Introduction
Utvikling av nye modeller for pediatrisk skade eller sykdom ved hjelp av gnagere er ofte vanskelig på grunn av den fantastiske evnen til både rotter og mus til å raskt gjenopprette fra nevrologiske skader. Derfor, for å validere eventuelle nye pediatrisk sykdomsmodell, grundig undersøke cellulære og molekylære endringer må gå hånd i hånd med atferds utfall. På mange måter kan funksjonell atferds utvinning være viktigere enn underliggende celleforandringer i form av terapeutisk eller translasjonsforskning relevans. Som forskere lære mer om skader i den voksne og nyfødte, er det klart at deres svar er svært forskjellige og kan ikke ekstrapoleres mellom de to. For eksempel, neonatale mus viser forskjellige nivåer av nervevekstfaktor, hjerne-avledet neurotrofisk faktor, neurotrofin-3 og glial cellelinje-avledet neurotrofisk faktor følgende ryggmargsskade 1,2. I tillegg nyfødte har betydelig blod-hjerne-barrieren lekkasje etter hjerneslag 3 demonstrate kortikale nevroner omorganisering etter perifer nerveskade 4, og har en forsinket eller bremset astrogliosis etter ryggmargsskade og hypoksi-iskemi 5,6. Derfor er det viktig at translasjonsforskning pediatrisk forskning bruke utviklingstilsvarende modeller og at disse modellene er vurdert for både mobil / molekylære endringer og alderstilpasset atferdstester.
Cerebral Parese (CP) er en motor lidelse som rammer 3: 1000 levendefødte per år (NIH). Barn med CP oppvise en rekke symptomer og co-sykelig forhold, avhengig av alvorlighetsgraden av sykdommen. Vanskeligheter med bevegelse og koordinasjon er de vanligste tegnene, sammen med forsinkelser i å nå motoriske utviklingsmessige milepæler. Andre tegn er unormal muskeltonus (enten økt eller redusert), redusert finmotorikk, vanskeligheter med å gå, overdreven sikling og svelging og tale forsinkelser (NIH). Den underliggende årsak til CP antas å væremangel på oksygen og / eller blodstrømmen til hjernen under pre- eller peripartum periode, eller inntil ett år etter fødselen. I tillegg er betennelse nå antatt å være en sentral komponent i utviklingen av CP.
Flertallet av CP tilfeller er forbundet med hvit substans skade rundt ventriklene, kjent som periventrikulær leukomalacia (PVL). Dette nevrologiske kjennetegn tyder på at den første fornærmelse fører til CP oppstår i løpet av hjernens utvikling når oligodendrocytes er mest sårbare for fornærmelse. Perioden med rask oligodendrocyte vekst i et menneske, også den perioden da oligodendrocytes er mest utsatt for skader, er mellom 24 - 32 ukers svangerskap. I gnager, er den tilsvarende perioden barsel dager 2 - 7 7, og er når CP blir indusert i denne modellen.
Den neonatale mus modell av CP som ble brukt til å utføre testene som er skissert her kombinerer hypoksi og iskemi med betennelse å skape en injUry at bedre etterligner neurodegenereringen sett i menneskelig CP. Denne modellen løser noen av de store mangler som observeres i andre dyremodeller av CP, som mangler distinkte motoriske mangler som ligner humane pasienter i KF, samt tydelig hvit substans skade. Tidligere studier av en samarbeidspartner ved hjelp av samme modell har vist at tilsetning av betennelse øker hvit substans skade, og dermed bedre emulere PVL sett på barn med CP 8. Bygge på tidligere data, presenterer dette papiret en omfattende batteri av neonatal motoriske tester for å vurdere endringer i motor adferd som dyret aldre.
Protocol
MERK: Alle dyre operasjoner ble utført i samsvar med Temple University ular avdeling og IACUC retningslinjer og prosedyrer. C57BL / 6 dammer og okser ble kjøpt fra Charles River Laboratories og ble plassert i avl bur med en 12 timers lys / mørke syklus (lys på 07:00 til 19:00) med fri tilgang til mat og vann. Hekkende par produsert kullstørrelse mellom 5 - 10 valper.
1. Cerebral Parese Induksjon Surgery
- MERK: Cerebral parese ble indusert ved hjelp av postnatal dag (PND) 6 museunger, som tidligere beskrevet 8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia).
- Plasser en valp i en glassbolle på isen med et laboratorium tørke for å beskytte valpen hud. Se etter passende bedøvelse planet ved foten klemme og mangel på bevegelse. Flytt valpen til en polstret ispose for kirurgi.
- Steril huden på pup ved bruk av 70% etanol. Når tørr, bruk en # 11 steril kirurgisk blade og lage en 1 cm snitt i halsen.
- Ved hjelp av en stereoskopisk kirurgisk mikroskop, isolere høyre halspulsåre med en liten krok og cauterize bruker en bærbar håndholdt cauterizer. Visuelt bekrefter at arterien er blokkert. Sham kirurgi omfatter visualisering og isolering av den felles halsarterie uten kauterisering.
- Juster huden og tett med sutur lim (n-butyl cyanoacrylate).
- Plasser valpen på en 34 o C oppvarming pad for 30 min å overvåke for spontan pusting og normal bevegelse.
- Gå tilbake valpen (e) til dam i 30 min.
- Plasser valpene på en varmepute eller annen oppvarming enhet satt til 34 o C i en hypoksi kammer satt til 6% oksygen for 35 min. Oksygen er erstattet med nitrogen. Følge nøye kammeret oksygennivå og temperatur for konsistente skade resultater.
- Fjern valpene fra hypoksi kammer og returnere dem til varmeputen.
- Intraperitonealt injisere lipopolysakkarid fortynnet i sterilt saltvann på en mikrogram / kg og gå tilbake valpen til demningen. Sham injeksjoner er injeksjoner av saltvann bare.
2. Neonatal Motor Tester
MERK: På PND 8, 48 timer etter at CP induksjon, er museunger testet for nevro utvikling. Pups testes i en 4 timers blokk før middag, for å eliminere tid på døgnet forskjeller i oppførsel. Pups fjernes fra dammen for ikke mer enn 15 minutter av gangen for å forhindre hurtig tap av kroppsvarme og sult / separasjonsproblemer. I tillegg er pups lov til å hvile på mellom testene, slik at maksimal innsats vil bli utløst i hver test. Grunnlaget for neonatale motoriske tester er tilpasset bruker Fox batteri av tester 10,11 og Wahlsten sin tilpasning av Fox tester 12, samt behandle-NMD og annen atferd publikasjoner (som nevnt i teksten for hver test). Fox batteri av tester som er aktuelle for PND 2 - 21. Av Fox tester, battery tilstede her inkluderer: rettende refleks, fatte refleks, negative geotaxis (kalt vertikal skjerm test i Fox batteri) og fire lemmer grep styrke (modifisert fra Fox og Wahlsten skjerm klatre tester). Her er ambulation, front-lem styrke, og bakben styrke også testet for å skille refleksiv motor atferd mellom simulert og CP museunger. For å eliminere forbedringer på testing på grunn av læring, ble tester begrenset til maksimalt 3 forsøk der det er angitt. Alle andre testene hadde bare ett forsøk per dyr.
- Flytting av pasienten (figur 1) (tilpasset fra et rotte-protokoll 13):
MERK: Crawling er en atferd utviklet tidlig i musen valpen mellom PND 0-5, og da musene begynner å gå over til å gå, fra 5 - 10 dager gamle 14. På PND 8, tar ambulation test nytte av denne overgangs tid kurset. Ambulation kan imidlertid bli scoret i hele levetiden til en mus, og kan bestemmes i alle aldre.Siden det ikke er potensial for læring, kan bevegelse og testen gjentas så mange ganger som nødvendig gjennom i løpet av forsøket.- Plasser mus i en klar avlukke hvor mus er synlig fra oversiden så vel som på siden. Bruk milde prodding ved å berøre valpen hale å motivere valpen til å gå.
- Resultat ambulation for 3 min ved hjelp av følgende skala: 0 = ingen bevegelse, 1 = gjennomgå med asymmetrisk lem bevegelse, 2 = sakte kryp men symmetriske lem bevegelse, og 3 = rask krypende / gang.
MERK: Her er symmetrisk lem bevegelse beskrevet hvor hindpaws møte frontpaws under hvert trinn, og hvert trinn jevnt overganger til neste trinn. En mus viser asymmetrisk lem bevegelse har uberegnelig labben plassering og overganger fra ett trinn til neste er ujevne.
Figur 1. overgangen fraKrypende til Walking kan skilles ved å observere bakpote, samt hode og hale. (A) Under gjennomgang, hele ryggen labben, fra tærne til hælen, berører bakken når ambulerer, som angitt ved (*). En voksen gangmønster er sett når bare tær og fremre del av bakpote berører bakken (hælen er forhøyet, deonoted etter [**]). (B) hode og hale av en krypende mus er lavt til bakken. Hodet begynner å stige ved overgangen fra krypende til å gå. Overgangen er fullført når både hode og hale er forhøyet og bare forsiden av bakpote berører bakken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bakben Foot Angle (figur 2)
MERK: Det er en åpenbar utviklings endring i bakben holdning som mouse modnes fra krypende til turgåing, hvor bakbena er plassert under kroppen når du går og vinkelen mellom bakbena er mindre enn vinkelen sett i gjennomgangen. Selv om bakben foten vinkel endrer seg over tid, kan museunger på samme alder med ulike skader eller sykdommer sammenlignes. I likhet med oppegående test (3,1), er det ikke noe potensial for læring. Således kan det bakben fot vinkel testen gjentas så mange ganger som nødvendig gjennom i løpet av eksperimentet.- Enten i en klar åpent felt boks eller et lukket område, montere et videokamera fra under eller over henholdsvis, for å registrere valpen når den beveger seg rundt feltet. Bruk milde prodding ved å berøre valpen hale å motivere valpen til å gå. Rekord for to minutter.
- Ved hjelp av videoinnspillinger, måle vinkelen foten av valpene ved å tegne en linje fra enden av hælen / leggen til spissen av den lengste (i midten) tå. Bare ta målingen når valpen utfører en full skridei en rett linje, og begge føttene er flatt på bakken. Ikke ta målinger mens valpen er i ro eller mens valpen er å snu.
- Mål tre til fem sett med foten vinkler og beregne gjennomsnittlig vinkel for hver valp testet.
Figur 2. bakben Foot Angle kan brukes til å bestemme Gait Unormalt. Foten vinkel kan måles ved å tegne en linje fra midten av hælen gjennom midten (lengste) siffer. Skadde dyr har en større fot vinkel i forhold til normal (se Representant Resultater, Foot Angle). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Surface rettende (figur 3):
MERK: Den rettende refleks er motoren muligheten for en mus valp å være i stand til å snu på fote fra liggende stilling. Gjennomsnittsalderen for retningsrefleks skal vises hos gnagere er PND 5 med et utvalg fra PND 1 -. 10 15 Ettersom denne testen er en refleks, er det ingen lære komponent og den kan gjentas i hele perioden eksperimentering.- Plasser valper på ryggen på en bomull ark eller benk pute og hold det på plass i 5 sek.
- Slipp valpene og notere tiden det tar pup å vende tilbake til liggende stilling, samt retningen av stabiliserings (venstre eller høyre). Totalt en min er gitt for hvert forsøk, om nødvendig.
- Gjenta til totalt tre forsøk.
Figur 3. Overflaterettende. Denne testen krever trunk kontroll og kan teste for postural ubalanser. Menneske CP pasienter kan ha underskudd i sin kjerne.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Negativ Geotaxis (figur 4)
MERK: Gjennomsnittsalderen for negative geotaxis refleks skal vises i gnagere er PND 7 med et utvalg fra PND 3-15 15 Den negative geotaxis testen vurderer motorisk koordinasjon hos unge mus.. Mus er plassert vendt nedover en skråning, og på grunn vestibulære signaler om gravitasjon, valpene skal møte opp skråningen. Responsen på stimuli, eller drosjer, er en medfødt atferd.- Plasser valpen med hodet pekende nedover på en 45 o skråning og hold den inne i 5 sek.
- Slipp valpen og registrere tid og retning valpen snur seg mot oppover. Total testing tid er 2 min.
- Gjenta til totalt tre forsøk. Mus som faller ned skråning eller unnlater å snu kan være enten re-testet, elimineres, eller gitt en null poeng.
MERK: Denne beslutningen er left til sensor, som tidvis valpene vil rulle ned skråning på grunn av søvnighet heller enn svakhet. Når beslutningen er gjort på hvordan å score unger som faller ned skråning, bør det bemerkes i metoder og bør være konsekvent gjennom testing av alle fag.
Figur 4. Negative Geotaxis. Motor og vestibular må angis for musen til å anerkjenne sin orientering i en skråning og snu. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Front-lem Suspension (figur 5) 16; tilpasset fra 17, 18:
MERK: Front-lem suspensjon tester forbena styrken av valpene, inkludert arm og pote styrke. Tsin test er ikke anbefalt for valper yngre enn PND 10 15. Unger har lov til å gripe en wire spent over et stabilt objekt og henge på tråden med begge forpotene. Testingen området er over en polstret slippsonen. Testen kan oppdage høyre / venstre side styrkeforskjeller. Læring og fravær av negativ forsterkning kan føre til økt ikke-deltakelse. Mus som faller umiddelbart når den frigis eller manglende evne til å gripe når den plasseres på ledningen indikerer ikke-deltakelse.- Hold valpene godt av kroppen og gjøre dem i stand til å ta tak i tråden med begge forpotene.
- Slipp valpen. Ved hjelp av et tidsur eller stoppeklokke, registrerer den totale tiden til å falle, samt labben svakhet.
MERK: Paw svakhet blir bestemt om en pup gående faller fra ledningen med en labb før den andre i stedet for å frigjøre fra ledningen med begge poter på samme tid. - Gjenta test for totalt tre ganger.
Figur 5. Front Limb Suspension. Denne suspensjon test forårsaker spenninger i forbein til muskeltretthet. Med denne tilnærmingen, baseline styrke i forbein er etablert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bakben Suspension (figur 6):
MERK: Denne suspensjon testen avgjør bakben styrke. Det er en test utviklet spesielt for nyfødte og ble først anvendt på dyr mellom PND 2-12 19,20, men kan tilpasses for mus opp til PND 14. Denne testen kan påvise høyre / venstre bakben styrkeforskjeller, så vel som neuromuskulær funksjon. En standard 50 ml konisk anvendes, polstret med laboratorie våtservietter. I likhet med det fremre lem-suspensjonstest, kan denne testen læres, spesielt since det er ingen negativ konsekvens til å falle. Således økte ikke-deltakelse, sett fra mus som faller så snart som frigjøres eller unnlatelse av å holde seg når den plasseres på kanten av røret, kan nevnes.- Ved hjelp av en 50 ml konisk, sted valpen forsiktig med forsiden ned i røret med bakbena hang over kanten.
- Slipp valpen. Observer bakben holdning.
- Score stilling i henhold til de følgende kriterier.
MERK: Score på 4 indikerer normal bakben separasjon med halen hevet; score på 3 betyr svakhet er tydelig og bakbena er tettere sammen, men de sjelden berører hverandre; score på 2 angir bakbena er nær hverandre, og ofte rørende; score på 1 viser en svakhet er tydelig og bakbena er nesten alltid i en foldet stilling med halen hevet; en score på 0 indikerer konstant spenne av bakbena med halen senket eller unnlatelse av å holde på røret i lengre tid. - Telle trekker hvis det er nødvendig. Et trekk er qualsert ved at pup forsøk på å løfte sin kropp ved hjelp av sine bakben mens opphengt på siden av det koniske rør.
- Ved hjelp av et tidsur eller stoppeklokke, registrerer ventetid for å falle.
- Gjenta hele testen i tre eksemplarer.
Figur 6. bakben Suspension. (A). Denne suspensjon test forårsaker spenninger i bakbena til muskeltretthet. Baseline styrke og holdning i bakbena er etablert. (B). Skåring. Merk tallene ovenfor de representative mus som viser den mulige holdning poengsum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Grip Styrke (figur 7):
MERK: Denne testen vil undersøke labben strength av alle fire poter på samme tid. En 16 x 18 glassfiber skjerm wire brukes. Den gjennomsnittlige alderen for en gnager å være i stand til å gripe en horisontal skjerm er PND 8 med et område fra PND 5 - 15 15 Fox brukte fire lem horisontale screen test fra PND 2 -.. 21 10 Denne testen er modifisert i forhold til standarden horisontale skjermen test; her skjermen roteres langsomt fra en horisontal til vertikal stilling, for å utfordre gripe av alle fire lemmer 21; tilpasset fra Corti S 16. Hvis musen holder på mesh skjermen når invertert til 180 °, registrerer ventetid for å falle. Vær også oppmerksom på kroppsvekten. En hengende impuls kan beregnes som [vekt (g) x latens til å falle (sek)] reflekterer den kraft som er nødvendig for å motstå tyngdekraft.- Ved hjelp av et stykke av netting, plasserer valpen på skjermen. La valpen å venne seg til dette miljøet for ca 5 sek.
- Snu skjermen langsomt til 180 grader. Spill omtrentlig hjørner av pae på skjermen når valpen faller av.
- Gjenta for totalt tre forsøk og gjennomsnittlig forsøkene.
Figur 7. grep styrke. Mus er nødvendig for å opprettholde muskelspenninger i alle fire lemmer som tyngdekraften øker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Grasping Reflex (figur 8)
MERK: fatte refleks vises vanligvis hos gnagere ved PND 7 med et utvalg fra PND 3-15 15 hver pote er testet individuelt, og dermed testen kan avsløre front- eller bakben problemstillinger, samt ensidighet problemer.. Som det er en refleks, kan denne testen gjentas helt til refleks vises. Det er ikke utsatt for læring. Som en viktig påminnelse, denne testen skiller ikke fatte styrke, bare evnen, og må testes før 15 dager gammel da juvenile mus begynner å forstå på grunn av frykt respons.- Hold mus med storm dens hals, på samme måte som en mus pup bæres av demningen. Denne hold fører til at valpen blir instinktivt immobile og avslappet, noe som åpner for enkel testing.
- Stroke hver pote av valpen med den butte, avrundede siden av et barberblad.
- Test hver pote individuelt og registrere tilstedeværelse eller fravær av fatte og scorer 1 poeng per pote med hvor muse griper.
MERK: scoring for høyre pote preferanse er 100% for høyre pote preferanse, - - -100% for venstre labb preferanse, 50% for begge poter fatte, og 0% for ingen poter fatte. Ligningen for å bestemme disse tallene er [(høyre pote - venstre pote) / (høyre pote + venstre pote + begge poter)] x 100%.
/53569/53569fig8.jpg "/>
Figur 8. fatte Reflex. Fordi neonatal mus ikke har en sterk frykt respons, denne testen strengt bestemmer plantar / palmar refleks. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Cliff Avsky (figur 9):
MERK: Cliff aversjon tester Labyrint reflekser, samt styrke og koordinasjon, og kan brukes til å teste valper fra PND 1-14 22. En pre-duftende boksen (en boks hvor et minimum av 5 mus har fått lov til å fritt kan bevege deg) med en flat forhøyet avsats er brukt og valpen er plassert med sifrene eneste av sine forpotene og deres snute plassert over kanten. Scoring utføres ved å telle den totale tiden det tar valpen å vende seg bort fra stupet og flytte sine poter og snute bort fra kanten. Hvis ingen respons ses etter 30 sek, blir testen avsluttet.Hvis valpen faller utenfor kanten, kan en eneste ekstra rettssak skal gjennomføres.- Ved hjelp av en side-visning, plasserer valpen på kanten av den pre-duftende boksen, noe som gjør at de framlabbene, tall og snute er de eneste delene over kanten.
- Slipp valpen og starte tidtakeren.
- Når både snute og poter har blitt fjernet fra kanten, stoppe tidtakeren og rekordtid.
- Gjenta test for totalt 3 forsøk. Hvis valpen ikke beveger seg bort fra stupet løpet av 30 sekunder, er ingen poeng gitt.
MERK: Bestemmelsen om at valpen er en ikke-deltaker versus svekket er igjen opp til skjønn av sensor. Høyden på klippen kan bli justert for alder av valpen for å forsikre valpen sikkerhet. En mindre høyde kan brukes sammen med en svart "gulv" for å etterligne en større høyde.
Figure 9. Cliff Avsky. vestibulære ubalanser måles i den klippen aversjon test. Her er valpen øyne fortsatt stengt så frykt ikke er den drivende faktor for å vende seg bort fra stupet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Statistisk signifikans
- Ved hjelp av en statistisk programvare analysere resultatene. Uttrykke dataene som gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien (SEM). Tester er parametrisk og dermed undersøke data ved hjelp av t-test analyser.
MERK: Forsøk ble ikke laget for å teste for kjønnsforskjeller. Forskjeller vurderes å være statistisk signifikant når p <0,05.
Representative Results
Musene ble testet fra P7 (24 timer etter operasjonen) til P13 (en uke etter operasjonen), ved hjelp av ulike mus for hver gang-punkt, slik at det å lære en testing paradigme var ikke en konfunderende variabel. P8 ble valgt som representative resultater, som mus viste størst underskudd på dette tidspunkt.
Overgang fra Crawling til Walking er forsinket i CP Neonatal Mus
Menneske CP pasienter har ganglag abnormiteter, alt fra tå-walking til en scissored gangart. Ettersom dette CP modellen viser gangart underskudd tilsvarende for mennesker, ble bevegelse og vurdert. Mus ble scoret på gangart symmetri og lem-labben bevegelse under en rett gange. På 48 timer etter operasjonen (PND 8), CP mus hadde mindre symmetriske lem bevegelse og en "krypende" gange i forhold til sine falske kolleger (gjennomsnittlig ambulation poengsum: CP 1,083 ±0,6337, n = 12 vs humbug 1,639 ± 0,4859, n = 9; p <0,05, figur 10). Ved en uke, har både CP og humbug mus gått over til å gå (data ikke vist).
Figur 10. CP Muse Pups ikke ambulate samt Shams. Sham mus (svart strek) har en gjennomsnittlig score på 1,639 ± 0,4859 (n = 9), noe som betyr at deres ambulerende utvikling faller mellom asymmetrisk lem bevegelse og sakte krypende. CP mus (grå bar) mottar en gjennomsnittlig score på 1,083 ± 0,6337 (n = 12), noe som betyr at deres bevegelse og er mindre utviklet og har en tendens til å ha asymmetrisk lem bevegelse. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM; * Er p <0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Hindlimb Foot Angle økes i CP
I tillegg til bevegelse og ble bakben fot-vinkel vurdert. Åtte dager gamle humbug museunger gå med sine hindpaws vendt forover, mot HIL mus, som har sprikende hindpaws når de går i en rett linje (figur 2; gjennomsnittlig vinkel: CP 77,48 ± 9,848, n = 9, vs humbug 54,54 ± 8,043, n = 11, p <0,0001, figur 11). Denne økede vinkel korrelerer med gangart ustabilitet, ved at ungene behov for å øke vinkelen sine bakre poter for å stabilisere deres gangart og hjelpe til med balanse og koordinasjon.
Figur 11. CP Mouse Pups spriker deres Hindpaws når han går. CP mus (svarte striper) har en gjennomsnittlig vinkel mellom deres bakbena fra 77,48 ± 8,043 (n = 11), mens humbug mus (grå b ars) har en gjennomsnittlig vinkel på 54,54 ± 9,848 (n = 9). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM; **** Er p <0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
CP Mus Ikke vis Underskudd når Surface rettende
Overflaten rettende test ble inkludert som noen CP pasienter har nedsatt bolkontroll (Heyrman et al., 2013). I tillegg er det vestibulære systemet nødvendig for å avdekke behovet for rettende og det er vestibulære underskudd i enkelte pasienter i KF 23. CP mus viser ikke vesentlige mangler når rettende i forhold til falske kontroller (data ikke vist).
CP Mus utføre de samme som Sham i negativ Geotaxis Testing
t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Negativ geotaxis brukes til å teste motorisk koordinasjon hos unge valper Mus blir utfordret av å være plass i nedoverbakke på en skrå flate Forsinkelse eller manglende orientere oppoverbakke kan indikere underskudd.. i koordinasjon, balanse, eller vestibular innspill. CP mus viser ingen underskudd når utfordret med negative geotaxis sammenlignet med humbug mus (data ikke vist). i tillegg har CP mus viste ikke en preferanse for å slå mot den ene siden mot hverandre når re-orienterings .Front-Limb Suspension Testen er egnet for Mus Eldre enn 10 dager
CP pasienter har nedsatt muskeltonus og underskudd i finmotorikk, som for eksempel å ta tak. For å teste svakhet i denne musen modellen, brukte vi en front-lem suspensjonstest. Videre bruker denne modellen ensidig iskemisk skade og ensidig-ness kunne bestemmes ved hjelp av denne suspensjon test. denne testener bedre for mus eldre enn 10 dager 15. På 8 dager gammel, to dager etter skade, var det ingen signifikante forskjeller mellom CP og humbug mus (data ikke vist).
Bakben styrke er redusert i CP Mus
Menneske CP pasientene trenger ofte bukseseler eller ganghjelpemidler enheter på grunn av manglende motorisk kontroll og styrke. For å sammenligne den gnager CP modell for mennesker, ble bakben styrke vurdert ved hjelp av bakben suspensjonstest. Når opphengt fra siden av en konisk tube, CP mus viste bakben svakhet, som vist ved en reduksjon i hengende score (bakben hengende Resultat: CP 3,468 ± 0,5561, n = 13, vs narre 3,891 ± 0,1329, n = 13, p < 0,05, figur 12). Det ble ikke observert forskjell i bakben suspensjon tid (data ikke vist). Dermed ligner menneskelige pasienter i KF, CP mus demonstrere hindlIMB (leg) svakhet.
Figur 12. Sham Mus er litt, men betydelig sterkere i sine bakbena enn CP Mus. På en gjennomsnittlig hengende score på 3,891 ± 0,1329 (n = 13), humbug mus (svart strek) viser mer bakben separasjon, og dermed en sterkere bakben holdning, når hengende på kanten av et rør enn CP mus (grå bar) med en gjennomsnittlig hengende score på 3,468 ± 0,5561 (n = 13). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM; * Er p <0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Grip Styrke er redusert som en følge CP Injury
Fatte med alle fire poter er viktig for en gnager inår det gjelder klatring og kjører over ujevnt underlag. Grip krever betydelig vedvarende styrke, snarere enn fingerferdighet eller lineær kraft, hovedsakelig i tallene og labber 24. Mus ble kreves for å holde kroppsvekten på en invertert trådnett. CP mus var ikke i stand til å opprettholde sitt grep, og disse musene falt til betydelig lavere vinkler (fire lemmer gjennomsnittlig vinkel: CP 75,627 ± 24,48, n = 11, vs humbug 96,57 ± 10.836, n = 9; p <0.05, Figur 13). Disse data viser at det er en betydelig underskudd i gripestyrke i CP mus.
Figur 13. CP Mus har Svakere Grip enn Shams. Sham mus (svart strek) kan gripe til et gjennomsnitt omvendt vinkel på 96,57 ± 10,836 (n = 9). CP mus (grå bar) bare kan nå en omvendt vinkel på 75,627 ± 24,48 (n = 11). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM; * Er p0; 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Grasping Refleks Underskudd er tydelige i CP Mus
Sammen med grovmotoriske underskudd, er finmotoriske bevegelser også svekket hos pasienter i KF 25,26. Den fatte refleks hos mennesker er til stede ved fødselen og forsvinner rundt 5-6 måneder. Imidlertid, endringer i griperefleks, slik som overdrevet hastighet eller styrken av gripe, svikt for å gripe, eller den nye generasjonen av griperefleksen etter 6 måneders alder, alt indikere skade på nervesystemet. Å sammenligne fatte i CP-modellen, ble refleksive grasping underskudd bestemt.
På 48 timer etter skade, CP mus viser en nedgang i griperefleks (gjennomsnittlig poter greppå 48 timer: CP 2,429 ± 0,9376, n = 14, vs humbug 3,214 ± 0,8018, n = 14; p <0,05, figur 14A). Det var en svak, men ikke signifikant økning i høyre pote preferanse i forpotene (data ikke vist). Det var en signifikant rett labb preferanse i hindpaws (CP 75.0 ± 42.74, n = 14, vs narre 17,86 ± 54,09, n = 14, p <0,005, figur 14B). En uke etter skade, CP mus viser fatte underskudd (gjennomsnitt poter grep på en uke: CP 2,75 ± 1,035, n = 8, vs humbug 3,80 ± 0,6325, n = 10, p <0,05, figur 14C), uten merkbar pote preferanse .
Figur 14. CP Mus har fatte underskudd, i Hindpaws, kontralateral til Skadet Brain Region. (A) 48 timer etter skade (PND 8), CP mus (grå linje) gripe en pinne med i gjennomsnitt færre poter enn humbug animals (svart strek). (B) CP mus (grå bar) viser en preferanse for å ta tak med høyre bakpote (kontralateral til skade) i motsetning til ved hjelp av venstre bakpote (ipsilaterale til skade). Sham mus (svart strek) vises ikke denne retten labben preferanser. Høyre labb preferanse er beregnet som ([right pote - venstre pote] / [right pote + venstre pote + begge poter] * 100) (C) En uke etter skade, CP mus (grå linje) fortsatt viser fatte underskudd i forhold til. shams (sort strek). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM; * Er p <0,05, ** er p <0,005. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
CP Mus vende seg bort fra kanten Under Cliff Avsky
Klippen aversjon testen er avhengig av den iboende frykt for musene å slå away fra en bratt skrent og hodet mot sikkerhet. Selv om noen pasienter i KF har vestibulære vansker, samt svekket motorisk kontroll, gjorde CP mus viser ingen underskudd på denne testen.
Discussion
Ved hjelp av dyremodeller for å undersøke menneskelige sykdommer er bare aktuell dersom det er overlapp mellom de cellulære og molekylære reaksjon mellom menneske og gnager, og at de atferdsmessige prøver som er utført har direkte relevans til humane symptomer. En av de store problemene med pediatriske sykdomsstudier er at mange forskere bruker voksne gnagere å lage modellen, samt voksen gnager atferdsvurdering, uten å vurdere utviklingsforskjeller som kan være viktige for sykdomsprosessen. På grunn av disse problemene, er det viktig at forskning på pediatrisk sykdom bruk ikke bare riktig justerte utviklings tidspunkter (f.eks menneskelig CNS utvikling på 28 - 32 uker tilsvarer en postnatal dag 2-7 dagers gnager) 7, men også atferdstester som vil undersøke passende motor, sensoriske eller refleksive utviklings atferd. Således, ettersom hver ny neonatale sykdomsmodell er utviklet, det skal være grundig testet for å sikre at den cellulæreog atferdsmessige responser vil gi de mest aktuelle oversett data mellom gnagere og menneske.
Cerebral parese er en motor lidelse, noe som vedvarer inn i voksenlivet. Et problem med mange av cerebral parese modeller tilgjengelig i dag er mangelen på repeterbare, standardisert motor testing som kan korrelere med underskudd sett i pediatriske pasienter. I denne nye modellen, som kombinerer hypoksi, ischemi og betennelse i en neonatal mus, ble motor atferd evaluert ved hjelp av et batteri av tester som er spesifikke for neonatale mus. For å redusere den subjektivitet og øke den kvantitative rapportering, har flere tester blitt modifisert til å inkludere meget spesifikk, men lett å vurdere tiltak som kan standardiseres. I tillegg kan front- og bakben evalueringer utføres separat, og venstre / høyre forskjeller kan bestemmes. Dette batteri av tester er spesifikk for neonatale mus inntil to ukers alder.
Dette CP modellen viserproblemer med å gå (ambulation, bakben foten vinkel), samt lem spesifikke svakhet (fire lemmer suspensjon, bakben suspensjon), og underskudd i utviklings reflekser (fatte refleks). Selv om det i denne studien bare en endepunktet ble undersøkt, kan disse mangler spores over tid.
Det er andre batterier av tester som kan brukes på nyfødte, slik som Fox batteri av tester eller Heyser vurdering av utviklingsmessige milepæler 15. Men disse testene sammenligne den nyfødte til voksne, hvis svar kan ikke være det samme fordi det nyfødte barnet er fremdeles under utvikling. Fox batteri og Heyser er Assement tester stole på observasjons subjektiv informasjon med dikotom (ja eller nei) vurdering, heller enn objektive data (vinkel, holdning basert på styrke, etc). På grunn av den subjectiveness av disse testene, har mange forskere tilpasset, lagt til, eller fjernes kriterier, og dermed gjøre sine resultater makeløs til andre og begrenseing nytten av data i form av å etablere en baseline underskudd for en bestemt sykdom eller lidelse. Ved å etablere ett sett med standardiserte motoriske tester som er kvalitativ og spesielt utviklet for å teste nyfødte, kan resultatene fra enkelte forskningsmiljøer være nøyaktig og pålitelig rapportert og sammenlignet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | STRAIN CODE: 027 | C57BL/6NCrl is the exact strain we use |
| Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish | Corning Life Sciences Glass | 3140125 | Capacity: 25.03 oz. (740ml); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399). |
| Covered lead ring | Fisher Scientific | S90139C | Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish. |
| Scalpel Blade #11 | World Precision Instrucments, Inc. | 500240 | |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Micro Hook | Fine Science Tools | 10064-14 | |
| Vetbond Suture Glue | 3M | 1469SB | n-butyl cyanoacrylate adhesive |
| Lipopolysaccharide | Sigma Life Science | L4391 | Lipopolysaccaride from E.coli 0111:B4, gamma irradiated |
| 12 x 12 inch opaque box | Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics | C4022 | Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H; http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html |
| Camera/camcorder | JVC | GC-PX100BUS | Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder. |
| Covidien Tendersorb™ Underpads | Kendall Healthcare Products Co | 7174 | |
| WypAll L40 | Kimberly-Clark Professional | 5600 | Any surface with moderate grip will do |
| Surface at 45 degree incline | We use a cardboard box. | ||
| Thin wire from a pipe cleaner | Creatology | M10314420 | Any pipe cleaner from any craft store will work. |
| 50mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| Fiberglass Screen Wire | New York Wire www.lowes.com | 14436 | Any supplier can be used as long as their screen is 16 x 16 or 18 x 16 |
| Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work. |
| OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway | PLASKOLITE INC | 1AG2196A | Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2" x 2"; (3) 2" x 18"; (1) 2" x 15.5"; (1) 2" x 3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning. |
| Protractor | Westscott | ACM14371 |
References
- Nakamura, M., Bregman, B. S. Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury. Exp Neurol. 169 (2), 407-415 (2001).
- Widenfalk, J., Lundströmer, K., Jubran, M., Brene, S., Olson, L. Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid. J Neurosci. 21 (10), 3457-3475 (2001).
- Fernández-Lòpez, D., Faustino, J., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Cusick, C. G. Extensive cortical reorganization following sciatic nerve injury in adult rats versus restricted reorganization after neonatal injury: implications for spatial and temporal limits on somatosensory plasticity. Prog Brain Res. 108, 379-390 (1996).
- Barrett, C. P., Donati, E. J., Guth, L. Differences between adult and neonatal rats in their astroglial response to spinal injury. Exp Neurol. 84 (2), 374-385 (1984).
- Villapol, S., Gelot, A., Renolleau, S., Charriaut-Marlangue, C. Astrocyte Responses after Neonatal Ischemia: The Yin and the Yang. Neuroscientist. 14 (4), 339-344 (2008).
- Craig, A., Ling Luo, N., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Exp Neurol. 181 (2), 231-240 (2003).
- Shen, Y., Liu, X. B., Pleasure, D. E., Deng, W. Axon-glia synapses are highly vulnerable to white matter injury in the developing brain. J Neurosci Res. 90 (1), 105-121 (2012).
- Shen, Y., Plane, J. M., Deng, W. Mouse models of periventricular leukomalacia. J Vis Exp. (39), (2010).
- Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
- Tremml, P., Lipp, H. P., Müller, U., Ricceri, L., Wolfer, D. P. Neurobehavioral development, adult openfield exploration and swimming navigation learning in mice with a modified beta-amyloid precursor protein gene. Behav Brain Res. 95 (1), 65-76 (1998).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72 (2), 251-264 (1974).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Del Bigio, Long-term motor deficit following periventricular hemorrhage in neonatal rats: A potential model for human cerebral palsy. J Cerebr Blood F Met. , (2005).
- Williams, E., Scott, J. P. The Development of Social Behavior Patterns in the Mouse, in Relation to Natural Periods. Behaviour. 6 (1), 35-65 (1954).
- Heyser, C. J. Assessment of developmental milestones in rodents. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. Q., et al. Chapter 8, (2004).
- Corti, S. Grip strength TREAT-NMD: Experimental protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ (2014).
- Corti, S., Nizzardo, M., et al. Neural stem cell transplantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 118 (10), 3316-3330 (2008).
- Grondard, C., Biondi, O., et al. Regular exercise prolongs survival in a type 2 spinal muscular atrophy model mouse. J Neurosci. 25 (33), 7615-7622 (2005).
- El-Khodor, B. F. Behavioral Phenotyping for Neonates. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
- El-Khodor, B. F., Edgar, N., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212 (1), http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ 29-43 (2008).
- Venerosi, A., Ricceri, L., Scattoni, M. L., Calamandrei, G. Prenatal chlorpyrifos exposure alters motor behavior and ultrasonic vocalization in CD-1 mouse pups. Environ Health. 8 (12), (2009).
- Hill, J. M., Lim, M. A., Stone, M. M. Developmental milestones in the newborn mouse. Neuromethods 39: Neuropeptide Techniques. , Humana Press. New Jersey. (2008).
- Visual dependence influences postural responses to continuous visual perturbation in adults with spastic cerebral palsy. Yu, Y., Keshner, A. E., Tucker, C. A., Thompson, E. D., Lauer, R. T. Combined Sections Meeting of American Physical Therapy Association, Anaheim, CA, USA, , (2016).
- Carlson, G. The use of four limb hanging tests to monitor muscle strength and condition over time. Experimental Protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.005.pdf (2011).
- Gordon, A. M., Duff, S. V. Relation between clinical measures and fine manipulative control in children with hemiplegic cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 41 (9), 586-591 (1999).
- Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int J Pediat. , (2012).
