Summary
Le protocole décrit une nouvelle méthode pour désagréger les tissus humains et de créer des micro-greffes autologues qui, combiné avec des éponges de collagène, donnent lieu à des bio-complexes humains prêts à l'emploi dans le traitement des lésions de la peau. En outre, ce système préserve la viabilité des cellules de micro-greffes à différents moments après la désagrégation mécanique.
Abstract
Plusieurs nouvelles méthodes ont été développées dans le domaine de la biotechnologie pour obtenir des suspensions cellulaires autologues pendant la chirurgie, afin de fournir un traitement étape pour les lésions aiguës et chroniques cutanées. En outre, la gestion des plaies chroniques, mais aussi aiguës résultant d'un traumatisme, le diabète, les infections et d'autres causes, reste difficile. Dans cette étude, nous décrivons une nouvelle méthode pour créer des micro-greffes autologues de tissu cutané d'un seul patient et leur application clinique. En outre, la caractérisation biologique in vitro du tissu cutané dérivé de la peau, de-épidermisé derme (DED) et le derme de plusieurs organes et / ou les donateurs multi-tissus a également été réalisée. Tous les tissus ont été ventilées par ce nouveau protocole, ce qui nous permet d'obtenir des micro-greffes viables. En particulier, nous avons signalé que ce protocole innovant est capable de créer des bio-complexes constitués par des micro-greffes autologues et les éponges de collagène prêt à être appliqué sur des lésions cutanées. Le Clinil'application de cal autologues bio-complexes sur une lésion de la jambe a également été rapporté, montrant une amélioration des deux processus de ré-epitalization et la douceur de la lésion. De plus, notre modèle in vitro ont montré que la viabilité des cellules après la désagrégation mécanique avec ce système est maintenue au fil du temps pour un maximum de sept (7) jours de culture. Nous avons également observé, par cytométrie de flux, que le pool de cellules obtenues à partir de désagrégation est composée de plusieurs types cellulaires, notamment les cellules souches mésenchymateuses, qui exercent un rôle clé dans les processus de régénération et de réparation tissulaire, de leur potentiel de régénération élevé. Enfin, nous avons montré in vitro que cette procédure maintient la stérilité des micro-greffes lorsqu'elles sont cultivées dans des boîtes de gélose. En résumé, nous concluons que cette nouvelle approche régénérative peut être un outil prometteur pour les cliniciens d'obtenir en une seule étape viable, stérile et prêt à utiliser des micro-greffes qui peuvent être appliqués seuls ou en combinaison avec la plupart Scaffo biologique communelds.
Introduction
Au cours des dernières années, plusieurs nouvelles méthodes ont été développées dans le domaine de la biotechnologie pour obtenir des suspensions cellulaires autologues lors de la chirurgie afin de fournir des traitements en une seule étape pour les lésions aiguës et chroniques cutanées. En outre, la gestion des plaies aiguës mais surtout chroniques résultant d'un traumatisme, le diabète, les infections, et d'autres causes, reste difficile. Il y a des preuves croissantes que les plaies chroniques sont devenues un problème mondial grave pour la santé, provoquant un énorme fardeau financier sur les systèmes de soins de santé à travers le monde 1.
Pour augmenter le taux de réussite dans le traitement des lésions de la peau, l'absence d'une manipulation extensive (y compris le renforcement cellulaire) et le maintien de conditions stériles est indispensable, afin de créer une suspension cellulaire qui peut être immédiatement appliquée sur la zone endommagée du patients, évitant ainsi un traitement plus dans les salles blanches telles que Cell Factories. Starting de petites biopsies de peau, le broyage, centrifugation et autres procédés de séparation (par exemple, enzymatique ou mécanique), sont fréquemment utilisés pour obtenir une suspension cellulaire, qui peut être cultivée dans un milieu de croissance. Toutes ces méthodes nécessitent généralement une longue durée d'exécution, en insistant sur les structures cellulaires, et conduisant à une réduction de la viabilité cellulaire. Un autre aspect important est d'obtenir une suspension cellulaire autologue prêt à être utilisé par les cliniciens, par exemple, pour réparer des zones endommagées. Par ailleurs, il est bien établi que les greffes de tissus autologues survivent à la procédure de transfert pour survivre éventuellement dans le site receveur par les principes de l' induction et conduction 2, 3. Le tissu greffé idéal doit être facilement disponible et ont une faible antigénicité et donneur morbidité du site 4.
Sur la base de ces preuves, le premier objectif de cette étude était de créer des bio-complexes autologues appropriés pourl'application clinique dans la réparation tissulaire. A cet effet, nous décrivons une nouvelle méthode pour obtenir des micro-greffes autologues à partir de tissus cutanés qui ont été ventilés par ce protocole. Une présentation de cas est également décrit ici comme une application clinique de micro-greffes autologues obtenus par ce protocole en combinaison avec des éponges de collagène. Cette approche a déjà été rapporté pour être efficace dans la désagrégation mécanique des tissus humains 5 et il a été utilisé cliniquement pour les greffes et la régénération des tissus dermiques 6,7, ainsi que pour les thérapies régénératives des tissus conjonctifs en chirurgie buccale-maxillo 8-10 .
En outre, le deuxième objectif de cette étude était la caractérisation biologique des tissus cutanés après leur ventilation par ce protocole. A cet effet, différents échantillons de tissu cutané homologues issus de la zone de tronc de différentes multiviscéraleet ou des donateurs / multi-tissus ont été traités suivant les règles nationales en matière de récolte, la transformation et la distribution de tissus destinés à la transplantation (CNT) 2013 à la Banque de peau Emilia Romagna régionale.
CASE PRESENTATION:
A 35 ans, patiente montrant un traumatisme complexe en raison d'un accident de voiture a été admis à l'unité de l'hôpital Ancona de soins intensifs. Le patient a montré une infection à la jambe en raison d'une blessure ouverte et une fracture stabilisée avec fixation externe. Deux débridement radical ont été effectuées et lorsque la plaie est devenue propre après thérapie par pression négative (thérapie VAC) et le périoste est apparu en bonne santé, nous avons appliqué le protocole après deux mois de récupération. Après la désagrégation de ce système, les micro-greffes obtenus ont été utilisés pour créer des bio-complexes avec une éponge de collagène qui ont ensuite été implantés afin d'étudier leur efficacité sur la réparation des lésions.
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Protocol
Déclaration éthique: depuis l'application clinique du protocole nécessite l'utilisation de tissu autologue cutanée du patient, sa caractérisation in vitro a été réalisée avant l' utilisation clinique sur le tissu cutané homologue à la Banque Emilia Romagna régionale de la peau en suivant les lignes directrices de la réglementation nationale sur la récolte, la transformation et la distribution de tissus destinés à la transplantation (CNT 2013).
1. Construction Bio-complexe pour l'application clinique
NOTE: Ce protocole est cliniquement basé sur l'utilisation de Rigeneracons (liste perturbateurs des tissus) et la machine Rigenera (système de disrupteur tissulaire) (figure 1A). Le disrupteur de tissu est un dispositif disruptif médical biologique des tissus humains capables de perturber les petits morceaux de tissus à l'aide d'une grille hexagonale fournie par les lames et les cellules de filtrage et des composants de la matrice extracellulaire avec une coupure d'environ 50 microns.
- Recueillir skinsamples du patient à travers un biOpsy poinçon (figure 1B) et désagréger en ajoutant 1 ml de solution saline pour chaque pièce pour obtenir des micro-greffes autologues 6,7,9 (ou voir l' étape 2.1).
- Placer 1 ml de micro-greffes sur des éponges de collagène (figure 1C) toform biologiques complexes à utiliser pour une application clinique.
- Une autre culture 1 ml de micro-greffes sur des éponges de collagène en présence de 6 ml de milieu DMEM additionné de 10% de sérum bovin fœtal à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% humidifiée.
- Après 3 jours de culture, fixer les bio-complexes avec 0,3% paraformaldéhyde pendant 10 min à température ambiante. Versez la paraffine avec un distributeur spécifique directement sur l'échantillon. Obtenir des tranches avec un microtome ayant une épaisseur de 5 pm et mettre directement dans un verre-lame.
- Immerger les tranches de paraffine de 5 um dans un verre pour l'analyse histologique, contenant 15 - 20 ml de xylène (disponible dans le commerce - un mélange de m-xylène (40-65%), le p-xylène (20%), o-xylène (20% ) et ethyl benzène (6-20%) et les traces de toluène, le triméthylbenzène, le phénol, le thiophène, la pyridine et le sulfure d'hydrogène) pendant 3 min à chaque fois.
- Immerger les tranches dans les classes décroissantes (100% à 70%) d'éthanol (éthanol à 100% pendant 1 heure, 95% d'éthanol pendant 1 heure, l'éthanol à 80% pendant 1 heure, éthanol à 70% pendant 1 heure) et de l'eau puis déminéralisée pour de-paraffinage et réhydrater les sections.
- Colorer les sections avec 1 - 2 ml de 1g / L Ematoxylin pour 1 - 2 min et rincer ensuite à l'eau pour éliminer tout excédent Ematoxylin.
- Colorer les sections pendant 4 - 5 min avec une solution alcoolique d'éosine Y à 1% de la concentration mélangée avec de l'éthanol à 70% et dilué dans l'eau.
- Utilisez 1 - 2 ml de éosine Y pour chaque section de lame et rincer sous l'eau courante du robinet.
- Immerger les coupes dans l' augmentation de grades de l' éthanol (voir étape 1.6) et enfin, après un passage dans Xylène pendant 1 h, avec une lamelle de montage à base de mediumand observer sous un microscope optique à grossissement 100X (figure 1D). </ Ol>
- À l'aide d'un dermatome, prendre un tissu indépendant de la peau, papillaires de-épidermisé derme (DED) ou le derme réticulaire (derme), respectivement, de 0,6 mm, 1 mm ou 2 mm d'épaisseur à partir de la zone de tronc de 4 multiviscérale différents et / ou multi- donneurs de tissus dans une plage de 40 à 55 ans, suivant les règles nationales sur la récolte, la transformation et la distribution de tissus destinés à la transplantation (CNT 2013).
- Rincer délicatement tous les échantillons en solution de NaCl à 0,9% de les mettre dans un plat sur un agitateur orbital pendant 5 min.
- Utilisation de la 5 mm biopsie punch, créer des échantillons qui sont uniformes de diamètre à partir du tissu de la peau, Ded et Derme et pèsent tous les échantillons de tissus avant la désagrégation.
- Insérez huit, trois ou quatre échantillons uniformes de tissus de la peau, Ded ou Derme respectivement, dans le disrupteur de tissu, en ajoutant 1,5 ml de solution saline pour la désagrégation.
- Effectuer différentstemps de désagrégation pour tous les échantillons de tissus , comme indiqué dans le tableau 1.
- Utilisez un nombre correspondant de biopsies dérivées à partir d'échantillons de tissus intacts comme témoins.
- Après la désagrégation mécanique, aspirer la solution saline contenant des micro-greffes et lieu séparément chaque échantillon dans un seul puits d'une plaque de 12 puits. Effectuez le même protocole pour les biopsies de contrôle intact.
- Ajouter 1 ml de milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et des antibiotiques à chaque échantillon.
- Évaluer immédiatement la viabilité cellulaire. Dans chaque puits contenant un micro-greffon (obtenu par la désagrégation simultanée de huit, trois ou quatre échantillons uniformes de tissu cutané, ou Déd Derme respectivement), ajouter 1 ml de milieu contenant 0,5 mg / ml de MTT (bromure de 3- [4,5- diméthylthiazol-2-yl] bromure) solution -2,5 de diphényltétrazolium et incuber pendant 3 heures à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2 / air. Effectuez le même protocole pour le contrôle intactpoinçonner biopsies.
- Après incubation, enlever tout milieu contenant MTT et ajouter à chaque échantillon de 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) pendant 10 min.
- Transférer chaque échantillon et du DMSO dans une cuvette de lecture et à une densité optique (DO) à 570 nm en utilisant un spectrophotomètre. Calculer la viabilité cellulaire comme le rapport de l'absorbance à 570 nm et le poids en grammes (gr) de tissu utilisé avant la désagrégation. Effectuez le même protocole pour les biopsies de contrôle intact.
- Après la désagrégation mécanique, aspirez le solution saline contenant des micro-greffe provenant de tissus de la peau, Ded et derme des échantillons d'un seul donneur.
- Placer chaque échantillon séparément dans un seul puits d'une plaque de 12 puits ou dans un flacon de culture pour le test de viabilité cellulaire et l'analyse morphologique, respectivement.
- La culture des micro-greffes en ajoutant 1 ml (plaque à 12 puits) ou 5 ml (flacon de culture) de milieu RPMI 1640 complété avec 10% de FBS et des antibiotiques à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2 / AIr pendant 24 heures ou 7 jours.
- Évaluer la viabilité cellulaire après 24 h ou 7 jours (répétez les étapes 2.1.8-2.1.10).
- Effectuer une analyse morphologique évaluer la présence de la suspension cellulaire par microscopie optique après 24 h et 7 jours de culture en flacon.
- Analyser les échantillons de Derme de positivité à l'mésenchymateuses et des marqueurs de cellules hématopoïétiques, y compris CD146, CD34 et CD45 antigènes par analyse FACS 6.
- Sous flux laminaire semences de hotte chaque micro-greffe (obtenu par la désagrégation simultanée de huit, trois ou quatre échantillons uniformes de tissus de la peau, Ded ou Derme respectivement) et un correspondant petit fragment de chaque échantillon de tissu pas totalement désagrégée (> 50 micron après le processus de désagrégation) sur Columbia plaque de gélose contenant 5% de bouillon de sang de mouton 100 pi.
- Incuber la plaque à 37 ° C pendant trois jours et effectuer des analyses microbiologiques sur Columbia plaque de gélose afin d'évaluer la stérilité 11.
2. Collecte, Désagrégation et Analyse in vitro des tissus
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Representative Results
Dans cette étude préliminaire, le premier objectif était d'étudier la capacité des micro-greffes autologues humaines combinées avec un support biologique, tels que le collagène, pour produire des bio-complexes prêts à l'emploi. Ces bio-complexes ont été implantés chez un patient avec une lésion de la jambe provoquée par un accident de voiture (figure 2A) et une réépithélialisation complète associée à la réparation des tissus après 30 jours (figure 2B) a été observée. En outre, le suivi clinique a montré une bonne texture et la douceur de la zone endommagée après 5 mois (figure 2C). Parallèlement à des applications cliniques, des études in vitro ont également été réalisées pour évaluer la viabilité des cellules de différents tissus cutanés tels que les tissus cutanés , Ded et derme avant et après la désagrégation par ce système. En particulier, compte tenu de la différence d'épaisseur de chaque type de tissu, le seuil de huit,quatre et trois biopsies qui peuvent être traitées en une seule étape pour les tissus de la peau, Ded et Derme, respectivement, a été créé. Le nombre établi de biopsies ont ensuite été ventilés à quatre moments différents , comme indiqué dans le tableau 1, en fonction de leurs caractéristiques biologiques, afin d'identifier la condition optimale de désagrégation pour maintenir une bonne viabilité cellulaire.
Bien que le traitement du tissu lui-même induit inévitablement une altération de la viabilité des cellules par rapport au tissu intact, la ventilation mécanique réalisée avec ce système semble maintenir une valeur moyenne de la viabilité cellulaire de 30% dans tous les échantillons de peau, DED et derme évalué à des moments différents (figure 3A), en ce qui concerne les tissus intacts (figure 3B) (moyenne de 92 OD / gr pour le tissu cutané intact et 29 OD / gr après la désagrégation; de 22 OD / gr à 7 OD / gr for intact Ded par rapport à la désagrégation et enfin de 16 OD / gr à 2,7 OD / gr pour le derme intact en ce qui concerne la ventilation). Ainsi, ces résultats préliminaires montrent que ce système soit capable de maintenir des niveaux appréciables de la viabilité des cellules après la désagrégation immédiat. L'effet de désagrégation sur la viabilité cellulaire a également été étudiée sur des échantillons de tissu en culture pendant 24 heures ou 7 jours et des résultats variables ont été observés. En particulier, aucune variation importante de la viabilité des cellules dans des échantillons de tissus de la peau a été observée indépendamment par le temps d'homogénéisation et de la culture par rapport au temps de départ (T 0) (figure 4A). D'autre part, une diminution de la viabilité des échantillons Ded après 24 h de culture par rapport à l' heure de début (T 0) a été observé de manière surprenante , mais la viabilité cellulaire a été rétablie après 7 jours de culture (figure 4B). Des résultats similaires ont également été observés pour des échantillons de derme (figure 4C). Chaque échantillon a été évalué en double et les valeurs rapportées dans le tableau 2.
Sur la base de ces résultats, nous avons identifié le temps approprié de désagrégation pour maintenir la viabilité des cellules pour trois types de tissu cutané tel que rapporté dans le tableau 3. En plus de la viabilité cellulaire, l'aspect morphologique de la suspension cellulaire en culture a également été évaluée, l' identification des cellules individuelles après 24 h de la désagrégation des tissus, tout au bout de 7 jours là - bas résidus de fibres dans les deux tissus de la peau et des échantillons Ded / derme ont été observées (Figure 5 AB). En outre, une caractérisation de cellules par cytométrie en flux analyse a été réalisée sur un échantillon de derme après son homogénéisation: un groupe hétérogène de cellules composées par plusieurs types cellulaires, y compris les cellules endothéliales et les cellules souches mésenchymateuses a été identifiée (figure 6). En outre, l'absence de croissance bactérienne a été identifiée i n tous les échantillons désagrégées opportunement ensemencées sur des boîtes de gélose, attestant la stérilité de la procédure expérimentale (figure 7).
Figure 1. Bio-complexes Tissue Building System Disrupting (A) et Collection d'un petit morceau de Derma de la zone Lésion du patient qui a ensuite été désagrégée avec Perturbateurs de tissus. Les bio-complexes ont été obtenus en combinant les micro-greffes sur des éponges de collagène pour obtenir des correctifs humains prêts à l' emploi pour la réparation de la lésion (C). (D) hématoxyline & éosine (H & E) coloration d'un représentant bio-complexe en culture pendant trois jours dans un milieu DMEM et observé à la microscopie S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande ce chiffre.
Figure Application 2. Bio-ensembles sur la jambe Lésion de la bio-complexes constitués par du collagène et des micro-greffes obtenus à partir du patient ont été appliqués sur la lésion de la jambe (A) et la plaie a été évaluée au bout de 30 jours (B) et de 5 mois (C ). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. C de Viabilité Immédiatement après Désagrégation à différents moments de trois types de tissus cutanés (A) par rapport à Intact cutanées Tissues (B). La peau, les tissus Ded et derme provenant de quatre donneurs différents ont été ventilés avec disru de tissuptors comme indiquer dans la section appropriée dans le texte. La viabilité cellulaire a été évaluée par un test MTT effectué en double pour chaque échantillon de tissu. Le graphique est représentatif des quatre expériences différentes effectuées en double pour chaque échantillon. Les résultats sont exprimés comme un rapport entre la densité optique (DO) et g (gr) de tissu; l'écart - type a été calculé sur le rapport entre la densité optique (DO) et grammes (gr) de tissu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Niveaux Figure 4. C ell Viabilité d'un échantillon désagrégées des tissus de la peau (A), Ded (B) et Derme (C) à partir de l' heure (T 0) et après Subculture pendant 24 heures et 7 jours. Les tissus ont été homogénéisés avec le tissu perturbateurs comme indicate dans la section appropriée dans le texte. Les échantillons ont ensuite été ventilées en culture pendant 24 heures et 7 jours après la désagrégation et maintenues dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum et des antibiotiques fœtal bovin à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO2 / air. La viabilité cellulaire a été évaluée par le MTT comme décrit précédemment. Le graphique est représentatif d'une expérience réalisée en double pour chaque échantillon de tissu de la peau, Ded et Derme dérivé d'un seul donneur. Les résultats sont exprimés en rapport entre la densité optique (DO) et grammes (gr) de tissu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Analyse morphologique du tissu cutané désagrégées (A) et Ded / Derme (B) après 24 heures et 7 jours de Cult ure. L' analyse morphologique a été réalisée en utilisant la microscopie optique après 24 h et 7 jours de culture en présence de milieu RPMI sur les tissus de la peau et Ded / derme tissus. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Cellule Caractérisation par cytométrie de flux Analyse. Après la désagrégation mécanique, micro-greffons obtenus par le derme ont été mis en culture et après 7 jours ont été analysés pour la positivité à mésenchymateuses et le marqueur de cellules hématopoïétiques, y compris CD146, CD34 et CD45 antigènes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 7. Analyse microbiologique des tissus de la peau désagrégées, Ded et Derme échantillons. De petits fragments d'échantillons de tissus désagrégées ont été ensemencées sur gélose Columbia ajoutée de 5% de sang de mouton (BioMerieux Company) sous hotte à flux laminaire et incubé à 37 ° C pendant trois jours pour effectuer l'analyse microbiologique et évaluer la stérilité de la procédure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Des échantillons de tissus | DÉSAGRÉGATION TIMES (sec / min) |
| Peau | 30 sec |
| 1 minute | |
| 2 min | |
| 5 min | |
| Ded | 1 minute |
| 2 min | |
| 5 min | |
| 10 minutes | |
| Derme | 1 minute |
| 2 min | |
| 5 min | |
| 10 minutes |
Tableau 1. Représentation schématique des quatre différents temps utilisés pour Décomposition de la peau, Ded et Derme. Huit, quatre et trois biopsies de peau, Ded et Derme respectivement ont été ventilés à quatre moments différents, en fonction de leurs caractéristiques biologiques.
| Des tissus cutanés | |||||
| À | 24 h | 7 jours | |||
| 2 ' | 5 ' | 2 ' | 5 ' | 2 ' | 5 ' |
| 37.1 | 41,07143 | 41,07143 | 65,78571 | 41,14286 | 37,42857 |
| 35,8 | 43,82143 | 36,60714 | 66,5 | 41,46429 | 38,67857 |
| Ded | |||||
| T 0 | 24 h | 7 jours | |||
| 5 ' | dix' | 5 ' | dix' | 5 ' dix' | |
| 6,649485 | 8.237113 | 5.463918 | 5.731959 | 7.835052 | 7,85567 |
| 6,845361 | 8,360825 | 5.257732 | 5.989691 | 8 | 7.938144 |
| Derme | |||||
| À | 24 h | 7 jours | |||
| dix' | 5 ' | dix' | 5 ' | dix' | |
| 1.690909 | 2,77193 | 0.293898 | 0.786704 | 2.880952 | 2.869048 |
| 1.736364 | 2.830409 | 0.306351 | 0.814404 | 2.940476 2.928571 | |
Tableau 2. Plage de valeurs exprimées en DO / gr pour un Répliquer biologique. Les valeurs de la viabilité des cellules de tissus de la peau, Ded et derme évalué à temps de démarrage et après ventilation mécanique aux temps indiqués. Les résultats sont représentatifs d'une expérience faite en double et exprimée en rapport entre la densité optique (DO) et en grammes (g) de tissu.
| Spécimen | désagrégation Temps |
| des tissus cutanés | 5 min |
| Ded | 1 minute |
| Derma | 2 min |
Tableau 3. Représentation schématique du meilleur temps de désagrégation de maintenir une bonne viabilité cellulaire dans Différént Tissue Samples. Peau, Ded et des échantillons de tissus Derme montrent la viabilité cellulaire optimale après 5, 1 et 2 min de désagrégation, respectivement.
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Discussion
Cette étude préliminaire a montré que les micro-greffes obtenus par ce protocole peuvent être combinés avec des éponges de collagène, comme déjà signalé dans d' autres applications cliniques, afin d' optimiser l'efficacité des micro-greffes d' implants 9, 10. En particulier, cette étude a rapporté la capacité de bio -complexes, constitué par des micro-greffes et les éponges de collagène, de l'adjuvant de cicatrisation d'une lésion de la jambe après 30 jours de l'application clinique. En outre, les résultats in vitro fournissent des preuves quant à l'efficacité de ce protocole à désagréger trois tissus cutanés différents, le maintien d' une viabilité cellulaire sensible à la fois immédiatement après la désagrégation mécanique et également après 24 heures et 7 jours de culture.
Le maintien de la viabilité cellulaire après ce type d'homogénéisation permet d'obtenir des micro-greffes autologues une seule étape stérile, ce qui évite une manipulation extensive. Cette preuve est en accordavec d' autres documents récents dans lesquels l'efficacité de ce protocole in vitro a été testé aussi dans d' autres types de tissus, y compris le périoste, la biopsie des oreillettes cardiaques et muscle droit latéral du globe oculaire 5. En particulier, nous avons observé dans des échantillons de derme DED et une viabilité cellulaire accrue après 7 jours de culture, probablement en raison de l'utilisation d'un milieu supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 10%.
En plus du maintien de la viabilité cellulaire, ce système est sûr et facile à utiliser et, en quelques minutes est capable de dissocier mécaniquement les différents types de tissus qui empêchent la destruction des structures cellulaires, par rapport aux méthodes traditionnelles d'isolement des cellules, telles que enzymatiques la digestion qui nécessitent plus de temps d'exécution. En outre, ce système est en mesure de sélectionner des cellules avec une coupure de 50 microns et cet aspect est très important compte tenu du succès des micro-greffes injectables, car cette gamme comprendcellules capables de se différencier en de nombreux types de cellules et ensuite améliorer la réparation des lésions progénitrices. Ce protocole nous permet non seulement d'obtenir des micro-greffes viables mais aussi autologues, étant donné que le sujet donneur est également l'accepteur de ces micro-greffes. La capacité de ce système pour obtenir des micro-greffes autologues a été spécialement signalé dans le domaine de la dentisterie où il a été montré que la transplantation autologue de cellules souches dentaires de pâte à papier (DPSC) dans un non contenu défaut infraosseuse a contribué à la réparation parodontale et la régénération des atrophique Maxilla 5,6. La capacité de ces micro-greffes pour améliorer le processus de cicatrisation a également été rapporté précédemment dans la gestion des plaies complexes après des interventions chirurgicales ou des complications 4.
Un autre avantage de l'utilisation de la greffe autologue prête à l'emploi de micro-greffes est certainement le maintien de conditions stériles en vue de leur implantation ultérieure sur les lésions cutanées.
En conclusion, le protocole décrit dans le présent document a montré la capacité de créer un tissu de micro-greffe humaine prête à l' emploi en intervention clinique pour améliorer la cicatrisation des plaies cutanées aigus / chroniques, telles que celles indiquées dans la présente étude. Les résultats in vitro sur la possibilité de créer des micro-greffes viables ont également été signalés, et ce paramètre est certainement important d'augmenter le pourcentage de réussite dans la réparation des tissus. Pris ensemble, les données ont montré que ce nouveau système pourrait être considéré comme un outil prometteur pour les cliniciens qui ont besoin d'un instrument rapide et sûr dans la gestion des plaies de la peau.
À l'heure actuelle, il n'y a pas de modifications ou de limitations particulières pour le protocole dans cette application spécifique, étant donné que la peau représente un tissu facile à utiliser et dans d' autres études , nous avons signalé l'efficacité du même protocole dans différentes lésions cutanées 6,7
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Disclosures
L'auteur Antonio Graziano est le directeur scientifique du cerveau humain vague srl qui produit et commercialise le système Rigenera. L'auteur Letizia Trovato est un collaborateur de la division scientifique du cerveau humain Vague srl
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Federica Zanzottera pour contribuer à l'étude d'effectuer une analyse de cytométrie en flux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rigenera Machine | Human Brain Wave | 79210R | |
| Rigeneracons | Human Brain Wave | 79450S | |
| MTT | Roche Diagnostic GmbH | 11465007001 | |
| RPMI medium | PBI International | 733-2292 | |
| DMEM medium | PBI International | F 0415 | |
| Antibiotics | Biological Industries PBI | 03-038-1 | |
| Antibodies for FACS Analysis | eBiosciences | code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349 for CD34-APC | |
| Columbia agar | BioMerieux Company | 43041 | |
| Condress® | Abiogen Pharma | collagen sponge used for bio-complexes | |
| DMSO | Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL | ||
| NaCl solution | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany | ||
| Xylene | Carlo Erba |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
- Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
- Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
- Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18 (2), 59-70 (2001).
- Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. , (2015).
- Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4 (4), 268-274 (2014).
- Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1 (3), 3 (2014).
- Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34 (3), s27-s33 (2014).
- Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1 (2), 20 (2013).
- Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17 (5), 644-647 (2013).
- Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).
