecimento C pad por 30 min para monitorar a respiração espontânea e movimento normal.
- Devolver o cachorro (s) para represar durante 30 minutos.
- Colocar os filhotes numa almofada de aquecimento ou outro dispositivo de aquecimento fixada em 34 ° C dentro de uma câmara de hipoxia fixado em 6% de oxigénio durante 35 min. O oxigénio é substituído por azoto. acompanhar de perto o nível de oxigênio de câmara e temperatura para obter resultados de lesões consistentes.
- Remover os filhotes da câmara de hipóxia e devolvê-los para a almofada de aquecimento.
- Intraperitoneal injetar lipopolysacárido diluída em solução salina estéril a 1 ug / kg e devolver o cachorro para a barragem. injecções simuladas são injecções de apenas solução salina.
2. Testes Neonatal Motor
NOTA: Em PND 8, 48 horas após a indução da CP, filhotes de rato são testadas para o desenvolvimento neurocomportamental. Os filhotes de cachorro são testados dentro de um bloco de 4 horas antes do meio dia, a fim de eliminar o tempo de diferenças dia no comportamento. Os filhotes são removidos a partir da barragem para não mais do que 15 min de cada vez para evitar a rápida perda de calor do corpo e questões fome / separação. Além disso, os filhotes estão autorizados a descansar entre testes para que esforços máximos será desencadeada em cada teste. A base dos testes motores neonatais é adaptado usando a bateria do Fox de testes 10,11 e adaptação de testes de 12 de Fox do Wahlsten, bem como publicações Tratar-NMD e outros comportamentos (como observado no texto para cada teste). bateria de testes do Fox são apropriados para PND 2 - 21. de testes da Fox, a massay aqui presente inclui: reflexo de endireitamento, agarrando reflexo, geotaxis negativos (chamados de teste de tela vertical na bateria do Fox) e força de preensão de quatro membros (modificado a partir de testes de escalada tela da Fox e Wahlsten). Aqui, deambulação, força front-membro, ea força dos membros posteriores também são testados para distinguir comportamento motor reflexiva entre sham e mouse CP filhotes. Para eliminar melhorias em testes, devido à aprendizagem, os testes foram limitados a um máximo de 3 ensaios onde observado. Todos os outros testes teve apenas um ensaio por animal.
- A deambulação (Figura 1) (adaptado a partir de um protocolo de rato 13):
NOTA: Crawling é um comportamento desenvolvido no início do filhote de rato entre PND 0-5, em que ratos ponto começam a transição para uma caminhada, a partir de 5 - 10 dias de idade 14. No PND 8, o teste de deambulação leva vantagem deste curso de tempo de transição. A deambulação pode, no entanto, ser marcado durante toda a vida de um rato e pode ser determinada em qualquer idade.Como não existe um potencial para a aprendizagem, a deambulação teste pode ser repetido tantas vezes quantas as necessárias durante o curso da experiência.- camundongos lugar em um compartimento claro onde os ratos são visíveis a partir do topo, bem como o lado. Use insistência gentil ao tocar o rabo do cachorro para motivar o filhote de andar.
- Pontuação deambulação por 3 min utilizando a seguinte escala: 0 = nenhum movimento, 1 = rastejando com os movimentos dos membros assimétrica, 2 = rastreamento lento, mas os movimentos dos membros simétrica, e 3 = rápido rastreamento / caminhada.
NOTA: Aqui, o movimento do membro simétrica é descrito onde patas traseiras satisfazer frontpaws durante cada passo, e cada passo suavemente transições para o passo seguinte. Um rato que indica os movimentos dos membros assimétrica tem colocação pata errático e transições de uma etapa para a próxima não são suaves.
Figura 1. A transição deRastejar para caminhar podem ser distinguidos pela Observando a pata traseira, bem como a cabeça ea cauda. (A) durante o rastreamento, a toda volta pata, dos dedos do pé até o calcanhar toca o chão quando deambulação, como indicado por (*). Um padrão de marcha adultos é visto quando apenas os dedos dos pés e parte da frente da pata traseira tocar o chão (o calcanhar é elevado, deonoted por [**]). (B) A cabeça ea cauda de um rato rastreamento é baixo para o chão. A cabeça começa a subir durante a transição de rastejar para caminhar. A transição está completa quando ambos a cabeça ea cauda são elevados e apenas a frente da pata traseira toca o chão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Hindlimb Pé Ângulo (Figura 2)
NOTA: Há uma mudança do desenvolvimento aparente na postura dos membros posteriores como o mouse amadurece de rastejar para caminhar, onde os membros posteriores são posicionados por baixo do corpo ao caminhar e o ângulo entre o hindlimbs é menor que o ângulo visto no rastreamento. Mesmo que o ângulo do membro posterior do pé muda ao longo do tempo, filhotes de rato da mesma idade com lesões ou doenças diferentes podem ser comparadas. Semelhante ao ensaio de locomoção (3.1), que não haja potencial para a aprendizagem. Assim, o teste de ângulo do membro posterior do pé pode ser repetido tantas vezes quantas as necessárias durante o curso da experiência.- Quer numa caixa de campo aberto clara ou uma área fechada, uma montagem de câmara de vídeo a partir de baixo ou de cima, respectivamente, para gravar o cachorro que se move em torno do campo. Use insistência gentil ao tocar o rabo do cachorro para motivar o filhote de andar. Recorde para dois minutos.
- Usando as gravações de vídeo, medir o ângulo do pé dos filhotes desenhando uma linha a partir da extremidade do calcanhar / Shin para a ponta do mais longo (média) do dedo do pé. Apenas tomar a medida quando o filhote está executando um passo completoem uma linha reta e ambos os pés estejam apoiados no chão. Não fazer medições quando o filhote está parado ou quando o filhote está se transformando.
- Meça três a cinco conjuntos de ângulos pé e calcular o ângulo médio para cada filhote testado.
Figura 2. dos membros posteriores Pé Ângulo podem ser usados para determinar a marcha anormalidades. O ângulo do pé pode ser medido por desenhar uma linha a partir de meados de calcanhar pelo meio (mais longa) dígitos. Animais feridos têm um ângulo maior pé quando comparado ao normal (ver resultados representativos, Pé Angle). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Righting superfície (Figura 3):
NOTA: O reflexo de endireitamento é a capacidade do motor para um filhote de rato para ser capaz de virar para os seus pés a partir de uma posição supina. A idade média do reflexo de endireitamento para aparecer em roedores é PND 5 com um intervalo entre PND 1 -. 10 15 Uma vez que este teste é um reflexo, não há nenhum componente de aprendizagem e pode ser repetida durante todo o período de experimentação.- Coloque os filhotes nas costas em um lençol de algodão ou banco almofada e mantenha na posição por 5 segundos.
- Liberar os filhotes e registrar o tempo que leva o filhote para retornar à posição prona, bem como o sentido de corrigir (esquerda ou direita). Um total de um minuto é dado para cada ensaio, se necessário.
- Repita o procedimento para um total de três ensaios.
Figura 3. Righting Surface. Este teste requer controle de tronco e pode testar os desequilíbrios posturais. pacientes com PC humanos podem ter défices no seu núcleo.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Negativo geotaxis (Figura 4)
NOTA: A idade média para reflex geotaxis negativo para aparecer em roedores é PND 7 com um intervalo de PND 3-15 15 O teste geotaxis negativo avalia coordenação motora em ratos jovens.. Ratos são colocados virados para baixo um declive e, devido aos sinais vestibulares de gravidade, filhotes de virar o rosto para subir a encosta. A resposta ao estímulo, ou táxis, é um comportamento inato.- Coloque o filhote de cachorro com a cabeça apontando para baixo em uma inclinação de 45 o e segure-o por 5 s.
- Solte o filhote de cachorro e registrar o tempo ea direção do cachorro vira para cima. tempo de teste total é de 2 min.
- Repita o procedimento para um total de três ensaios. Os ratos que caem para baixo a inclinação ou deixar de virar pode ser re-testado, eliminado, ou atribuída uma pontuação zero.
NOTA: Esta decisão é lEFT para o examinador, como, ocasionalmente, filhotes vai rolar para baixo a inclinação devido à sonolência e não de fraqueza. Uma vez que a decisão é feita sobre a forma de marcar os filhotes que caem a inclinação, deve notar-se nos métodos e deve ser consistente durante todo o teste de todas as disciplinas.
Figura 4. Negativo geotaxis. Motor ea entrada vestibular é necessário para o mouse para reconhecer sua orientação em uma ladeira e virar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Suspensão Dianteira-membro (Figura 5) 16; adaptado a partir de 17, 18:
NOTA: A suspensão dianteira de membros testa a força do membro anterior de filhotes, incluindo o braço e força pata. Tseu teste não é recomendado para filhotes com menos de PND 10 15. Os filhotes são permitidos para agarrar um fio amarrado em um objeto estável e pendurar o fio com as duas patas dianteiras. A área de teste é mais uma zona para soltar acolchoada. O teste pode detectar diferenças de força lateral direita / esquerda. Aprender e à ausência de reforço negativo pode levar a um aumento não-participação. Os ratos que caem imediatamente quando liberada ou incapacidade de compreender quando colocado sobre o fio são indicativos de não participação.- Mantenha os filhotes firmemente pelo corpo e permitir-lhes para agarrar o fio com as duas patas dianteiras.
- Solte o filhote. Usando um temporizador ou cronómetro, registar o tempo total de queda, bem como enfraquecimento da pata.
NOTA: fraqueza da pata é determinado se um cachorro cai de forma consistente a partir do fio com uma pata antes do outro, em vez de libertar a partir do fio com as duas patas ao mesmo tempo. - Repetir o teste durante um total de três vezes.
Figura 5. Front-Membro de suspensão. Este teste suspensão provoca tensão nos membros anteriores até a fadiga muscular. Com esta abordagem, a força da linha de base nos membros anteriores são estabelecidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Suspensão do membro posterior (Figura 6):
NOTA: Este teste suspensão determinam a força dos membros posteriores. É um teste projetado especificamente para recém-nascidos e foi inicialmente usado em animais entre PND 2-12 19,20, mas pode ser adaptado para ratos até PND 14. Este teste pode detectar diferenças de força dos membros posteriores direita / esquerda, bem como a função neuromuscular. Um padrão de 50 ml cônico é utilizado, preenchidos com lenços de laboratório. Similar ao teste de suspensão front-membro, este teste pode ser aprendido, especialmente o pecadoce não há nenhuma consequência negativa para cair. Assim, o aumento não participação, tal como visto por ratos que caem logo que libertado ou o fracasso para ficar quando colocado na extremidade do tubo, pode ser observado.- Usando um cônico de 50 ml, local filhote delicadamente a face para baixo dentro do tubo com as patas traseiras pendurado por cima da borda.
- Solte o filhote. Observe a postura dos membros posteriores.
- Pontuação postura de acordo com os seguintes critérios.
NOTA: Pontuação de 4 indica separação normal de hindlimb com cauda levantada; pontuação de 3 significa fraqueza é aparente e membros posteriores estão mais juntos, mas eles raramente tocam; pontuação de 2 indica membros posteriores são próximos uns dos outros e muitas vezes comovente; pontuação de 1 mostra uma fraqueza é aparente e os membros posteriores são quase sempre em uma posição entrelaçadas com a cauda levantada; uma pontuação de 0 indica clasping constante dos membros posteriores com a cauda baixa ou falha para agarrar o tubo para qualquer período de tempo. - Contagem puxa se necessário. A tração é quaacidificado quando o cachorro tenta levantar o corpo usando os seus membros posteriores ao mesmo tempo suspenso no lado do tubo cónico.
- Usando um temporizador ou cronómetro, gravar a latência para cair.
- Repita o teste inteiro em triplicado.
Figura 6. Suspensão dos membros posteriores. (A). Este teste suspensão provoca tensão nos membros posteriores até a fadiga muscular. A força da linha de base e a postura dos membros posteriores são estabelecidos. (B). A pontuação. Observe os números acima dos ratos representativos demonstrando a possível pontuação postura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- A força de preensão (Figura 7):
NOTA: Este teste irá analisar a pata strength de todas as quatro patas ao mesmo tempo. Um fio de tela de fibra de vidro 16 x 18 é usado. A idade média para um roedor de ser capaz de agarrar uma tela horizontal é PND 8 com um intervalo de PND 5 - 15 15 Fox utilizado o teste de tela horizontal de quatro membros do PND. 2 -. 21 10 Este teste é modificado a partir do padrão horizontal teste de ecrã; Aqui a tela é girada lentamente a partir da horizontal para a posição vertical, para contestar a apreensão de todos os quatro membros 21; adaptado de Corti S 16. Se o mouse detém sobre a tela de malha quando invertida a 180 °, gravar a latência para cair. Além disso, observe o peso do corpo. Um impulso de pendurar pode ser calculada como [peso (g) x latência para descer (s)] que reflecte a força necessária para resistir à gravidade.- Usando um pedaço de malha de arame, coloque o filhote na tela. Permitir que o filhote para ajustar a este ambiente durante cerca de 5 segundos.
- Inverter a tela lentamente a 180 graus. Grave o angl aproximadae da tela quando o filhote cai.
- Repita o procedimento para um total de três ensaios e a média dos ensaios.
Figura 7. força de preensão. Os ratos são necessários para manter a tensão muscular nos quatro membros como força aumenta gravitacionais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Agarrando Reflex (Figura 8)
NOTA: O reflexo agarrar geralmente aparece em roedores com PND 7 com um intervalo de PND 3-15 15 Cada pata é testada individualmente, assim, o teste pode revelar questões dianteira ou dos membros posteriores, bem como questões de parcialidade.. Como é um reflexo, este teste pode ser repetido até que o reflexo aparece. Ele não é propenso a aprendizagem. Como uma ressalva importante, este teste não distingue força agarrar, única habilidade, e devem ser testados antes de 15 dias de idade quando os ratos juvenis começar a entender, devido ao medo de resposta.- Segure o mouse pela nuca de seu pescoço, semelhante à maneira como um filhote de rato é realizada pela barragem. Esta espera faz com que o cachorro para se tornar instintivamente imóvel e relaxado, permitindo a facilidade de testes.
- Acidente vascular cerebral cada pata do filhote de cachorro com o contundente, arredondado lado de uma lâmina de barbear.
- Teste cada pata individualmente e registrar a presença ou ausência de agarrar e marcar 1 ponto por cada pata com que os apertos do mouse.
NOTA: A pontuação para a preferência pata direita é 100% de preferência pata direita, - - -100% de preferência pata esquerda, 50% para ambas as patas agarrar, e 0% para não patas agarrando. A equação para determinar esses números é [(pata direita - pata esquerda) / (pata direita + pata esquerda + ambas as patas)] x 100%.
/53569/53569fig8.jpg "/>
Figura 8. Agarrando Reflex. Porque ratos neonatal não tem uma resposta de medo forte, este teste determina rigorosamente o reflexo plantar / palmar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Cliff Aversão (Figura 9):
NOTA: Testes de aversão ao Cliff labirinto reflexos, bem como força e coordenação e pode ser usado para testar os filhotes de PND 1-14 22. Uma caixa de pré-perfumada (uma caixa onde foram permitido um mínimo de 5 ratos para andar livremente) com uma borda elevada plana é utilizada e que o filhote é colocado com os dígitos única de suas patas dianteiras e o focinho posicionado sobre a borda. A pontuação é realizada através da contagem do tempo total que leva o cachorro para afastar-se do precipício e mover suas patas e focinho longe da borda. Se nenhuma resposta for observada após 30 segundos, o teste é encerrado.Se o filhote cai fora da borda, um único ensaio adicional pode ser realizada.- Usando uma vista lateral, coloque o filhote na borda da caixa de pré-perfumado, certificando-se de que as patas dianteiras, dígitos e focinho são as únicas partes sobre a borda.
- Solte filhote de cachorro e iniciar o temporizador.
- Uma vez que tanto o focinho e patas foram removidos a partir da borda, parar o temporizador de tempo e ficha.
- Repetir o teste durante um total de 3 ensaios. Se o filhote não se afastar do precipício dentro de 30 segundos, nenhuma pontuação é dada.
NOTA: A determinação se o filhote é um não-participante contra prejudicada é deixada ao critério do examinador. A altura do penhasco pode ser ajustado para a idade do filhote de cachorro para garantir a segurança do filhote. Uma altura menor pode ser usado com um "piso" preto para emular uma altura maior.
Figurdesequilíbrios e 9. Cliff Aversão. vestibulares são medidos através do teste de penhasco aversão. Aqui, os olhos do filhote ainda estão fechados por isso o medo não é o fator determinante para se afastar da beira do precipício. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Significância Estatística
- Usando um software estatístico analisar os resultados. Expressar os dados como média ± erro padrão da média (SEM). Os testes são paramétrica e, assim, analisar os dados usando análises t-teste.
NOTA: As experiências não foram concebidos para testar as diferenças de género. As diferenças são consideradas como estatisticamente significativas quando p <0,05.
Representative Results
Os ratos foram testados a partir P7 (24 h após a cirurgia) para P13 (1 semana após a cirurgia), utilizando camundongos diferente para cada ponto de tempo para que a aprendizagem de uma paradigma de teste não foi uma variável de confusão. P8 foi seleccionado como resultados representativos, como os ratos apresentaram as maiores défices neste ponto de tempo.
Transição de rastejar para caminhar está atrasado em CP Mice Neonatal
pacientes com PC humanos têm anormalidades da marcha, que vão desde toe-pé para uma marcha scissored. Como este CP modelo exibe marcha déficits semelhantes aos seres humanos, deambulação foi avaliada. Os ratos foram marcados na simetria da marcha e os movimentos dos membros-pata durante uma caminhada em linha reta. Em 48 horas após a cirurgia (PND 8), os ratos CP tinha menos movimento do membro simétrica e um "rastreamento" marcha em comparação com os seus homólogos sham (pontuação média deambulação: CP 1.083 ±0,6337, n = 12 vs sham 1.639 ± 0,4859, n = 9; p <0,05, Figura 10). Por uma semana, ambos CP e ratos sham fez a transição para uma curta (dados não mostrados).
Figura 10. CP mouse filhotes de cachorro não deambular, bem como Shams. Ratos Sham (barra preta) têm uma pontuação média de 1.639 ± 0,4859 (n = 9), ou seja, seu desenvolvimento ambulatorial cai entre os movimentos dos membros assimétrica e rastreamento lento. camundongos CP (barra cinza) recebem uma pontuação média de 1.083 ± 0,6337 (n = 12), ou seja, a sua deambulação é menos desenvolvida e tendem a ter os movimentos dos membros assimétrica. Os dados são expressos como média ± SEM; * É p <0,05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Hindlimb Pé Ângulo é aumentada em CP
Além de deambulação, hindlimb pé-angular foi avaliada. Oito dias de idade filhotes de rato sham caminhar com suas patas traseiras virada para a frente, em comparação com camundongos LIS, que têm espalhados patas traseiras ao andar em uma linha reta (Figura 2; ângulo médio: CP 77,48 ± 9,848, n = 9, vs sham 54,54 ± 8,043, n = 11; p <0,0001, Figura 11). Este aumento correlaciona-se com ângulo instabilidade da marcha, em que os filhotes necessidade de aumentar o ângulo de suas patas traseiras, a fim de estabilizar a sua marcha e auxiliar com o equilíbrio e coordenação.
Figura 11. CP mouse filhotes de cachorro Splay sua patas traseiras ao andar. Camundongos CP (barras pretas) têm um ângulo médio entre os seus membros posteriores de 77,48 ± 8,043 (n = 11), enquanto que os ratos sham (cinza b ars) têm um ângulo médio de 54,54 ± 9,848 (n = 9). Os dados são expressos como média ± SEM; **** É p <0,0001. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ratos CP não apresentar déficits quando Righting Superfície
O teste de endireitamento superfície foi incluído como alguns pacientes com PC têm prejudicado controle de tronco (Heyrman et al., 2013). Além disso, o sistema vestibular é necessário para detectar a necessidade de corrigir e há déficits vestibulares em alguns pacientes com PC 23. ratinhos CP não apresentam défices significativos quando endireitamento, em comparação com controlos falsos (dados não mostrados).
Ratos CP executam a mesma que Sham em geotaxis Testing Negative
t "fo: manter-together.within-page =" 1 "> geotaxis negativo é usado para testar a coordenação motora em jovens filhotes dos ratos são desafiados por ser lugar de frente para baixo em uma superfície inclinada atraso ou falha na subida oriente poderia indicar déficits.. em coordenação, equilíbrio, ou entrada vestibular. camundongos CP não apresentam déficits quando desafiado com geotaxis negativos em comparação com os ratos sham (dados não mostrados). Além disso, os ratos CP não mostram uma preferência para virar para um lado contra o outro, quando re-orientação .Front-Membro teste de suspensão é apropriado para ratos mais velhos do que 10 dias
pacientes com PC têm diminuição do tônus muscular e déficits de habilidades motoras finas, como agarrar. Para testar a fraqueza neste modelo de ratinho, foi utilizado um teste de suspensão front-membro. Além disso, este modelo usa lesão isquêmica unilateral e lados-ness poderia ser determinada usando este teste suspensão. Esse testeé melhor para camundongos com idade superior a 10 dias 15. Aos 8 dias de idade, dois dias após a lesão, não existiram diferenças significativas entre CP e ratos sham (dados não mostrados).
Força hindlimb é diminuída em camundongos CP
pacientes com PC humanos muitas vezes precisam de chaves ou dispositivos de assistência de passeio devido à falta de controle motor e força. A fim de comparar o modelo CP roedor para os seres humanos, a força dos membros posteriores foi avaliada utilizando o teste da suspensão dos membros posteriores. Quando suspenso a partir do lado de um tubo cônico, ratos CP mostrou fraqueza dos membros posteriores, como demonstrado por uma diminuição na suspensão pontuação (hindlimb pendurado pontuação: CP 3,468 ± 0,5561, n = 13, vs sham 3,891 ± 0,1329, n = 13; p < 0,05, Figura 12). Não foi observada diferença no tempo de suspensão dos membros posteriores (dados não mostrados). Assim, semelhante a pacientes com PC humanos, ratos CP demonstrar hindlIMB (perna) fraqueza.
Figura 12. Os ratos Sham são ligeiramente mas significativamente mais forte em seus membros posteriores do que os ratos CP. Em uma pontuação média de suspensão de 3,891 ± 0,1329 (n = 13), os ratos sham (barra preta) mostram separação mais hindlimb, e, portanto, uma postura hindlimb mais forte, quando pendurado na borda de um tubo do que os ratos CP (barra cinza) com uma pontuação média de suspensão de 3,468 ± 0,5561 (n = 13). Os dados são expressos como média ± SEM; * É p <0,05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Força de preensão é diminuída após lesão CP
Agarrando com todas as quatro patas é importante para um roedortermos de escalada e corrida em superfícies irregulares. Aderência exige força sustentada significativa, ao invés de destreza ou força linear, principalmente nos dígitos e as patas 24. Os ratos foram obrigados a manter seu peso corporal em uma tela de malha de arame invertido. Camundongos CP não puderam manter a sua aderência e estes ratinhos caiu em ângulos significativamente mais baixos (quatro membros ângulo média: CP 75,627 ± 24,48, n = 11, vs sham 96,57 ± 10.836, n = 9; p <0,05, Figura 13). Estes dados mostram que há um défice significativo na força de preensão em ratinhos CP.
Figura 13. Ratos CP têm aperto mais fraco do que Shams. Ratos Sham (barra preta) pode agarrar a um ângulo invertido média de 96,57 ± 10.836 (n = 9). camundongos CP (barra cinza) só pode chegar a um ângulo invertido de 75,627 ± 24,48 (n = 11). Os dados são expressos como média ± SEM; * P é0; 0.05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Déficits apreensão Reflex são aparentes em Ratos CP
Junto com deficiências motoras graves, movimentos motoras finas também são prejudicadas em pacientes com PC 25,26. O reflexo de agarrar em seres humanos está presente ao nascimento e desaparece em torno de 5-6 meses. No entanto, as mudanças no reflexo agarrar, como a velocidade exagerada ou a força de agarramento, incapacidade de compreender, ou o ressurgimento do reflexo de agarrar depois de 6 meses de idade, todos indicam danos ao sistema nervoso. Para comparar agarrar no modelo CP, foram determinados déficits agarramento reflexivos.
Em 48 horas após a lesão, os ratos CP demonstrar uma diminuição na agarrando reflex (patas média apreendidoàs 48 horas: CP 2,429 ± 0,9376, n = 14, vs sham 3.214 ± 0,8018, n = 14; p <0,05, Figura 14A). Houve um aumento ligeiro, mas não significativo, de preferência pata direita nas patas dianteiras (dados não mostrados). Houve uma preferência pata direita significativa nas patas traseiras (CP 75,0 ± 42,74, n = 14, vs sham 17,86 ± 54,09, n = 14; p <0,005, Figura 14B). Uma semana após a lesão, os ratos CP apresentar déficits agarrando (patas média apreendido em 1 semana: CP 2,75 ± 1,035, n = 8, vs sham 3,80 ± 0,6325, n = 10; p <0,05, Figura 14C), com nenhuma preferência pata notável .
Figura 14. Ratos CP têm déficits agarrar, no patas traseiras, contralateral à região do cérebro ferido. (A) 48 horas após a lesão (PND 8), os ratos CP (barra cinza) compreender uma vara com, em média, menos patas do que anima shamls (barra preta). ratinhos (B) CP (barra cinza) exibem uma preferência para agarrar com a pata traseira direita (contralateral à lesão) em vez de usar a pata traseira esquerda (ipsilateral à lesão). ratos Sham (barra preta) não apresentam essa preferência pata direita. Preferência pata direita é calculado como ([pata direita - esquerda pata] / [pata direita + pata esquerda + ambas as patas] * 100) (C) Uma semana após a lesão, os ratos CP (barra cinza) mostram ainda agarrando déficits em comparação com. shams (barra preta). Os dados são expressos como média ± SEM; * É p <0,05, ** é p <0,005. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ratos CP se afastar da borda Durante Aversão Cliff
O teste baseia-se na aversão rochedo o medo inerente dos ratinhos para ligar AWAy de um penhasco íngreme e cabeça para a segurança. Embora alguns pacientes com PC têm dificuldades vestibulares, bem como o controle motor prejudicada, os ratos CP não apresentaram déficits neste teste.
Discussion
Usando modelos animais para estudar doenças humanas só é relevante se há uma sobreposição entre a resposta celular e molecular entre humanos e roedores e que os testes comportamentais realizados têm relevância direta para os sintomas humanos. Um dos principais problemas com doença pediátrica estudos é que muitos investigadores utilizar roedores adultos para criar o modelo, assim como a avaliação comportamental adulto roedor, sem ter em conta as diferenças no desenvolvimento que podem ser importantes para o processo da doença. Devido a estes problemas, é importante que a investigação sobre a utilização doença pediátrica, não só o desenvolvimento pontos de tempo apropriado ajustado (por exemplo, desenvolvimento do SNC humano com 28 - 32 semanas são equivalentes a um dia pós-natal 2-7 dias roedor) 7, mas também testes comportamentais que irá analisar motor apropriado, comportamentos de desenvolvimento sensoriais ou reflexivos. Assim, à medida que cada novo modelo de doença neonatal é desenvolvido, que devem ser rigorosamente testados para assegurar que o celulare respostas comportamentais irá fornecer os dados traduzíveis mais adequadas entre roedores e humanos.
A paralisia cerebral é uma desordem motora, que persistem na vida adulta. Um problema com muitos dos modelos paralisia cerebral hoje disponíveis é a falta de repetibilidade, o teste de motor padronizado, que pode correlacionar-se com os défices observados em pacientes pediátricos. Neste novo modelo, que combina hipóxia, isquemia e inflamação em um rato neonatal, comportamento motor foi avaliada utilizando uma bateria de testes específicos para os ratos recém-nascidos. A fim de diminuir a subjectividade e aumentar a informação quantitativa, vários testes foram modificados para incluir muito específico, mas fáceis de avaliar as medidas que podem ser padronizados. Além disso, as avaliações front e dos membros posteriores podem ser feitas separadamente, e as diferenças para a esquerda / para a direita pode ser determinada. Esta bateria de testes é específico para ratos neonatais até duas semanas de idade.
Este modelo demonstra CPdificuldade em andar (deambulação, ângulo do pé hindlimb), bem fraqueza específica do membro (suspensão de quatro membros, suspensão dos membros posteriores), e déficits de reflexos de desenvolvimento (agarrar reflex). Embora neste estudo apenas um ponto temporal foi examinada, esses déficits podem ser monitorados ao longo do tempo.
Há outras baterias de testes que podem ser usados no recém-nascido, como a bateria do Fox de testes ou avaliação de marcos de desenvolvimento 15 de Heyser. No entanto, estes testes comparar o recém-nascido para o adulto, cujas respostas não podem ser o mesmo, porque o recém-nascido está ainda em desenvolvimento. A bateria do Fox e testes Assement de Heyser confiar na informação subjetiva observacional com (sim ou não) avaliação dicotômica, ao invés de dados objetivos (ângulo, postura com base na força, etc). Devido à subjetividade destes testes, muitos cientistas têm se adaptado, adicionados ou removidos critérios, tornando assim os seus resultados incomparáveis para os outros e limiteing a utilidade dos dados em termos de estabelecimento de um défice de linha de base para uma determinada doença ou distúrbio. Ao estabelecer um conjunto de testes motores padronizados que são qualitativa e especificamente concebido para testar recém-nascidos, os resultados dos grupos de pesquisa individuais podem ser precisa e confiável relatados e comparados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | STRAIN CODE: 027 | C57BL/6NCrl is the exact strain we use |
| Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish | Corning Life Sciences Glass | 3140125 | Capacity: 25.03 oz. (740ml); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399). |
| Covered lead ring | Fisher Scientific | S90139C | Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish. |
| Scalpel Blade #11 | World Precision Instrucments, Inc. | 500240 | |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Micro Hook | Fine Science Tools | 10064-14 | |
| Vetbond Suture Glue | 3M | 1469SB | n-butyl cyanoacrylate adhesive |
| Lipopolysaccharide | Sigma Life Science | L4391 | Lipopolysaccaride from E.coli 0111:B4, gamma irradiated |
| 12 x 12 inch opaque box | Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics | C4022 | Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H; http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html |
| Camera/camcorder | JVC | GC-PX100BUS | Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder. |
| Covidien Tendersorb™ Underpads | Kendall Healthcare Products Co | 7174 | |
| WypAll L40 | Kimberly-Clark Professional | 5600 | Any surface with moderate grip will do |
| Surface at 45 degree incline | We use a cardboard box. | ||
| Thin wire from a pipe cleaner | Creatology | M10314420 | Any pipe cleaner from any craft store will work. |
| 50mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| Fiberglass Screen Wire | New York Wire www.lowes.com | 14436 | Any supplier can be used as long as their screen is 16 x 16 or 18 x 16 |
| Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work. |
| OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway | PLASKOLITE INC | 1AG2196A | Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2" x 2"; (3) 2" x 18"; (1) 2" x 15.5"; (1) 2" x 3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning. |
| Protractor | Westscott | ACM14371 |
References
- Nakamura, M., Bregman, B. S. Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury. Exp Neurol. 169 (2), 407-415 (2001).
- Widenfalk, J., Lundströmer, K., Jubran, M., Brene, S., Olson, L. Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid. J Neurosci. 21 (10), 3457-3475 (2001).
- Fernández-Lòpez, D., Faustino, J., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Cusick, C. G. Extensive cortical reorganization following sciatic nerve injury in adult rats versus restricted reorganization after neonatal injury: implications for spatial and temporal limits on somatosensory plasticity. Prog Brain Res. 108, 379-390 (1996).
- Barrett, C. P., Donati, E. J., Guth, L. Differences between adult and neonatal rats in their astroglial response to spinal injury. Exp Neurol. 84 (2), 374-385 (1984).
- Villapol, S., Gelot, A., Renolleau, S., Charriaut-Marlangue, C. Astrocyte Responses after Neonatal Ischemia: The Yin and the Yang. Neuroscientist. 14 (4), 339-344 (2008).
- Craig, A., Ling Luo, N., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Exp Neurol. 181 (2), 231-240 (2003).
- Shen, Y., Liu, X. B., Pleasure, D. E., Deng, W. Axon-glia synapses are highly vulnerable to white matter injury in the developing brain. J Neurosci Res. 90 (1), 105-121 (2012).
- Shen, Y., Plane, J. M., Deng, W. Mouse models of periventricular leukomalacia. J Vis Exp. (39), (2010).
- Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
- Tremml, P., Lipp, H. P., Müller, U., Ricceri, L., Wolfer, D. P. Neurobehavioral development, adult openfield exploration and swimming navigation learning in mice with a modified beta-amyloid precursor protein gene. Behav Brain Res. 95 (1), 65-76 (1998).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72 (2), 251-264 (1974).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Del Bigio, Long-term motor deficit following periventricular hemorrhage in neonatal rats: A potential model for human cerebral palsy. J Cerebr Blood F Met. , (2005).
- Williams, E., Scott, J. P. The Development of Social Behavior Patterns in the Mouse, in Relation to Natural Periods. Behaviour. 6 (1), 35-65 (1954).
- Heyser, C. J. Assessment of developmental milestones in rodents. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. Q., et al. Chapter 8, (2004).
- Corti, S. Grip strength TREAT-NMD: Experimental protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ (2014).
- Corti, S., Nizzardo, M., et al. Neural stem cell transplantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 118 (10), 3316-3330 (2008).
- Grondard, C., Biondi, O., et al. Regular exercise prolongs survival in a type 2 spinal muscular atrophy model mouse. J Neurosci. 25 (33), 7615-7622 (2005).
- El-Khodor, B. F. Behavioral Phenotyping for Neonates. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
- El-Khodor, B. F., Edgar, N., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212 (1), http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ 29-43 (2008).
- Venerosi, A., Ricceri, L., Scattoni, M. L., Calamandrei, G. Prenatal chlorpyrifos exposure alters motor behavior and ultrasonic vocalization in CD-1 mouse pups. Environ Health. 8 (12), (2009).
- Hill, J. M., Lim, M. A., Stone, M. M. Developmental milestones in the newborn mouse. Neuromethods 39: Neuropeptide Techniques. , Humana Press. New Jersey. (2008).
- Visual dependence influences postural responses to continuous visual perturbation in adults with spastic cerebral palsy. Yu, Y., Keshner, A. E., Tucker, C. A., Thompson, E. D., Lauer, R. T. Combined Sections Meeting of American Physical Therapy Association, Anaheim, CA, USA, , (2016).
- Carlson, G. The use of four limb hanging tests to monitor muscle strength and condition over time. Experimental Protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.005.pdf (2011).
- Gordon, A. M., Duff, S. V. Relation between clinical measures and fine manipulative control in children with hemiplegic cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 41 (9), 586-591 (1999).
- Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int J Pediat. , (2012).
