Introduction
シグナル伝達経路の包括的な理解は、リガンド - 受容体相互作用についての詳細な知識が必要です。その特定の受容体と特定のリガンドとの相互作用を評価するためのほとんどの方法は、高価な、時間がかかり、労働集約的であり、特定の機器と専門知識1を必要とします 。
直接リガンド - 受容体相互作用アッセイ(LRA)と競争LRA:この記事では、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)に基づいて、リガンド - 受容体相互作用を調査するために、2つの高速かつ信頼性の高いポイントバイポイントプロトコルについて説明します。 ELISAは、日常的にほとんどすべての研究室で使用される高度に敏感な特定の、容易に入手できる技術です。 ELISAを実施し、様々な様式で適合させることができます。提示プロトコルは異なるラムダインターフェロン(INFLs)とその受容体との間の相互作用の調査のために最適化されています。
直接LRAはquantificatiを可能にしますリガンド - 受容体のリガンド濃度に対して結合し、従って、結合曲線が得られます。リガンド-受容体相互作用のための適切なモデルを使用して、データは、さらに、解離定数(K D)を推定するために分析することができます。
提示されたプロトコルでは、一般的に使用されるHillの式は、リガンド - 受容体結合をモデル化するために適用されます。このような表面プラズモン共鳴技術2,3のような他の方法は、2つのタンパク質間の結合親和性の決意を可能にするが、この技術は、しばしば、労働集約的で、高価であり、特別な実験装置を必要とします。
競争LRAは、阻害ペプチドのスクリーニングを可能にします:リガンド - 受容体結合は、ペプチド濃度に対して定量化されます。これは、ペプチドの阻害効果を説明する用量応答曲線をもたらします。データはさらに、半最大阻害濃度(IC 50を推定するために分析することができますサブ>)ブロッキングペプチド。
両方のELISAプロトコルを使用するのは簡単であり、研究課題の広い範囲に適合させることができます。任意の種類の組換えタンパク質は、確実かつ迅速な相互作用部分を決定することができます。また、競争LRAは、リガンドまたは受容体のいずれかを模倣するように設計されたブロッキングペプチドを用いて、リガンドと受容体の重要な相互作用部位を決定するために用いることができます。ブロッキングペプチドが効率的かつ特異的阻害を示した場合、ペプチドは、リガンド(ペプチド模倣受容体の場合)またはリガンド(ペプチド模倣リガンドの場合)のの重要な相互作用部位を占めています。
最初のプロトコルが異なるINFLsのK D値の決意と直接LRAを使用して、それらの受容体、 すなわち、インターロイキン28受容体(IL28RA)のαサブユニットを説明します。次に、第二のプロトコルは、20アミノ酸長のペプチドの能力を決定する方法を示していますINFL-IL28RAの相互作用を阻害します。ペプチドは、それらの受容体結合部位でIFNLsと競合するように設計され、したがって、相互作用の分子的理解を可能にします。さらに、このペプチドは、下流のシグナル伝達の効果4への影響を決定するためのin vitro実験においてIL28RAをブロックするために使用することができます。
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Protocol
1.試薬の調製
- 炭酸塩コーティング緩衝液を調製するために、蒸留水100ml中のNa 2 CO 3 0.84 gでのNaHCO 3 0.36グラム溶解します。滅菌フィルター使用するまで室温で0.22μmのポリエーテルスルホン(PES)膜フィルターとストアを駆動真空を使用してバッファ。
- リン酸0.05%(v / v)のトゥイーン20を添加することにより、洗浄溶液を調製するには、緩衝生理食塩水(PBS)。
- 4°Cで100 mlのPBSとストアに5gのBSA(≥98%)を溶解させて、PBS溶液中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)(ブロッキング溶液)を準備します。
- 組み換え受容体、リガンドと遮断ペプチド
- Reconstitutethe組換えヒトインターロイキン受容体αサブユニット(IL28RA)および-80℃でのメーカーの指示や店舗に従って、ヒトIFN(IFNL1-3)の組換えHisタグ付きリガンド。 Synthetizeは、ペプチドを遮断し、以前4に記載されているように使用します。リガンドの種々の濃度を調製するためにPBSを使用してsおよびアッセイにおける使用のためのペプチド。
- 一次抗体を調製する1において、0.1%BSAを含むPBSで6×彼のマウスモノクローナル抗体を希釈する:1,000希釈。 :10,000希釈した二次抗体を調製するために、1に0.1%BSAを含むPBS中の西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウスIgG(H + L)を希釈します。
- 製造業者の指示に従って試薬A及びBを混合しTMB溶液を調製します。
- 室温で蒸留水と店舗5 N硫酸(H 2 SO 4)を添加することにより停止溶液を調製します。
2.酵素免疫測定法(ELISA)
注:ELISA(直接的LRA、 図1)は、受容体-リガンド結合親和性の測定値として、受容体-リガンドの解離定数(K D)を測定するために使用することができる直接リガンド-受容体相互作用。競争リガンド-受容体相互作用をELISA(競争LRA、 図2)すべてリガンドと受容体との間の相互作用を妨害するように作用するペプチド(および他のブロッキング化合物)、のスクリーニングOWS。以前は5公開された基本的なプロトコルをさらに最適化しました。
注:方法は、各工程において、96ウェルプレートのウェルに溶液を添加するためのマルチチャンネルピペットを使用するELISAの両方で。ソリューションのデカントまたは洗浄工程では、シンクに直接ソリューションを捨てます。
- 直接リガンド - 受容体相互作用アッセイ(直接LRA)
注:ワークフローの説明のために( 図1を参照)。- 組換え受容体を有するコーティングプレート
- 100 ngの/μlの最終濃度になるように炭酸緩衝液中の組換え受容体を希釈します。よくマルチチャンネルピペットを使用して、それぞれに100μlのピペッティングすることによって固定された受容体濃度(100 ngの/μl)を96ウェルマイクロタイタープレートのコートウェル。よくエッジアーチファクトを回避するために、プレートの外側の壁を除外します。蓋付きのプレートをカバーし、インキュベート4°CO / Nでプレート。
- ブロッキングとリガンドの追加
- 翌日、シンクに対してプレートを傾けることによってコーティング溶液を除去し、洗浄溶液(PBS + 0.05%(v / v)のツイーン20)でプレートを3回洗浄します。
- よくマルチチャンネルピペットを使用して、それぞれに5%BSA溶液200μlを使用してコーティングされたプレート中の遊離受容体結合部位をブロックし、室温で2時間静置します。
- ブロッキング溶液を捨て(ステップ2.1.2.1を参照してください。)及び洗浄液でプレートを3回洗浄します。
- 異なる濃度( 例えば、8 / mlの、4 / mlの、2 / mlの、1 / mlの、0.5μgの/ mlの、0.25μgの/ mlで、0.125μgの/ mlで、0.063μgので組換えHisタグリガンドを準備/ PBS mlの、0.031 / mlの、0.0 / mlの)。ブランクウェルにPBSのみを追加します。
- 二連のウェルに各リガンド濃度の100μlを添加して、受容体 - リガンドを可能に室温で2時間プレートをインキュベートインタラクション。
- 抗体とのインキュベーション
- リガンドとのインキュベーション後、洗浄溶液でプレートを3回洗浄します。
- ピペット一次抗Hisマウスモノクローナル抗体溶液(1:1,000)を100μl各ウェルに。
- 室温で2時間プレートをインキュベートします。インキュベーション後、(ステップ2.1.2.1を参照)。抗体溶液を捨て、洗浄溶液でプレートを3回洗浄します。
- HRPの100μlのを追加したヤギ抗マウスIgG二次抗体溶液(1:10,000)連結された各ウェルに。 RTで45分間プレートをインキュベートします。
- 抗体溶液を捨てる(ステップ2.1.2.1を参照してください。)及び洗浄液でプレートを3回洗浄します。
- 基板開発の追加
- RTにTMB基質溶液を持参し、1でTMB基質溶液AとBを準備:1の比率。各ウェルに100μlのを新しく調製した基質を加え、15〜30分間、室温でプレートを保持します。十分COL後または開発は、50μlの停止溶液を追加します。
- プレートおよびデータ分析を読みます
注:記載されたプロトコルは、測定された信号は、特異的な結合から上昇するという仮定に基づいています。信号に非特異的結合の寄与を推定する必要があるかもしれませんが、これは、このプロトコルの範囲外です。- 直接450nmでの吸光度(光学密度、OD)を読みます。
- 測定されたOD値からバックグラウンド信号を減算し、それらを正規化します。対数目盛(ベース10、10をログに記録)にリガンド濃度のすべての値を変換します。
- (X軸、10 logスケール)リガンド濃度の対数に対して正規化し、バックグラウンドOD値(Y軸は、占有受容体結合部位の割合に相当する)を補正プロット。
- K D値を推定するために、Hillの式の次の形式にデータをフィット:
tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
注:ここでYは、占有受容体結合部位およびY maxの最大結合の割合を示し、 [L]は遊離リガンドとヒル係数の濃度を意味します。リガンドのための唯一の結合部位が存在する場合は、ヒル係数nは、複数のリガンド結合部位を備えたシステムの場合= 1、結合展示正の協同である場合はN> 1、負の協同場合はN <1かつnがない場合は、協同= 1微視的解離定数と呼ばれ、最大半減有効濃度EC 50 6に相当します。見かけの解離定数K D =(K D)nです。最も簡単な場合はn = 1で、受容体結合部位の半分が占有及びK D = K Dされるときのリガンド濃度の解離定数に相当します。このモデルは平衡条件下で結合質量作用を想定し、同様のごく一部こと追加されたリガンドは、受容体に結合している、すなわち、[L] >> [RL]。
- 組換え受容体を有するコーティングプレート
図1. 直接リガンド-受容体相互作用アッセイ(直接LRA)。直接LRAのためのステップバイステップのプロトコル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 競争リガンド - 受容体相互作用アッセイ(競争LRA)
注:ワークフローの図については、 図2を参照してください競争LRA手順は、リガンドにおける重要な変更点を除いて直接LRA(プレートをコーティングし、抗体インキュベーション、プレートの開発)と同じ手順に従っており、追加のステップをペプチド。適切なネガティブコントロールは、このアッセイのために不可欠です。前のスクリーニング研究では<SUP> 4、スクランブルブロッキングペプチドは拮抗作用を示しませんでした。- ブロッキング - リガンドと遮断ペプチドの追加を
- 翌日、コーティング溶液を除去し、(2.1.2.1を参照)、プレートを洗浄します。
- 各ウェルに、5%BSA溶液200μlを加えることによって、コーティングされたプレートをブロックし、室温で2時間、プレートをインキュベートします。
- PBS中の固定濃度(2X-20 ngの/ mlの)で組換えHisタグ付きリガンド(IFNL1-3)を準備します。
- 用量反応曲線を保証するために10 nMでから、PBS中100μMの範囲の異なる濃度のブロッキングペプチド( 表3参照)を準備します。
注:これは、ブロッキングペプチドのIC 50値のその後の決意を可能にします。対照ウェルでは、最大(100%)の結合を誘導するためにペプチドなしのみ固定リガンド濃度を追加します。ブランクでは、リガンドまたはペプチドなしでPBSのみを追加します。 - リガンド(IFNL1-3)50μlの各PEの50μLを追加重複のウェルにptide濃度。
- RTで2時間静置します。
- プレートおよびデータ分析を読みます
注:記載されたプロトコルは、測定された信号は、特異的な結合から上昇するという仮定に基づいています。信号に非特異的結合の寄与を推定する必要があるかもしれませんが、これは、このプロトコルの範囲外です。- 直接450nmでの吸光度(光学密度、OD)を読みます。
- 測定されたOD値からバックグラウンド信号を減算し、それらを正規化します。対数目盛(ベース10、10をログに記録)にペプチド濃度のすべての値を変換します。
- (X軸、10 logスケール)リガンド濃度の対数に対して正規化し、バックグラウンドOD値(Y軸は、占有受容体結合部位の割合に相当する)を補正プロット。
- IC 50値を推定するために、以下の式にデータをフィットします。
注:ここでは[P]ペプチド濃度及びヒル勾配です。ヒルスロープは、用量反応曲線の勾配を記述する。 IC 50は、リガンドと受容体との結合の50%阻害が観察された阻害剤濃度に相当します。
- ブロッキング - リガンドと遮断ペプチドの追加を
図2.競争リガンド-受容体相互作用アッセイ(競争LRA)。競技LRAのためのステップバイステップのプロトコル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Representative Results
INFL1-3とその受容体αサブユニットIL28RA間の解離定数は、直接LRAを用いて決定しました。結果を図3に示されている:占有結合部位の割合は、各IFN濃度の対数に対してプロットしました。データのスキャッチャードプロットは、右下隅に表示されます。結果は、直接LRAは、さらにK D値を推定するために分析することができる結合曲線を生じることを示しています。 K D値は、Hillの式(式1)にデータを当てはめることによって決定しました。
IFNL1はIFNL2とIFNL3続い最も高い結合親和性を持っています。ヒル係数n> 1は、初期のリガンド - 受容体相互作用(説明を参照)した後、追加のリガンドに対する親和性を増加させたことを示唆しています。推定された解離定数及びヒル係数は、表にまとめられています 1。
競争LRAはIFNL1-3とIL28RA( 図4)との間の相互作用に対するブロッキングペプチドの影響を定量するために使用されました。 10ng / mlのリガンド濃度占有結合部位のフラクションは、ペプチド濃度の対数に対してプロットしました。 IC 50値を推定するために、データは2式に適合されています。
ブロッキングペプチドが最大限にIFNL3とIL28RA(IC 50 = 0.26μM)との間の相互作用を阻害しました。 IC 50は IFNL2-IL28RAの相互作用(IC 50 = 0.50μM)のための二倍の高さであるとIFNL1-IL28RAの相互作用のための一桁高く、示すペプチドはIFNL1-IL28RAの相互作用を破壊することで効果が低かったです。決定されたIC 50値およびヒル勾配を表2にまとめます。
_content "FO:キープtogether.within-ページ=" 1 ">適切なデータ分析は、リガンド-受容体相互作用を理解するために必須で示された結果は、グラフパッドプリズムなどの科学的なグラフ作成ソフトウェアを使用して生成されたK D値決意について。 、データが「1人のサイト-特定ヒルスロープとの結合が'に装着した。(。節で式1に相当2.2.1)のIC 50値の決意については、データが対関数'ログ(阻害剤)に取り付けられています。正規化された応答 - (秒で、式2を参照2.2.2)可変スロープ 'しかしながら、非線形回帰分析のための任意のソフトウェアを使用することができます。
直接リガンド-受容体アッセイ(ダイレクトLRA)の図3の結果。IL28RAへIFNL1(緑)、IFNL2(赤)とIFNL3(青)の結合のための結合曲線。右下のそれぞれのスキャッチャードプロットコーナーは、結合の正の同時操作性を示唆している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図競合的リガンド-受容体アッセイ(競合LRA)。4.結果 IFNL1(10ng / mLの、緑)、(10 ng / mlで、赤)IFNL2とIFNL3の結合の阻害を示す用量反応曲線(10 NG 20 AAペプチドによってIL28RA / mlで、青)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1: 推定解離定数(K DIL28RAへの結合IFNL1-3の)およびヒル係数は標準誤差(SE)は、データポイント当たり4反復のサンプルサイズのために与えられています。
表2: ブロッキングペプチド及びIL28RAにIFNL1-3の結合の用量応答曲線のヒル勾配の 推定最大半量阻害濃度(IC 50)は、IFNの濃度は、10 ng / mlです。反復の数は3です。
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Discussion
ELISAは多くの研究室のための標準的かつ十分に確立された方法です。我々はさらに修正され、以前に発表された方法5,7を改善しています。実証ステップバイステップのプロトコルは、リガンド-受容体相互作用のK D値を決定するための簡単な方法で使用することができる方法を示しています。また、リガンド - 受容体相互作用を妨害するブロッキングペプチドのIC50を決定することができます。
ほとんどの研究者が前にELISAプロトコルを使用していたとして主な利点は、迅速なセットアップ、試薬およびおなじみの取り扱いの容易な準備です。直接LRAプロトコルは非常に柔軟であり、多くのタンパク質 - タンパク質相互作用を測定するように適合させることができます。 His6-または代替タグを持つ組換えタンパク質が固定化されたパートナーへの結合パートナーとして使用されるべきです。 LRAは、(i)のスクリーニングツールとして活用することができる競争が阻止化合物(ペプチド、抗体、または小モルの阻害能力を決定しますecules)および(ii)受容体またはリガンドを模倣するように設計されたブロッキングペプチドを用いて、重要な相互作用部位を決定します。
陰性対照は、提示されたアッセイの適切な解釈のために不可欠です。前のスクリーニング研究4では、使用ブロックペプチドのスクランブル配列は拮抗作用を示しませんでした。しかしながら、他のペプチド起因非特異的静電相互作用のために、また、スクランブル後の可能性が高いブロッキング能力を示しました。
潜在的な制限は、このアッセイは、in vitroでの状況を反映していることです。具体的には、ヘテロ二量体受容体は、多くの場合、より複雑な構造を形成します。リガンドがちょうど受容体またはリガンドはまた、コンホメーション変化または順番に細胞内シグナルをもたらす二量体化を、トリガすることによって受容体を活性化するかどうかを結合するか否かを区別することはできません。提示アッセイでは、我々はimmobiliである組換え受容体を、使用しました固相にZED。このセットアップでは、アクティベーションをテストしたり、そのようなGタンパク質共役受容体(GPCR)のような膜環境や膜コレステロールを必要とする受容体の相互作用を調査するために動作しません。また、組換えタンパク質の使用は警告を発生させます。例えば、組換えタンパク質の折りたたみおよび三次構造は、インビボの状況と比較して異なっていてもよいです。リガンドと受容体の結合は、通常、しかし、ヒトにおいて最適な温度は37℃になり、室温で起こります。最後に、商業組換えリガンドと受容体の使用は、高価な証明することができます。これらの制限にもかかわらず、これらの二つのELISAプロトコルは、急速に、リガンド - 受容体相互作用を探索する可能性を示します。
提示された結果はIFNL1がIFNL2に比べIL28RAためにわずかに高い親和性を有し、かつIFNL3の親和性がIFNL2より3倍低いことを示しています。これはIFNLs間の類似性を考慮すると顕著です。 IFNL1とIFNL2 DIFIFNL2とIFNL3は7アミノ酸8のみが異なるながら33個のアミノ酸でFER。 IL28RAとIFNLsとの間の相互作用は、ヘリックスAとIFNL 9のABループを伴います。 IFNL配列のアラインメントは、4つの重要なヘリックスAの違いとIFNL1とIFNL3( 図5A)との間にABループを明らかにしています。一つは、塩橋Arg54-Glu119に影響を与えます。このセクションのアミノ酸残基は、UniProtのはIFNL1-IL28R1複合体( 図の結晶構造中に発見されたQ8IU54(IFNL1)、Q8IZI9(IFNL3)、Q8IZJ0(IFNL2)とQ8IU57(IL28RA)を、エントリに従って列挙されています図5(b))。構造アラインメントはIFNL1におけるArg57もGlu118( 図5C)と塩橋を形成することができるINFL3でLys57により置換されていることを示しています。 IFNL3とIL28RAの親和性の低下、計算10,11および突然変異12と一致しては、Lys-Gluの塩橋は、一般にArgを-Gluのサルよりも安定していること、ショーを分析しますトンブリッジ。
ヘリックスAのアミノ酸配列はIFNL2とIFNL3について同一であるので、ヘリックスAの差は十分、IFNL3の低い親和性を説明していません。主な違いは、Arg74とIFNL2でHis76がIFNL3 8にLys70およびArg72に置き換えられているAB-ループ内の変異から生じると考えられています。
また、IFNLs間の安定性および溶解度の違いもアッセイの結果に影響を与える可能性があります。直接LRAアッセイはMに1nmから濃度を使用し、血清中のサイトカインの生理的濃度はpMのnmの範囲にあるので、IFNLの凝集を除外することはできません。私たちは、IFNの観察された正の協同が特定または不特定のリガンド-受容体結合の増加、 例えば、溶液中の組換えIL28RA受容体の二量体化、または第二のリガンドまたはリガンドフラグメントの結合によって引き起こされるバインディングと仮定することができますより高い親和性を有します。ホーweverは、さらなる研究がこれを確認するために必要とされています。
競争LRAの模倣でIFNL3のABループを使用し、ブロッキングペプチド( 図6)。前述したように、ABループはIFNLsとIL28RA 9、特にIFNL2とIFNL3の間の相互作用において重要な役割を果たしています。 IL28RA / IFNL1の結晶構造を有するIFNL3のホモロジーモデリングは、ブロッキングペプチドに対応する領域は、IL28RA( 図6)との相互作用界面に空間的に近接にあることを示しています。 IFNLとIL28RAのABループのペプチドブロックの相互作用を想定。競争LRAの結果はこれをサポート:ペプチドはすべてIFNLsの結合に対する阻害効果を有する、しかしペプチドはIFNL1とIL28Aの相互作用のよりIL28RA及びIFNL3またはIFNL2のいずれかとの間の相互作用のより効果的な阻害剤です。予想通り、ペプチドブロックはそれ以来、最も効果的IFNL3の結合しますIFNL3のAB-ループとまったく同じ結合ポケットを占めています。
表3に示すように 、ブロッキングペプチドに整列IFNL1とIFNL2のAB-ループが異なります。 IFNL1 / IL28RAの相互作用を阻害するためのペプチドの低いIC 50値と一致して、12個のアミノ酸は、一方IFNL1とペプチドとの間で異なっており、2つだけのアミノ酸がIFNL2とペプチドとの間で異なります。これはIFNLsとIL28RAのAB-ループ間の相互作用のため、わずかに異なる結合モードがあることを示し、IFNL1を模倣するペプチドはIFNL3とIL28RAの間の相互作用よりもIFNl1とIL28RAの間の相互作用を遮断するのにより効果的であろうと予測しています。
さらに、ペプチドは、全体的にプラスに(4アルギニンと2のリジン残基が、2つだけのアスパラギン残基)に帯電され、コンピュータ解析は、ペプチドは、定義された二次モチーフを持っていないことを示しています。そのコイル状、柔軟なSTのためにructureペプチドはまた、受容体の他の領域に結合する可能性があります。これは、潜在的に、そのようなリガンド-受容体複合体( 図5Bおよび5C)を安定化する塩橋を形成D118、などのグルタミン酸やアスパラギン残基をブロックすることができます。
IFNL1(緑)、IFNL3(青)の 図5 の構造の比較。酸素原子は赤色で表示され、窒素原子は青で示されています。 (A)IL28RA結合IFNL1とIFNL3(IL28RA図示せず)の重ね合わせ。ルートは、すべての整列の原子の二乗偏差(RMSD)を意味0.672Åです。 IFNL1異なるIFNL3の側鎖は、光ピンク色で強調表示されます。 (B)Arg54とD118の間の塩橋。 IL28RA結合IFNL1へ(C)IFNL3整列し(IL28RAはグレーで表示されます)。アライメントは、Arg-Gluの塩BRIことを示していますDGEはおそらく少ない安定のLys-Gluの、Lys57とD118の間の塩橋によって置き換えられています。 PyMolは、図の準備のためとの位置合わせのために使用した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
IFNL3の 図6. アライメント(図示せずIFNL1)複雑なIFNL1-IL28RA。IFNL3はブルーとグレーでIL28RAに示されています。ブロッキングペプチドに対応する領域が紫色で強調表示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表3:
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
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