Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

ELISA на основе связывания и метод конкуренции быстро определить лиганд-рецепторных взаимодействий

Published: March 14, 2016 doi: 10.3791/53575
Automatic Translation
1, 1,2,3, 4, 5, 4,6, 4, 7, 4, 4, 1,8
1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, and Swiss Institute of Bioinformatics, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Li Ka Shing Institute for Virology, University of Alberta, 5Regional Infectious Diseases Unit, University of Edinburgh, 6Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Alberta, 7Infection Biology, Department of Biomedicine, University of Basel, 8Clinical Microbiology, University Hospital Basel

Introduction

Полное понимание сигнальных путей требует детального знания о взаимодействии лиганд-рецептор. Большинство методов оценки взаимодействия конкретного лиганда с его специфическим рецептором являются дорогостоящими, отнимает много времени, трудоемкими и требуют специального оборудования и опыта 1.

В данной статье описываются два быстрых и надежных протоколов точка за точкой для исследования взаимодействия лиганд-рецептор на основе иммуноферментного анализа (ИФА): анализ на прямой лиганд-рецептор взаимодействия (LRA) и конкуренция LRA. ELISA является высокочувствительным, специфические и легко доступны метод, обычно используется почти в каждой лаборатории. ELISA, могут быть выполнены и адаптированы в различных модах. Представленные протоколы оптимизированы для изучения взаимодействия между различными интерферонами лямбда (INFLs) и их рецепторов.

Прямой LRA позволяет использовать quantificatiна лиганд-рецептор связывания в отношении концентрации лиганда и, таким образом, дает кривую связывания. С помощью соответствующего модели взаимодействия лиганд-рецептор, эти данные могут быть дополнительно проанализированы , чтобы оценить константу диссоциации (K D).

В представленном протоколе, обычно используется уравнение Хилла применяется для моделирования лиганд-рецептор связывания. Хотя другие методы , такие как поверхностного плазмонного резонанса технологии 2,3 позволяют определить аффинности связывания между двумя белками, эта технология часто трудоемкий, дорогой и требует специального лабораторного оборудования.

Конкурс LRA позволяет скрининг ингибирующих пептидов: лиганд-рецептор связывания количественно по отношению к концентрации пептида. Это дает кривую доза-ответ, описывающую ингибирующее действие пептида. Данные могут быть дополнительно проанализированы , чтобы оценить максимальную концентрацию ингибирования половину (IC 50

Оба протокола ELISA просты в использовании, и может быть адаптирован к широкому кругу вопросов исследования. Рекомбинантные белки любого типа могут быть использованы, чтобы надежно и быстро определить детали взаимодействия. Кроме того, конкуренция LRA может быть использован для определения критических участков взаимодействия лигандов и рецепторов с использованием блокирующих пептидов, которые предназначены для имитации либо лиганд, либо рецептор. Если блокирующий пептид показывает эффективное и специфическое ингибирование, пептид занимает критический сайт взаимодействие лиганда (если пептид имитирует рецептор) или лиганда (если пептид имитирует лиганд).

Первый протокол описывает определение K D значение различных INFLs и альфа - субъединицу их рецепторов, т.е. интерлейкин-28 - рецептора (IL28RA) с использованием прямого LRA. Далее, второй протокол показывает, как определить способность 20 аминокислот, длинного пептидаингибируют взаимодействие INFL-IL28RA. Пептид предназначен, чтобы конкурировать с IFNLs на их сайт связывания с рецептором и, таким образом, позволяет молекулярное понимание взаимодействия. Кроме того, этот пептид может быть использован для блокирования IL28RA в экспериментах в пробирке , чтобы определить влияние на нижестоящих сигнальных эффектов 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов

  1. Для получения карбонатного буфера для нанесения покрытия, растворения 0,36 г Na 2 CO 3 и 0,84 г NaHCO 3 в 100 мл дистиллированной воды; стерильный фильтр буфер с использованием вакуума не приводимый 0,22 мкм полиэфирсульфона (PES) мембранный фильтр и хранить при комнатной температуре до использования.
  2. Приготовьте моющий раствор путем добавления 0,05% об / об Твина 20 в фосфатном буферном растворе (PBS).
  3. Приготовьте 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (блокирующий раствор) в растворе PBS растворением 5 г БСА (≥98%) в 100 мл PBS и хранят при температуре 4 ° С.
  4. Рекомбинантный Рецептор, лигандами и блокирующие Пептиды
    1. Reconstitutethe рекомбинантного человеческого рецептора интерлейкина альфа-субъединицы (IL28RA) и рекомбинантных His-помеченных лигандов человеческого IFN (IFNL1-3) в соответствии с инструкциями изготовителя и хранить при температуре -80 ° C. Синтезируют блокирующие пептиды и использовали , как описано выше 4. Используйте PBS для приготовления различных концентраций лигандаs и пептиды для использования в анализах.
  5. Для получения первичного антитела, разбавленные 6X Его мышиных моноклональных антител в PBS с 0,1% BSA в соотношении 1: 1000 разбавления. Для приготовления вторичного антитела, разбавленные с пероксидазой хрена (HRP), конъюгированное козье антитело против мышиных IgG (H + L) в PBS с 0,1% BSA в соотношении 1: 10000 разбавления.
  6. Приготовьте раствор ТМБ путем смешивания реагентов А и В в соответствии с инструкциями изготовителя.
  7. Подготовка стоп - раствора путем добавления 5 N серной кислоты (H 2 SO 4) в дистиллированной воде и хранят при комнатной температуре.

2. иммуноферментного анализа (ИФА)

Примечание: Прямое взаимодействие лиганд-рецептор - ELISA (прямая LRA, рисунок 1) может быть использован для измерения диссоциации рецептор-лиганд константа (K D), как меру рецептор-лиганд , сродство связывания. Взаимодействие конкуренции лиганд-рецептор ELISA (конкуренция LRA, рис 2) всеOWS скрининга пептидов (и других блокирующих соединений), которые действуют, чтобы помешать взаимодействию между лигандом и рецептором. Основной протокол , который ранее был опубликован 5 была оптимизирована.
Примечание: В обоих ИФА методы используют многоканальную пипетку для добавления растворов в лунки 96-луночного планшета в каждой стадии. В Декантируйте растворе или стадии промывки, выбрасывают решения непосредственно в раковину.

  1. Прямой лиганд-рецептор-Взаимодействие анализа (прямой LRA)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для иллюстрации рабочего процесса (см рисунок 1).
    1. Покрытие Тарелка с рецепторе Рекомбинантного
      1. Развести рекомбинантный рецептор в карбонатном буфере до конечной концентрации 100 нг / мкл. Coat лунки 96-луночного планшета для микротитрования с фиксированной концентрацией рецепторов (100 нг / мкл) с помощью пипетки 100 мкл в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Исключить внешние стены пластины, чтобы избежать хорошо края артефакт. Закройте планшет крышкой и инкубироватьпластины при температуре 4 ° CO / N.
    2. Блокирование и добавление ЛИГАНДАМИ
      1. На следующий день, удалить раствор для покрытия путем наклона пластины к раковине и вымыть пластины 3 раза промывочным раствором (PBS + 0,05% об / об Твина 20).
      2. Блок свободные участки рецептора-связывания в пластине с покрытием с использованием 200 мкл 5% раствора БСА в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре.
      3. Откажитесь блокирующий раствор (см этап 2.1.2.1.) И мыть пластины 3 раза промывочным раствором.
      4. Готовят рекомбинантный His-меткой лигандов при различных концентрациях (например, 8 мкг / мл, 4 мкг / мл, 2 мкг / мл, 1 мкг / мл, 0,5 мкг / мл, 0,25 мкг / мл, 0,125 мкг / мл, 0,063 мкг / мл, 0,031 мкг / мл, 0,0 мкг / мл) в PBS. Добавьте только PBS в пустых лунок.
      5. Добавьте 100 мкл каждой концентрации лиганда в лунки в двух повторностях и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре позволяет рецептор-лигандвзаимодействие.
    3. Инкубационный с антителами
      1. После инкубации с лигандами, промыть пластины 3 раза промывочным раствором.
      2. Пипетка по 100 мкл первичного анти-His раствора антитела мышиного моноклонального (1: 1000) в каждую лунку.
      3. Инкубируйте планшет при КТ в течение 2 ч; после инкубации, вылейте раствор антител (смотри стадию 2.1.2.1.) и мыть пластины 3 раза промывочным раствором.
      4. Добавьте 100 мкл HRP в сочетании коза раствора вторичного антитела против мышиного IgG (1: 10000) в каждую лунку. Инкубируйте планшет в течение 45 мин при комнатной температуре.
      5. Выбросьте раствор антител (смотри стадию 2.1.2.1.) И мыть пластины 3 раза промывочным раствором.
    4. Добавление субстрата и развития
      1. Доведите растворы субстрата TMB до комнатной температуры и подготовки субстрата ТМВ раствора А и В в соотношении 1: 1. Добавляют 100 мкл свежеприготовленные субстрата в каждую лунку и держать планшет при комнатной температуре в течение 15-30 мин. После достаточного седловине или развитие добавляют 50 мкл раствора стоп.
    5. Чтение пластины и анализ данных
      Примечание: Описанный протокол основан на предположении, что измеренный сигнал поднимается от специфического связывания. Это может быть необходимо, чтобы оценить вклад неспецифического связывания с сигналом, но это выходит за рамки данного протокола.
      1. Измерить оптическую плотность (оптическая плотность, OD) непосредственно при длине волны 450 нм.
      2. Вычтите фоновый сигнал от измеренных значений ОП и нормализовать их. Преобразовать все значения концентрации лиганда в логарифмическом масштабе ( по основанию 10, log 10).
      3. Участок нормализовалась и фон скорректированного значения ОП (Y-ось, соответствует доле занятых связывания с рецептором сайтов) против логарифма концентрации лиганда (оси Х, логарифмическая шкала 10).
      4. Для оценки величины K D, соответствует данным в следующей форме уравнения Хилла:
        tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
        Примечание: Здесь Y обозначает долю занятых сайтов связывания рецепторов и Y макс максимального связывания; [L] обозначает концентрацию свободного лиганда и коэффициента Хилла. Если есть только один сайт связывания лиганда, коэффициент Хилла п = 1. Для систем с сайтом связывания более одного лиганда, связывание проявляет положительный кооперативности, если п> 1, отрицательная кооперативность, если п <1 и, если п не кооперативности = 1. микроскопическое константа диссоциации называется и соответствует половине максимальной эффективной концентрации EC 50 6. Кажущаяся константа диссоциации K d = (K D) п. В простейшем случае , когда п = 1, константы диссоциации соответствует концентрации лиганда , при которой половина рецептора сайтов связывания заняты и K d = K D. Эта модель предполагает связывание в условиях равновесия, а также, что лишь небольшая часть массовых действийдобавленный лиганд , связанный с рецептором, то есть, [L] >> [RL].

Рисунок 1
Рисунок 1. Анализ Прямой лиганд-рецептор-взаимодействие (прямое LRA). Шаг за шагом протокол для прямого LRA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Конкурс лиганд-рецептор-Взаимодействие анализа (конкурс LRA)
    Примечание:. Для иллюстрации рабочего процесса смотри Рисунок 2 Порядок проведения конкурсов LRA те же шаги, что и прямой LRA (нанесение покрытия на пластину, инкубирование антитела, развитие пластины) для важных изменений лиганда и пептидов , кроме стадии добавления. Надлежащие отрицательные контроли имеют важное значение для данного анализа. В предыдущем исследовании скрининга <SUP> 4, зашифрованное блокирующий пептид не проявлял антагонистические эффекты.
    1. Блокирование - Добавление ЛИГАНДАМИ и преграждать пептидами
      1. На следующий день, удалить раствор для нанесения покрытия и промойте пластину (см 2.1.2.1).
      2. Блок пластины с покрытием путем добавления 200 мкл 5% раствора БСА в каждую лунку и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре.
      3. Получения рекомбинантного His-маркированные лиганды (IFNL1-3) при фиксированной концентрации (2x-20 нг / мл) в PBS.
      4. Приготовьте блокирующий пептид (см Таблицу 3) с различными концентрациями в диапазоне от 10 нМ до 100 мкМ в PBS , чтобы гарантировать кривую доза-ответ.
        Примечание: Это позволяет последующее определение значения IC 50 для блокирующего пептида. В контрольных лунках, добавьте только фиксированную концентрацию лиганда без пептида, чтобы получить максимальную (100%) связывания. В заготовке, добавляют только PBS без лиганда или пептида.
      5. Добавьте 50 мкл лигандов (IFNL1-3) и 50 мкл каждого реptide концентрация в лунки в двух экземплярах.
      6. Инкубируйте планшет в течение 2 ч при комнатной температуре.
    2. Чтение пластины и анализ данных
      Примечание: Описанный протокол основан на предположении, что измеренный сигнал поднимается от специфического связывания. Это может быть необходимо, чтобы оценить вклад неспецифического связывания с сигналом, но это выходит за рамки данного протокола.
      1. Измерить оптическую плотность (оптическая плотность, OD) непосредственно при длине волны 450 нм.
      2. Вычтите фоновый сигнал от измеренных значений ОП и нормализовать их. Преобразовать все значения концентрации пептида в логарифмической шкале ( по основанию 10, log 10).
      3. Участок нормализовалась и фон скорректированного значения ОП (Y-ось, соответствует доле занятых связывания с рецептором сайтов) против логарифма концентрации лиганда (оси Х, логарифмическая шкала 10).
      4. Для оценки величины IC 50, соответствует данным следующему уравнению:
        Уравнение 2
        Примечание: Здесь [P] означает концентрацию пептида, а наклон Хилла. Склон холма описывает крутизну кривой доза-реакция. IC 50 соответствует концентрации ингибитора , при которой наблюдается 50% ингибирование связывания между лигандом и рецептором.

фигура 2
Рисунок 2. Анализ конкуренции лиганд-рецептор-взаимодействия (конкуренция LRA). Шаг за шагом протокол для конкуренции LRA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Константы диссоциации между INFL1-3 и их рецептора альфа-субъединицы IL28RA определяли с использованием прямого LRA. Результаты показаны на рисунке 3: доля занятых участков связывания наносится на график логарифма соответствующей концентрации IFN. Скэтчарда данных отображается в правом нижнем углу. Результаты показывают , что прямая АСБ дает кривую связывания, которые могут быть дополнительно проанализированы , чтобы оценить значение K D. Величина К D определяли путем подгонки данных к уравнению Хилла (уравнение 1).

IFNL1 имеет самую высокую аффинность связывания с последующим IFNL2 и IFNL3. Коэффициент Хилла п> 1 предполагает повышенное сродство к дополнительных лигандов после начального взаимодействия лиганд-рецептор (см Обсуждение). Расчетные константы диссоциации и коэффициенты Хилла приведены в таблице 1.

Конкурентное LRA использовали для количественной оценки влияния блокирующего пептида на взаимодействие между IFNL1-3 и IL28RA (рисунок 4). Доля занятых участков связывания при концентрации лиганда 10 нг / мл в виде зависимости от логарифма концентрации пептида. Для оценки значения IC 50, данные установлены на уравнение 2.

Блокирующий пептид ингибирует взаимодействие между IFNL3 и IL28RA (IC 50 = 0,26 мкМ) в наибольшей степени. IC 50 в два раза выше для взаимодействия IFNL2-IL28RA (IC 50 = 0,50 мкМ) и один порядок выше , для взаимодействия IFNL1-IL28RA, ориентировочный пептид был менее эффективен при срыве IFNL1-IL28RA взаимодействий. Установленные значения IC 50 и наклоны Hill представлены в таблице 2.

_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Анализ соответствующих данных имеет важное значение для понимания взаимодействия лиганд-рецептор Представленные результаты были получены с использованием научно - графическое программное обеспечение , такие как GraphPad PRISM Для определения значения K D.. , данные были установлены на "Один сайт - специфически связывающийся с наклоном Хилла. (. соответствует уравнению 1 в разделе 2.2.1) для определения IC 50 значения, данные установлены в журнал функции '(ингибитор) против . нормализованное ответ -. переменный наклон '(см. уравнение 2 в п 2.2.2) Тем не менее, можно использовать любое программное обеспечение для нелинейного регрессионного анализа.

Рисунок 3
Рисунок 3. Результаты анализа прямого лиганд-рецептор (прямое LRA). Связующие кривые для связывания IFNL1 (зеленый), IFNL2 (красный) и IFNL3 (синий) к IL28RA. Соответствующий участок Скэтчарда в правом нижнем углуугол предполагает положительный кооперативности связывания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Результаты конкурентного анализа лиганд-рецептор (конкурентная LRA). Кривые доза-реакция , показывающие ингибирование связывания IFNL1 (10 нг / мл, зеленый), IFNL2 (10 нг / мл, красный) и IFNL3 (10 нг / мл, синий) к IL28RA от 20 аа пептида. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1
Таблица 1: Расчетные константы диссоциации (K D) И коэффициенты Хилла из IFNL1-3 связывания с IL28RA. Стандартная ошибка (SE) задается для размера выборки из четырех повторностей на каждую точку данных.

Таблица 2
Таблица 2:. Расчетный период максимальные ингибирующие концентрации (IC 50) , блокирующих пептидов и склона холма кривой доза-реакция для связывания IFNL1-3 с IL28RA Концентрация IFN составляет 10 нг / мл. Число повторностей равно трем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ELISA является стандартным и хорошо общепризнанный метод для многих лабораторий. Далее мы изменены и улучшены ранее опубликованного метода 5,7. Продемонстрировал шаг за шагом протокол показывает , как он может быть использован в простой способ для определения значений K D взаимодействий лиганд-рецептор. Кроме того, ИК 50 блокирующего пептида, который препятствует взаимодействию лиганд-рецептор может быть определено.

Основные преимущества быстрая настройка, легкая подготовка реагентов и привычной обработки, так как большинство исследователей использовали протокол ELISA перед тем. Прямой АСБ протокол является очень гибким и может быть адаптирован для измерения многих белок-белковых взаимодействий. Рекомбинантные белки с His6- или альтернативный тег следует использовать в качестве партнера по связыванию с иммобилизованным партнером. Конкурс LRA может быть использовано в качестве инструмента скрининга для (I) определяют ингибирующее потенциал блокирующих соединений (пептиды, антитела, или небольшой молькул) и (б) определить критические места взаимодействия, используя блокирующие пептиды, предназначенные для имитации рецептор или лиганд.

Отрицательные контроли имеют важное значение для правильной интерпретации представленных анализов. В предыдущем исследовании скрининга 4, зашифрованное последовательность использованного блокирующего пептида не проявляли антагонистические эффекты. Тем не менее, другие пептиды показали способность блокирующего также после скремблирования, вероятно, из-за неспецифических электростатических взаимодействий.

Потенциальным ограничением является то , что этот анализ отражает ситуацию в пробирке. В частности, гетеродимерные рецепторы часто образуют более сложную структуру. Это не представляется возможным различать ли просто связывает лиганд с рецептором или лигандом, также активирует рецептор, вызывая изменение конформации или димеризации, который, в свою очередь, приводит к внутриклеточного сигнала ли. В представленном анализе мы использовали рекомбинантный рецептор, который Immobiliзет на твердой фазе. Эта установка не работает, чтобы проверить активацию или исследовать взаимодействие рецепторов, которые требуют окружающей среды мембраны или мембранного холестерина, такие как G-белком рецепторов (GPCRs). Кроме того, использование рекомбинантного белка вызывает предостережений. Например, сгибание и третичной структуры рекомбинантного белка может отличаться по сравнению с ситуацией в естественных условиях. Связывание лиганда и рецептора, как правило, происходит при комнатной температуре, однако в организме человека оптимальная температура будет 37 ° С. И, наконец, использование коммерческого рекомбинантного лиганда и рецептора может оказаться дорогостоящим. Несмотря на эти ограничения, эти два протокола ELISA показывают потенциал для быстрого изучения взаимодействия лиганд-рецептор.

Представленные результаты показывают, что IFNL1 имеет немного более высокое сродство к IL28RA по сравнению с IFNL2, и близость IFNL3 в три раза ниже, чем IFNL2. Это примечательно, учитывая сходство между IFNLs. IFNL1 и IFNL2 диффер в 33 аминокислот , в то время как IFNL2 и IFNL3 различаются только в семи аминокислот 8. Взаимодействие между IL28RA и IFNLs включает Helix A и AB-петля IFNL 9. Выравнивание IFNL последовательностей показывает четыре существенные различия в Helix A и AB-петлю между IFNL1 и IFNL3 (рис 5А). Один влияет на солевой мостик Arg54-Glu119. Аминокислотные остатки в этом разделе перечисляются в соответствии с UniProt записей Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) и Q8IU57 (IL28RA), который был обнаружен в кристаллической структуре IFNL1-IL28R1 комплекса (рис 5В). Структурное выравнивание показывает , что Arg57 в IFNL1 заменяется Lys57 в INFL3, который также способен образовывать солевой мостик с Glu118 (рис 5в). В соответствии с уменьшением сродства IFNL3 и IL28RA, вычислительная 10,11 и мутационный 12 анализы показывают, что Lys-Glu солевых мостиков в целом менее устойчивы , чем Arg-Glu участокт мосты.

Тем не менее, различия в Helix А не удовлетворительно объяснить более низкую аффинность IFNL3, так как аминокислотная последовательность Helix A является идентичным для IFNL2 и IFNL3. Считается , что основное различие возникает из - за мутаций в АВ-петле, где Arg74 и His76 в IFNL2 заменяются Lys70 и Arg72 в IFNL3 8.

Кроме того, различия в стабильности и растворимости между IFNLs также может повлиять на исход анализа. Так как прямой LRA анализе используют концентрации от нМ до М и физиологической концентрации цитокинов в сыворотке лежит в стр.м.в нМ диапазоне, агрегация IFNL не может быть исключена. Можно предположить , что наблюдаемая положительная кооперативность ИФН связывание обусловлено специфическим или неспецифическим увеличением лиганд-рецепторного связывания, например, димеризации рекомбинантного рецептора IL28RA в растворе, или связывание второго лиганда или его фрагмента лиганда с более высоким сродством. эйWever, необходимы дальнейшие исследования, чтобы убедиться в этом.

Блокирующий пептид , используемый в конкуренции LRA имитирует AB-петлю IFNL3 (рисунок 6). Как было описано выше, AB-петля играет существенную роль во взаимодействии между IFNLs и IL28RA 9, в частности , IFNL2 и IFNL3. Гомология моделирование IFNL3 с кристаллической структурой IL28RA / IFNL1 показывает , что область, которая соответствует блокирующего пептида находится в непосредственной пространственной близости к интерфейсу взаимодействия с IL28RA (рисунок 6). Предполагается, что пептид блокирует взаимодействие АВ-петле IFNL и IL28RA. Результаты поддержки конкуренции LRA этого: пептид обладает ингибирующим действием на связывание всех IFNLs, однако этот пептид является более эффективным ингибитором взаимодействия между IL28RA и либо IFNL3 или IFNL2 чем взаимодействия IFNL1 и IL28A. Как и следовало ожидать, этот пептид блокирует связывание IFNL3 наиболее эффективно, так как емузанимает точно такой же, как связывающий карман АВ-петле IFNL3.

Как показано в таблице 3, AB-петли IFNL1 и IFNL2 выровнен к блокированию пептида отличаются. В соответствии с более низким значением IC 50 пептида для ингибирования взаимодействия IFNL1 / IL28RA, двенадцать аминокислот различаются между IFNL1 и пептидом , тогда и только две аминокислоты различаются между IFNL2 и пептидом. Это указывает на то, что существует несколько различных режимов связывания для взаимодействия между AB-петель IFNLs и IL28RA и предсказывает, что пептиды, которые имитируют IFNL1 будет более эффективной при блокировании взаимодействия между IFNl1 и IL28RA, чем взаимодействие между IFNL3 и IL28RA.

Кроме того, пептид в целом положительно заряженным (четыре аргинином и два остатка лизина, но только два аспартат остатков) и вычислительный анализ показывает, что пептид не имеет определенных вторичных мотивов. Из-за его свернутой, гибкой стructure пептид может также связываться с другими регионами рецептора. Это может потенциально блокировать глутамат и аспартат остатки , такие как D118, который образует солевой мостик , чтобы стабилизировать лиганд-рецепторного комплекса (рис 5В и 5С).

Рисунок 5
Рисунок 5. Структурная сравнение IFNL1 (зеленый) и IFNL3 (синий). Атомы кислорода показаны красным цветом, атомы азота показаны синим цветом. (А) При наложении IL28RA связанного IFNL1 и IFNL3 (IL28RA не показано). Среднеквадратичное отклонение (СКО) всех выровненных атомов 0,672 Å. выделяются боковые цепи IFNL3, которые отличаются от IFNL1 в светло-розовый цвет. (B) Соль мост между Arg54 и D118. (C) IFNL3 выровнено с IL28RA связанного IFNL1 (IL28RA показан серым цветом). Выравнивание показывает, что соль BRI Арг-GluDGE, вероятно, заменить менее стабильной Lys-Glu, соляного моста между Lys57 и D118. PyMOL был использован для подготовки фигур и для выравнивания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Выравнивание IFNL3 и IFNL1-IL28RA комплекс (IFNL1 не показан). IFNL3 показана синим цветом , а IL28RA в серый цвет. Области , соответствующие блокирующих пептида выделены фиолетовым цветом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 3
Таблица 3:

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) Thermo Scientific 442404 ELISA plate
Sodium carbonate (Na2CO3) Merck 497-19-8 For ELISA plate coating buffer
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) Merck 144-55-8 For ELISA plate coating buffer
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030-100G 5% BSA in PBS for Blocking
rhIL-28Rα/IFNλR1 R&D systems 5260-MR Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha
rhIL-29/IFNλ1 R&D systems 1598-IL/CF Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag
rhIL-28A/IFNλ2 R&D systems 1587-IL/CF Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag
rhIL-28B/IFNλ3 R&D systems 5259-IL/CF Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag
6x His Monoclonal antibody (Mouse) Clontech 631212 Primary antiboy to capture His tagged Ligands
Goat anti-Mouse igG (H+L) Jackson Immuno Research 115-035-166 Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody
BDoptEIA TMB reagent set BD Biosciences 555214 ELISA - TMB substrate solution
Sulfuric acid (H2SO4) Fulka 84720 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution)
Synergy/H1 - Microplate reader BioTeK ELISA plate reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
  2. Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
  3. van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
  4. Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
  5. Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
  6. Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
  7. Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
  8. Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
  9. Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
  10. Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
  11. Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
  12. Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).

Tags

Химия выпуск 109 ИФА скрининг взаимодействие лиганд-рецептор константа диссоциации сродство к связыванию блокируя
ELISA на основе связывания и метод конкуренции быстро определить лиганд-рецепторных взаимодействий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Syedbasha, M., Linnik, J., Santer,… More

Syedbasha, M., Linnik, J., Santer, D., O'Shea, D., Barakat, K., Joyce, M., Khanna, N., Tyrrell, D. L., Houghton, M., Egli, A. An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions. J. Vis. Exp. (109), e53575, doi:10.3791/53575 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter