Introduction
En omfattende forståelse av signalveier krever detaljert kunnskap om den ligand-reseptor-interaksjon. De fleste metoder for å vurdere interaksjonen av en spesiell ligand med dets spesifikke reseptor er kostbare, tidkrevende, arbeidskrevende og krever spesielt utstyr og ekspertise en.
Denne artikkelen beskriver to raske og pålitelige punkt-for-punkt-protokoller for å undersøke den ligand-reseptor-interaksjon basert på en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA): den direkte ligand-reseptor-interaksjon assay (LRA) og konkurransen LRA. ELISA er en svært følsom, spesifikk og lett tilgjengelig teknikk, som rutinemessig brukes i nesten alle laboratorier. ELISA kan utføres og tilpasses i ulike moter. De presenterte protokoller er optimalisert for etterforskningen av samspillet mellom ulike lambda interferoner (INFLs) og deres reseptor.
Den direkte LRA gjør det mulig for en quantificatipå av ligand-reseptor-binding i forhold til ligandkonsentrasjonen og således gir en bindingskurve. Ved hjelp av en egnet modell for den ligand-reseptor-interaksjon, kan dataene bli ytterligere analysert for å beregne dissosiasjonskonstanten (KD).
I den fremlagte protokoll, blir det ofte brukt Hill ligning anvendes for å modellere den ligand-reseptor-binding. Selv om andre metoder som for eksempel overflate-plasmonresonans teknologi 2,3 tillate bestemmelsen av bindingsaffinitetene mellom to proteinene, er denne teknologien ofte arbeidskrevende, kostbare og krever spesiallaboratorieutstyr.
Konkurransen LRA muliggjør screening av inhibitoriske peptider: den ligand-reseptor-binding ble kvantifisert med hensyn til peptid-konsentrasjon. Dette gir en dose-responskurve som beskriver den hemmende effekten av peptidet. Dataene kan bli ytterligere analysert for å estimere halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC 50
Begge ELISA protokoller er enkle å bruke og kan tilpasses et bredt spekter av problemstillinger. Rekombinante proteiner av noe slag kan anvendes for å sikkert og raskt bestemme interaksjons delene. I tillegg kan konkurransen LRA brukes til å bestemme kritiske interaksjons områder av ligander og reseptorer ved hjelp av blokkerende peptider, som er utformet for å etterligne enten liganden eller reseptoren. Dersom blokkerende peptidet viser effektiv og spesifikk hemming, opptar peptidet et kritisk område interaksjon av liganden (dersom peptid-etterligner reseptor) eller av liganden (dersom peptid-etterligner ligand).
Den første protokollen beskriver K-D-verdien bestemmelse av forskjellige INFLs og alfa-underenhet av sin reseptor, dvs. det interleukin-28-reseptor (IL28RA) ved hjelp av direkte LRA. Deretter viser den andre protokollen hvordan å bestemme evnen til en 20 aminosyre lange peptidethemme infl-IL28RA interaksjoner. Peptidet er utformet for å konkurrere med IFNLs ved deres reseptor-bindingssete, og muliggjør således en molekylær forståelse av interaksjonen. Videre kan dette peptid bli brukt til å blokkere IL28RA i in vitro forsøk for å bestemme virkningen på nedstrøms signaliseringseffekter 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagensforberedelse
- For å fremstille belegg karbonat-buffer, oppløses 0,36 g Na 2 CO 3 og 0,84 g NaHCO3 i 100 ml destillert vann; sterilt filter bufferen ved hjelp av en vakuumdrevet 0,22 mikrometer polyetersulfon (PES) membranfilter og oppbevares ved romtemperatur før bruk.
- Fremstille vaskeløsning ved tilsetning av 0,05% volum / volum Tween 20 i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Forbered en 5% bovint serumalbumin (BSA) (blokkering løsning) i PBS-løsning ved å oppløse 5 g BSA (≥98%) i 100 ml PBS og oppbevar ved 4 ° C.
- Rekombinant Receptor, ligander og Blokkerings Peptider
- Reconstitutethe rekombinant human interleukin-reseptor alfa subenheten (IL28RA) og rekombinante His-merkede ligander av human IFN (IFNL1-3) i henhold til produsentens instruksjoner og oppbevar ved -80 ° C. Syntetisere blokkerende peptider og anvendes som tidligere beskrevet fire. Bruke PBS for å fremstille forskjellige konsentrasjoner av ligands og peptider for anvendelse i analyser.
- For å fremstille det primære antistoff, fortynnes 6x His mus monoklonalt antistoff i PBS med 0,1% BSA ved 1: 1000 fortynning. For å fremstille det sekundære antistoff, fortynnet pepperrot peroksidase (HRP) konjugert geite-anti-mus IgG (H + L) i PBS med 0,1% BSA ved 1: 10000 fortynning.
- Forbered TMB løsning ved å blande reagenser A og B i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forbered stopp løsning ved å tilsette 5 N svovelsyre (H 2 SO 4) i destillert vann og oppbevar ved romtemperatur.
2. Enzym-bundet immunosorbentbestemmelser (ELISA)
MERK: direkte ligand-reseptor-interaksjon ELISA (direkte LRA, figur 1) kan brukes til å måle reseptor-ligand-dissosiasjonskonstanten (KD), som et mål på reseptor-ligand-bindende affinitet. Konkurransen ligand-reseptor-interaksjon ELISA (konkurranse LRA, figur 2) allestrømmer screening av peptider (og andre blokkerende forbindelser), som fungerer til å interferere med interaksjonen mellom liganden og reseptoren. Den grunnleggende protokollen som tidligere ble publisert fem ble ytterligere optimalisert.
NB: I både ELISA metoder for å bruke multikanal pipette for å tilsette løsninger til brønnene i 96-brønns plate i hvert trinn. I oppløsning eller dekanter vasketrinn, kaste ut oppløsningene direkte inn i vasken.
- Direkte ligand-reseptor-Interaksjon analysen (direkte LRA)
MERK: For en illustrasjon av arbeidsflyten (se figur 1).- Coating Plate med rekombinant Receptor
- Fortynn den rekombinante reseptor i karbonat buffer til en endelig konsentrasjon på 100 ng / ul. Belegge brønnene i 96-brønns mikrotiterplate med fast reseptor-konsentrasjon (100 ng / mL) ved pipettering av 100 ul i hver brønn med en multikanal pipette. Ekskluder yttervegger av platen for å unngå godt kant gjenstand. Dekke platen med et lokk og inkuberplate ved 4 ° CO / N.
- Blokkering og Tilsetting av ligander
- Den neste dag, fjerner beleggløsningen ved å vippe platen mot vask og platen vaskes 3 ganger med vaskeoppløsning (PBS + 0,05% volum / volum Tween 20).
- Blokkere de frie reseptor-bindingsseter i den belagte plate ved hjelp av 200 pl 5% BSA-oppløsning til hver brønn med en multikanal pipette og inkuberes platen i 2 timer ved RT.
- Kast den blokkerende løsning (se trinn 2.1.2.1.), Og platen vaskes 3 ganger med vaskeløsning.
- Fremstille den rekombinante His-merkede ligander ved forskjellige konsentrasjoner (f.eks, 8 ug / ml, 4 ug / ml, 2 ug / ml, 1 ug / ml, 0,5 ug / ml, 0,25 ng / ml, 0,125 ug / ml, 0,063 ug / mL, 0,031 ug / mL, 0,0 ug / ml) i PBS. Legg bare PBS i tomme brønner.
- Tilsett 100 ul av hver ligand-konsentrasjonen til brønnene i duplikat og inkuber platen i 2 timer ved RT slik at reseptor-ligand-interaksjon.
- Inkubasjon med Antistoffer
- Etter inkubering med ligandene, platen vaskes 3 ganger med vaskeløsning.
- Pipetter 100 ul av primær anti-His mus monoklonalt antistoffoppløsning (1: 1000) til hver brønn.
- Inkuber platen ved RT i 2 timer; etter inkubering forkaste antistoffoppløsning (se trinn 2.1.2.1.), og platen vaskes 3 ganger med vaskeløsning.
- Tilsett 100 ul av HRP koplet geite-anti-mus IgG sekundært antistoff-løsning (1: 10,000) til hver brønn. Platen inkuberes i 45 minutter ved RT.
- Kast antistoffoppløsning (se trinn 2.1.2.1.), Og platen vaskes 3 ganger med vaskeløsning.
- Tilsetning av substrat og utvikling
- Bringe TMB substrat-løsninger til romtemperatur og fremstille TMB-substratoppløsning A og B på 1: 1-forhold. Tilsett 100 nylagde substrat til hver brønn, og holde platen ved romtemperatur i 15-30 min. Etter tilstrekkelig col eller utvikling tilsett 50 mL stopp løsning.
- Lese Plate og dataanalyse
MERK: Den beskrevne protokollen er basert på antagelsen om at det målte signalet stiger fra spesifikk binding. Det kan være nødvendig å estimere bidraget av uspesifikk binding til signalet, men dette er utenfor omfanget av denne protokollen.- Les absorbans (optisk densitet, OD) direkte ved 450 nm.
- Trekk fra bakgrunnssignalet fra de målte OD-verdiene og normalisere dem. Transformere alle verdier av ligandkonsentrasjonen i logaritmisk skala (grunntall 10, log 10).
- Plotte normalisert og bakgrunns korrigert OD-verdier (Y-akse, svarer til den fraksjon av okkuperte reseptor-bindingsseter) mot logaritmen til ligandkonsentrasjonen (X-aksen, log 10 skala).
- For å estimere K-D-verdien, tilpasse dataene til følgende form av Hill-ligningen:
tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
MERK: Her Y betegner brøkdel av okkuperte reseptor bindingssteder og Y maks maksimal binding; [L] betegner konsentrasjonen av fri ligand og Hill koeffisient. Hvis det bare er ett bindingssete for liganden, er Hill koeffisient n = 1. For systemer med mer enn en ligand binding, kan de bindende utstillinger positive cooperativity hvis n> 1, negative cooperativity dersom n <1 og ingen cooperativity dersom n = 1. den mikroskopiske dissosiasjonskonstant er betegnet og svarer til halvparten av maksimal effektiv konsentrasjon EC 50 6. Den tilsynelatende dissosiasjonskonstant er K d = (K D) n. I det enkleste tilfellet hvor n = 1, dissosiasjonskonstanten tilsvarer den ligand-konsentrasjonen ved hvilken halvparten av reseptor-bindingsseter er okkupert og K d = K D. Denne modellen forutsetter masseaksjon forpliktende likevektsbetingelser, samt at bare en liten brøkdel avdet tilsatte ligand er bundet til reseptoren, det vil si, [L] >> [RL].
- Coating Plate med rekombinant Receptor
Figur 1. Direkte ligand-reseptor-interaksjon analysen (direkte LRA). Trinn-for-trinn-protokollen for direkte LRA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Konkurransen ligand-reseptor-Interaksjon analysen (konkurranse LRA)
MERK:. For en illustrasjon av arbeidsflyten se Figur 2 Konkurransen LRA prosedyren følger de samme trinnene som direkte LRA (belegg på plate, antistoffet inkubasjon, plate utvikling) med unntak for viktige endringer i ligand og peptider tillegg trinn. Riktig negative kontroller er avgjørende for denne analysen. I en tidligere screeningundersøkelse <sup> 4, egge blokkerer peptid viste ikke antagonistiske effekter.- Blokkering - Tilsetting av ligander og Blokkerings Peptider
- Neste dag, fjerne belegget løsningen og vask platen (se 2.1.2.1).
- Blokkere den belagte plate ved å tilsette 200 ul av 5% BSA-oppløsning til hver brønn og inkuber platen i 2 timer ved RT.
- Forbered rekombinante His-merkede ligander (IFNL1-3) ved en fast konsentrasjon (2x-20 ng / ml) i PBS.
- Fremstille den blokkerende peptid (se tabell 3) med ulike konsentrasjoner varierende fra 10 nM til 100 uM i PBS for å garantere en dose-responskurve.
MERK: Dette gjør det mulig for påfølgende bestemmelse av IC50-verdien for blokkering av peptidet. I kontrollbrønner, tilsett bare fast ligandkonsentrasjonen uten peptid for å utlede maksimal (100%) binding. I det tomme, bare legge PBS uten ligand eller peptid. - Tilsett 50 ul av ligandene (IFNL1-3) og 50 ul av hver peptide konsentrasjon til brønnene i duplikater.
- Inkuber platen i 2 timer ved RT.
- Lese Plate og dataanalyse
MERK: Den beskrevne protokollen er basert på antagelsen om at det målte signalet stiger fra spesifikk binding. Det kan være nødvendig å estimere bidraget av uspesifikk binding til signalet, men dette er utenfor omfanget av denne protokollen.- Les absorbans (optisk densitet, OD) direkte ved 450 nm.
- Trekk fra bakgrunnssignalet fra de målte OD-verdiene og normalisere dem. Transformere alle verdier av peptidet konsentrasjon til logaritmisk skala (grunntall 10, log 10).
- Plotte normalisert og bakgrunns korrigert OD-verdier (Y-akse, svarer til den fraksjon av okkuperte reseptor-bindingsseter) mot logaritmen til ligandkonsentrasjonen (X-aksen, log 10 skala).
- For å beregne IC50-verdien, passer dataene til den følgende ligning:
MERK: Her [P] er peptid konsentrasjon og Hill skråningen. The Hill helling beskriver steilheten av den dose-responskurve. IC50 svarer til inhibitorkonsentrasjonen ved hvilken 50% inhibering av binding mellom ligand og reseptor er observert.
- Blokkering - Tilsetting av ligander og Blokkerings Peptider
Figur 2. Konkurransen ligand-reseptor-interaksjon analysen (konkurranse LRA). Trinn-for-trinn-protokollen for konkurranse LRA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissosiasjonskonstantene mellom INFL1-3 og deres reseptor alfa subenheten IL28RA ble bestemt ved hjelp av direkte LRA. Resultatene er vist i Figur 3: Den fraksjon av okkuperte bindingssteder er plottet mot logaritmen av den respektive IFN konsentrasjon. Den Scatchard plot av dataene er vist i høyre hjørne. Resultatene viser at den direkte LRA gir en bindingskurve, som kan bli ytterligere analysert for å estimere K-D-verdien. K-D-verdien ble bestemt ved å tilpasse dataene til Hill-ligningen (ligning 1).
IFNL1 har den høyeste bindende affinitet, etterfulgt av IFNL2 og IFNL3. The Hill koeffisient n> 1 antyder økt affinitet for flere ligander etter den første ligand-reseptor interaksjon (se diskusjon). De estimerte dissosiasjonskonstanter og Hill-koeffisienter er angitt i tabell 1.
Konkurranse LRA ble anvendt for å kvantifisere virkningen av en blokkerende peptid på interaksjonen mellom IFNL1-3 og IL28RA (figur 4). Den fraksjon av okkuperte bindingssteder for en ligand-konsentrasjon på 10 ng / ml er plottet mot logaritmen av peptidet konsentrasjon. For å estimere de IC50-verdier, blir dataene tilpasset til ligning 2.
Den blokkerer peptid hemmet samspillet mellom IFNL3 og IL28RA (IC 50 = 0,26 mm) i størst grad. IC 50 er to ganger så høy for IFNL2-IL28RA interaksjon (IC50 = 0,50 uM) og en størrelsesorden høyere for den IFNL1-IL28RA interaksjon, som indikerer at peptidet var mindre effektive ved å forstyrre IFNL1-IL28RA interaksjoner. De fast IC 50 verdier og Hill bakkene er oppsummert i tabell 2.
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Riktig dataanalyse er viktig for å forstå den ligand-reseptor interaksjon De viste resultater ble generert ved hjelp av en vitenskapelig graf programvare som GraphPad PRISM For K D verdi besluttsomhet.. , dataene ble tilpasset til 'ett område - spesifikk binding med Hill helling.' (. svarer til ligning 1, Sec 2.2.1) for IC50 verdien bestemmelse, blir dataene montert på funksjonen 'log (inhibitor) vs. . normalisert respons -. variabel skråningen '(. se ligning 2 i kapittel 2.2.2) Men noen programvare for ikke-lineær regresjonsanalyse kan brukes.
Figur 3. Resultater av den direkte ligand-receptor-assaybestemmelse (direkte LRA). Bindende kurver for binding av IFNL1 (grønn), IFNL2 (rød) og IFNL3 (blå) til IL28RA. Den respektive Scatchard tomt i høyrehjørne antyder positive co-operativity av bindingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Resultatene av konkurrerende ligand-receptor-assaybestemmelse (kompetitiv LRA). Doseresponskurver som viser inhibering av bindingen av IFNL1 (10 ng / ml, grønn), IFNL2 (10 ng / ml, rød) og IFNL3 (10 ng / ml, blå) til IL28RA ved 20 aa peptid. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Beregnet dissosiasjon konstanter (K D) Og Hill koeffisientene IFNL1-3 binding til IL28RA. Standardfeilen (SE) er gitt for en utvalgsstørrelse på fire replikater per datapunkt.
Tabell 2:. Beregnet halv maksimal hemmende konsentrasjoner (IC-50) av de blokkerende peptider og den Hill helningen av dose-responskurve for binding av IFNL1-3 til IL28RA IFN-konsentrasjonen er 10 ng / ml. Antall replikater er tre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ELISA er en standard og veletablert metode i mange laboratorier. Vi har ytterligere modifisert og forbedret en tidligere publisert metode 5,7. Den viste trinn-for-trinn-protokollen viser hvordan den kan brukes på en enkel måte å bestemme K-D-verdiene av ligand-reseptorinteraksjoner. I tillegg kan IC50 av en blokkerende peptid som griper inn i ligand-reseptor-interaksjon bestemmes.
Store fordeler er den raske oppsett, enkel tilberedning av reagenser og kjent håndtering, som de fleste forskere har brukt en ELISA-protokoll før. Den direkte LRA-protokollen er meget fleksibel og kan tilpasses til å måle mange protein-protein-interaksjoner. Rekombinante proteiner med His6- eller alternativt merkelappen skal brukes som bindingspartneren til en immobilisert partner. Konkurransen LRA kan utnyttes som et screening-verktøy for å (i) bestemme den inhiberende potensialet til å blokkere forbindelser (peptider, antistoffer, eller små molecules) og (ii) bestemme de kritiske interaksjons områder ved hjelp av blokkerende peptider som er utformet for å etterligne reseptoren eller liganden.
Negative kontroller er viktig for en riktig tolkning av de presenterte analyser. I en tidligere screeningundersøkelse 4, gjorde kryptert sekvens av den brukte blokkering peptid ikke vise antagonistiske effekter. Men andre peptider viste en blokkering kapasitet også etter scrambling, sannsynligvis på grunn av uspesifikke elektrostatiske interaksjoner.
En potensiell begrensning er at denne analysen gjenspeiler en in vitro-situasjon. Spesielt heterodimere reseptorer ofte danne en mer kompleks struktur. Det er ikke mulig å skille mellom hvorvidt liganden bare binder til reseptoren eller om liganden aktiverer også reseptoren ved å utløse en konformasjonsendring eller en dimerisering, som i sin tur fører til et intracellulært signal. I det presenterte analyse, benyttet vi et rekombinant reseptor, som er Immobilized til en fast fase. Dette oppsettet virker ikke til å teste aktivering eller for å undersøke interaksjonen av reseptorene, som krever membranen miljø eller membrankolesterol, slik som G-protein koblede reseptorer (GPCR). Også anvendelse av rekombinante protein øker begrensninger. For eksempel kan den sammenleggbare og tertiære struktur av et rekombinant protein være forskjellig sammenlignet med en in vivo-situasjon. Binding av ligand og reseptor skjer vanligvis ved romtemperatur, men i mennesker den optimale temperatur vil være 37 ° C. Endelig kan bruken av kommersielle rekombinant ligand og reseptor vise seg å være kostbart. Til tross for disse begrensninger, er disse to ELISA-protokollene viser potensiale for raskt å utforske den ligand-reseptor-interaksjon.
De presenterte resultatene viser at IFNL1 har en litt høyere affinitet for IL28RA forhold til IFNL2, og affinitet IFNL3 er tre ganger lavere enn IFNL2. Dette er bemerkelsesverdig med tanke på likheten mellom IFNLs. IFNL1 og IFNL2 differ i 33 aminosyrer mens IFNL2 og IFNL3 skiller seg bare i syv aminosyrer 8. Samspillet mellom IL28RA og IFNLs innebærer Helix A og AB-løkke av IFNL 9. Justering av IFNL sekvenser avslører fire signifikante forskjeller i Helix A og AB-loop mellom IFNL1 og IFNL3 (figur 5A). En påvirker saltbroen Arg54-Glu119. Aminosyreresidiene i denne delen er nummerert i henhold til Uniprot oppføringer Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) og Q8IU57 (IL28RA), som har blitt funnet i krystallstrukturen av IFNL1-IL28R1 kompleks (Figur 5B). Strukturell oppstilling viser at Arg57 i IFNL1 er erstattet av Lys57 i INFL3, som også er i stand til å danne en saltbro med Glu118 (figur 5C). I samsvar med redusert affinitet IFNL3 og IL28RA, beregnings 10,11 og mutasjons 12 analyser viser at Lys-Glu salt broer er generelt mindre stabile enn Arg-Glu salt broer.
Imidlertid ikke forskjellene i Heliks A ikke tilfredsstillende måte å forklare den lavere affinitet av IFNL3, ettersom aminosyresekvensen av Heliks A er identisk for IFNL2 og IFNL3. Det er antatt at den største forskjellen oppstår fra mutasjoner i AB-loop, der Arg74 og His76 i IFNL2 erstattes av Lys70 og Arg72 i IFNL3 8.
Videre kan forskjeller i stabilitet og oppløselighet mellom IFNLs også påvirke resultatet av analysen. Siden den direkte LRA-analysen benytter konsentrasjoner fra nM til M, og den fysiologiske konsentrasjon av cytokiner i serum ligger i pM til nM område, kan aggregering av IFNL ikke utelukkes. Vi kan anta at den observerte positive cooperativity av IFN-bindingen er forårsaket av en spesifikk eller ikke-spesifikk økning av ligand-reseptor-binding, for eksempel, en dimerisering av det rekombinante IL28RA reseptoren i oppløsning, eller en binding av en andre ligand eller ligand-fragment med høyere affinitet. HoWever, er videre studier er nødvendig for å bekrefte dette.
Den blokkerer peptid som brukes i konkurranse LRA ligner AB-løkken IFNL3 (figur 6). Som tidligere beskrevet, spiller AB-sløyfen en viktig rolle i samspillet mellom IFNLs og IL28RA 9, særlig IFNL2 og IFNL3. Homologi-modellering av IFNL3 med IL28RA / IFNL1 krystallstruktur viser at regionen, som tilsvarer den blokkerende peptidet med nær romlig nærhet til interaksjonen grensesnitt med IL28RA (figur 6). Antok at peptid blokker samspillet av AB-løkke av IFNL og IL28RA. Resultatene av konkurransen LRA støtte denne: Peptidet har en hemmende virkning på bindingen av alle IFNLs, men peptidet er en mer effektiv inhibitor av interaksjonen mellom IL28RA og enten IFNL3 eller IFNL2 enn av samspillet mellom IFNL1 og IL28A. Som forventet, peptid blokkerer bindingen av IFNL3 mest effektivt siden detopptar akkurat det samme binding lomme som AB-løkke av IFNL3.
Som vist i tabell 3, AB-sløyfer av IFNL1 og IFNL2 justert til de blokkerer peptid forskjellig. I samsvar med den lavere IC50-verdien av peptidet for inhibering av IFNL1 / IL28RA interaksjon, tolv aminosyrer varierer mellom IFNL1 og peptidet, mens og bare to aminosyrer som er forskjellige IFNL2 og peptidet. Dette indikerer at det er litt forskjellige bindings moduser for samhandling mellom AB-buene av IFNLs og IL28RA og spår at peptider som etterligner IFNL1 ville være mer effektiv til å blokkere interaksjonen mellom IFNl1 og IL28RA enn samspillet mellom IFNL3 og IL28RA.
Videre er peptidet generelle positivt ladet (fire arginin og to lysinrester, men bare to aspartat-rester) og beregnings analyse viser at peptidet har ingen definerte sekundære motiver. På grunn av sin oppkveilede, fleksibel structure peptidet kan også binde seg til andre områder av reseptoren. Dette kan potensielt blokkere glutamat og aspartat rester slik som D118, som danner et salt bro for å stabilisere den ligand-reseptor-kompleks (figur 5B og 5C).
Figur 5. Structural sammenligning av IFNL1 (grønn) og IFNL3 (blå). Oksygen atomer er vist i rødt, er nitrogenatomer vist i blått. (A) overlagring av IL28RA-bundet IFNL1 og IFNL3 (IL28RA ikke vist). Den kvadratisk middelavvik (RMSD) av alle stilte atomer er 0,672 Å. Sidekjeder av IFNL3 som avviker fra IFNL1 er uthevet i lys rosa. (B) Salt bro mellom Arg54 og D118. (C) IFNL3 justert til IL28RA-bundet IFNL1 (IL28RA er vist i grått). Justeringen viser at Arg-Glu salt bridge blir trolig erstattet av en mindre stabil Lys-Glu, en salt-bro mellom Lys57 og D118. PyMol ble brukt til utarbeidelse av tall og for justering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Justering av IFNL3 og IFNL1-IL28RA kompleks (IFNL1 ikke vist). IFNL3 er vist i blått og IL28RA i grått. Regionene tilsvarer de blokkerer peptid er uthevet i lilla. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 3:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
