Summary
Il protocollo descrive un nuovo metodo per disaggregare tessuti umani e per creare autologhe micro-innesti che, combinato con spugne di collagene, danno origine a umani bio-complessi pronti all'uso nel trattamento delle lesioni cutanee. Inoltre, questo sistema mantiene la vitalità cellulare di micro-innesti in tempi diversi dopo disgregazione meccanica.
Abstract
Diversi nuovi metodi sono stati sviluppati nel campo della biotecnologia per ottenere sospensioni cellulari autologhi durante l'intervento chirurgico, per fornire uno step trattamenti per le lesioni cutanee acute e croniche. Inoltre, la gestione di ferite acute croniche, ma anche derivanti da traumi, diabete, infezioni ed altre cause, rimane difficile. In questo studio si descrive un nuovo metodo per creare autologhe micro-innesti di tessuto cutaneo di un singolo paziente e la sua applicazione clinica. Inoltre, è stata anche effettuata in vitro caratterizzazione biologica dei tessuti cutanei derivati da pelle, derma de-epidermized (DED) e derma della multi-organo e / o donatori multi-tessuto. Tutti i tessuti sono stati disaggregati per questo nuovo protocollo, che consente di ottenere vitali micro-innesti. In particolare, abbiamo riportato che questo protocollo innovativa è in grado di creare bio-complessi composti da autologhi micro-innesti e spugne di collagene pronto per essere applicato su lesioni cutanee. il Cliniè stato anche riferito applicazione cal di autologhe bio-complessi su una lesione gamba, con un miglioramento di entrambi processo di re-epitalization e la morbidezza della lesione. Inoltre, il nostro modello in vitro hanno mostrato che la vitalità cellulare dopo disgregazione meccanica con questo sistema si mantiene nel tempo fino a sette (7) giorni di coltura. Abbiamo anche osservato, mediante citometria a flusso di analisi, che il pool di cellule ottenute da disaggregazione è composto da diversi tipi di cellule, comprese le cellule staminali mesenchimali, che esercitano un ruolo chiave nei processi di rigenerazione e riparazione dei tessuti, per il loro elevato potenziale rigenerativo. Infine, abbiamo dimostrato in vitro che questa procedura mantiene la sterilità dei micro-innesti quando coltivate in piatti Agar. In sintesi, si può concludere che questo nuovo approccio rigenerativo può essere uno strumento promettente per i medici di ottenere in un unico passaggio praticabile, sterile e pronta all'uso micro-innesti che possono essere applicati solo o in combinazione con più Scaffo biologica comuneLDS.
Introduction
Negli ultimi anni, numerosi nuovi metodi sono stati sviluppati nel campo della biotecnologia per ottenere sospensioni cellulari autologhi durante l'intervento chirurgico per fornire trattamenti di uno stadio per le lesioni cutanee acute e croniche. Inoltre, la gestione di ferite acute, ma soprattutto croniche derivanti da traumi, diabete, infezioni, e altre cause, rimane difficile. Ci sono prove di montaggio che le ferite croniche sono diventate un grave problema di salute globale, causando un onere finanziario enorme sui sistemi sanitari in tutto il mondo 1.
Per aumentare il tasso di successo nel trattamento di lesioni cutanee, l'assenza di una vasta manipolazione (comprese enhancement cellulare) e il mantenimento di condizioni di sterilità sono essenziali, per creare una sospensione cellulare che può essere immediatamente applicato sulla zona danneggiata del pazienti, evitando così un trattamento più lungo in camere bianche, come Cell Factories. StArting da piccole biopsie cutanee, molatura, centrifugazione e altri metodi di separazione (ad esempio, enzimatico o meccanico), sono frequentemente utilizzati per ottenere una sospensione cellulare, che possono essere coltivate in un mezzo di crescita. Tutti questi metodi generalmente richiedono un lungo tempo di esecuzione, sottolineando le strutture cellulari, e portando ad una riduzione della vitalità cellulare. Un altro aspetto significativo è quello di ottenere una sospensione cellulare autologo pronto per essere utilizzato dai clinici, per esempio, per riparare le aree danneggiate. Inoltre, è ben noto che gli innesti di tessuti autologhi sopravvivono le procedure di trasferimento di sopravvivere alla fine nel sito ricevente dai principi di induzione e di conduzione 2, 3. L'innesto di tessuto ideale dovrebbe essere prontamente disponibili e hanno una bassa antigenicità e donatore sito morbidità 4.
Sulla base di queste evidenze, il primo obiettivo di questo studio era quello di creare bio-complessi autologhe adattiapplicazione clinica nella riparazione tissutale. A questo scopo, si descrive un nuovo metodo per ottenere autologhe micro-innesti a partire da tessuti cutanei che sono stati disaggregati per questo protocollo. Una presentazione caso è anche qui descritto come una applicazione clinica di autologhi micro-innesti ottenuti con questo protocollo, in combinazione con le spugne di collagene. Questo approccio è già stato segnalato per essere efficace nella disgregazione meccanica di tessuti umani 5 ed è stato usato in clinica per innesti e rigenerazione dei tessuti dermici 6,7 nonché per terapie rigenerative dei tessuti connettivi in chirurgia orale-maxillofacciale 8-10 .
Inoltre, il secondo obiettivo di questo studio era la caratterizzazione biologica dei tessuti cutanei dopo loro suddivisione per questo protocollo. A questo scopo, diversi campioni omologhi di tessuto cutaneo derivate dalla zona tronco di diversa multiorganoe / o donatori multi-tessuto sono stati elaborati seguendo norme nazionali in materia di raccolta, elaborazione e distribuzione dei tessuti per i trapianti (CNT 2013) in pelle Emilia Romagna Regional Bank.
CASE PRESENTAZIONE:
A 35-year-old paziente che mostra un trauma complesso a causa di incidente stradale è stato ammesso al reparto di terapia intensiva di Ancona Hospital. Il paziente ha mostrato un'infezione sulla gamba a causa di una ferita aperta e una frattura scomposta stabilizzato con fissazione esterna. Due debridement radicale sono state effettuate e quando la ferita è diventato pulito dopo la terapia a pressione negativa (terapia VAC) e il periostio è apparso in buona salute, abbiamo applicato il protocollo dopo due mesi dalla ripresa. Dopo disaggregazione con questo sistema, i micro-innesti ottenuti sono stati usati per creare bio-complessi con una spugna di collagene che sono stati successivamente impiantato per investigare l'efficacia sulla riparazione della lesione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dichiarazione etica: dal momento che l'applicazione clinica del protocollo richiede l'utilizzo di tessuto autologo cutanea del paziente, la sua caratterizzazione in vitro è stata effettuata prima dell'uso clinico su tessuto cutaneo omologo presso la Banca della pelle Emilia Romagna Regione seguendo le linee guida di una normativa nazionale sulla raccolta, il trattamento e la distribuzione di tessuti per i trapianti (CNT 2013).
1. Costruzione Bio-complesso per l'applicazione clinica
NOTA: Questo protocollo è clinicamente basa sull'uso di Rigeneracons (disgregatori tessuto) e il Rigenera macchina (sistema disgregatore tessuto) (Figura 1A). Il disgregatore tessuto è un disgregatore medica biologica dei tessuti umani in grado di interrompere piccoli pezzi di tessuto utilizzando una griglia fornita da lame esagonali e celle filtranti e componenti di matrice extracellulare con un cut-off di circa 50 micron.
- Raccogliere skinsamples del paziente attraverso un biopsy punzone (Figura 1B) e disaggregare l'aggiunta di 1 ml di soluzione fisiologica per ogni pezzo di ottenere autologhe micro-innesti 6,7,9 (o vedere passo 2.1).
- Mettere 1 ml di micro-innesti su spugne di collagene (Figura 1C) toform bio-complessi da utilizzare per l'applicazione clinica.
- Culture altre 1 ml di micro-innesti su spugne di collagene in presenza di 6 ml di terreno DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino a 37 ° C in atmosfera umidificata CO 2 5%.
- Dopo 3 giorni di cultura, fissare i bio-complessi con 0,3% paraformaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente. Versare la paraffina con uno specifico erogatore direttamente sul campione. Ottenere fette con un microtomo con uno spessore di 5 micron e mettere direttamente in un vetro scorrevole.
- Immergere le fette di paraffina 5 micron in un bicchiere per le analisi istologiche, contenente 15 - 20 ml di xilene (disponibile in commercio - un mix di m-xilene (40 - 65%), p-xilene (20%), o-xilene (20% ) e ethyl benzene (6 - 20%) e tracce di toluene, trimetil benzene, fenolo, tiofene, piridina e acido solfidrico) per 3 minuti ciascuno.
- Immergere le fette in gradi decreasing (100% al 70%) di etanolo (100% di etanolo per 1 ora, 95% di etanolo per 1 ora, 80% di etanolo per 1 ora, etanolo al 70% per 1 ora) e poi acqua deionizzata per de-paraffinizing e reidratante sezioni.
- Macchiare le sezioni con 1 - 2 ml di 1 g / L Ematoxylin per 1 - 2 min e successivamente sciacquare con acqua per rimuovere eventuali eccedenze Ematoxylin.
- Macchiare le sezioni per 4-5 minuti con soluzione alcolica Eosina Y all'1% della concentrazione mescolato con etanolo al 70% e diluito in acqua.
- Utilizzare 1 - 2 ml di eosina Y per ogni sezione vetrino e sciacquare sotto acqua corrente.
- Immergere le sezioni in aumento gradi di etanolo (vedi punto 1.6) e, infine, dopo un passaggio in xilene per 1h, vetrino con una base di montaggio mediumand osservare al microscopio ottico a ingrandimento 100X (Figura 1D). </ Ol>
- Utilizzando un dermatome, prendere il tessuto indipendenti pelle, papillari de-epidermized derma (Ded) o derma reticolare (derma) rispettivamente di 0,6 mm, 1 mm o 2 mm di spessore dalla zona tronco di 4 differenti multi-organo e / o multi donatori di tessuti in un range da 40 a 55 anni, a seguito di norme nazionali in materia di raccolta, elaborazione e distribuzione dei tessuti per i trapianti (CNT 2013).
- Lavare delicatamente tutti i campioni di 0,9% soluzione di NaCl metterli in un piatto su un agitatore orbitale per 5 min.
- Utilizzando la biopsia del punzone 5 mm, creare campioni che sono uniformi di diametro dal tessuto della pelle, Ded e derma e pesano tutti i campioni di tessuto prima della disaggregazione.
- Inserire otto, tre o quattro campioni uniformi tessuto cutaneo, Ded o derma rispettivamente, nel disgregatore tessuti, aggiungendo 1,5 ml di soluzione salina per la disaggregazione.
- eseguire diversotempi di disaggregazione per tutti i campioni di tessuto come indicato nella Tabella 1.
- Utilizzare un numero corrispondente di biopsie derivati da campioni di tessuto intatti come controlli.
- Dopo disaggregazione meccanica, aspirare la soluzione salina contenente micro-innesti e luogo separatamente ogni campione in un unico pozzetto di una 12-pozzetti. Eseguire lo stesso protocollo per il controllo intatto biopsie.
- Aggiungere 1 ml di RPMI 1640 medium integrato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e antibiotici per ogni campione.
- Valutare immediatamente la vitalità cellulare. Per ciascun pozzetto contenente un micro-graft (ottenuti rispettivamente dal disaggregazione simultanea di otto, tre o quattro campioni uniformi tessuto cutaneo, Ded o derma) aggiungere 1 ml di mezzo contenente 0,5 mg / ml di MTT (3- [4,5- -il dimethylthiazol-2] bromide) soluzione -2,5 diphenyltetrazolium e incubare per 3 ore a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2 / aria. Eseguire lo stesso protocollo per il controllo intattopugno biopsie.
- Dopo l'incubazione, rimuovere tutto terreno contenente MTT e aggiungere a ciascun campione 1 ml dimetilsolfossido (DMSO) per 10 min.
- Trasferire ciascun campione e DMSO in una cuvetta e leggere alla densità ottica (OD) a 570 nm con uno spettrofotometro. Calcolare la vitalità cellulare come il rapporto di assorbanza a 570 nm e il peso in grammi (gr) di tessuto utilizzati prima disaggregazione. Eseguire lo stesso protocollo per il controllo intatto biopsie.
- Dopo disaggregazione meccanica, aspirare la soluzione salina contenente micro-trapianto derivato dal tessuto della pelle, i campioni Ded e derma di un singolo donatore.
- Posizionare separatamente ogni campione in un singolo pozzetto di una piastra 12 pozzetti o in un pallone di coltura per il test di vitalità cellulare e l'analisi morfologica rispettivamente.
- Culture micro-innesti aggiunta di 1 ml (12-pozzetti) o 5 ml (pallone di coltura) di terreno RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e antibiotici a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2 / aiR per 24 ore o 7 giorni.
- Valutare la vitalità cellulare dopo 24 ore o 7 giorni (ripetere i punti 2.1.8-2.1.10).
- Eseguire analisi morfologica valutare la presenza di sospensione cellulare mediante microscopia ottica dopo 24 ore e 7 giorni di coltura in pallone.
- Analizzare i campioni di derma per positività al mesenchimali e marcatori di cellule ematopoietiche, tra cui CD146, CD34 e CD45 antigeni mediante analisi FACS 6.
- Sotto laminare seme cappa a flusso ogni micro-graft (ottenuto dalla disaggregazione simultanea di otto, tre o quattro campioni uniformi tessuto cutaneo rispettivamente Ded o derma) e un corrispondente piccolo frammento di ogni campione di tessuto non totalmente disaggregata (> 50 micron di dimensione dopo il processo di disaggregazione) su Columbia piastra di agar contenente il 5% di brodo sangue di pecora 100 l.
- Incubare la piastra a 37 ° C per tre giorni ed eseguire analisi microbiologiche di Columbia piastra di agar per valutare la sterilità 11.
2. Raccolta, disaggregazione e L'analisi in vitro dei tessuti
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In questo studio preliminare, il primo obiettivo era indagare la capacità delle umane autologhe micro-innesti combinati con un supporto biologico, come il collagene, per produrre bio-complessi pronti all'uso. Questi bio-complessi sono stati impiantati in un paziente con una lesione gamba causata da un incidente stradale (Figura 2A) e una completa riepitelizzazione associato riparazione dei tessuti dopo 30 giorni (Figura 2B) è stato osservato. Inoltre, il follow-up clinico ha dimostrato una buona consistenza e la morbidezza della zona danneggiata dopo 5 mesi (Figura 2C). In parallelo alle applicazioni cliniche, studi in vitro sono stati eseguiti anche per valutare la vitalità delle cellule di diversi tessuti cutanei come il tessuto della pelle , Ded e derma prima e dopo disaggregazione da questo sistema. In particolare, tenendo conto del diverso spessore di ogni tipo di tessuto, la soglia di otto,quattro e tre biopsie che possono essere elaborati in un unico passaggio per il tessuto della pelle, Ded e derma, rispettivamente, è stato fondato. Il numero stabilito di biopsie sono stati poi disaggregati a quattro tempi diversi come indicato nella Tabella 1, in base alle loro caratteristiche biologiche per identificare la condizione ottimale di disaggregazione di mantenere una buona vitalità cellulare.
Sebbene il trattamento tessuto stesso inevitabilmente indotto una riduzione della vitalità cellulare rispetto al tessuto intatto, la disaggregazione meccanica eseguiti con questo sistema sembra mantenere un valore medio di vitalità cellulare del 30% in tutti i campioni di pelle, Ded e derma valutato in tempi diversi (Figura 3a), rispetto al tessuto intatto (figura 3B) (media del 92 OD / gr per tessuto cutaneo intatto e 29 OD / gr dopo disaggregazione, dal 22 OD / gr per 7 OD / gr foR intatto DED rispetto alla disaggregazione e, infine, dal 16 OD / gr di 2,7 OD / gr per derma intatto rispetto alla disaggregazione). Così, questi risultati preliminari indicano che questo sistema è in grado di mantenere livelli apprezzabili di vitalità cellulare dopo disaggregazione immediata. L'effetto di disaggregazione sulla vitalità cellulare è stata studiata anche su campioni di tessuti in coltura per 24 hr o 7 giorni e risultati variabili sono stati osservati. In particolare, senza sostanziale variazione della vitalità cellulare in campioni di tessuto cutaneo è risultata indipendente dal tempo di omogeneizzazione e cultura rispetto al tempo di avviamento (T 0) (Figura 4A). D'altra parte, una ridotta vitalità dei campioni Ded dopo 24 ore di coltura rispetto al tempo di avviamento (T 0) è stato osservato ma sorprendentemente la vitalità cellulare è stata ripristinata dopo 7 giorni di coltura (Figura 4B). Risultati simili sono stati osservati anche per i campioni di derma (Figura 4C). Ciascun campione è stato valutato in duplicato e valori riportati in Tabella 2.
Sulla base di questi risultati, abbiamo identificato il tempo adatto di disaggregazione per mantenere la vitalità cellulare per tre tipi di tessuto cutaneo come riportato in Tabella 3. Oltre ai vitalità cellulare, è stata valutata anche l'aspetto morfologico della sospensione cellulare in coltura, identificando le singole cellule dopo 24 ore dalla disaggregazione del tessuto, mentre sono stati osservati dopo 7 giorni lì residui di fibre sia in tessuto cutaneo e campioni Ded / derma (Figura 5 AB). Inoltre, una caratterizzazione cellulare mediante citometria a flusso analisi è stata eseguita su un campione di derma dopo la sua omogeneizzazione: un pool eterogeneo di cellule composte da vari tipi cellulari, comprese le cellule endoteliali e cellule staminali mesenchimali è stato identificato (Figura 6). Inoltre, l'assenza di crescita batterica è stato identificato i n tutti i campioni disaggregati opportunamente seminate su piatti Agar, evidenziando la sterilità della procedura sperimentale (Figura 7).
Figura 1. Bio-complessi Tissue edifici che distruggono il sistema (A) e raccolta di un piccolo pezzo di Derma dalla zona Lesione del paziente che è stata successivamente disaggregati con Disgregatori tessuto. I bio-complessi sono stati ottenuti combinando i micro-innesti su spugne di collagene per ottenere patch umani pronti per l'uso per la riparazione della lesione (C). (D) ematossilina e eosina (H & e) colorazione di un rappresentante bio-complesso coltura per tre giorni in terreno DMEM e osservato alla microscopia clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.
Figura 2. Applicazione Bio-complessi sulla gamba Lesione I bio-complessi composti da collagene e micro-innesti ottenuti dal paziente fosse applicato sulla lesione gamba (A) e la ferita è stata valutata dopo 30 giorni (B) e 5 mesi (C ). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. C ell Viabilità Subito dopo disaggregazione in diversi momenti della tre tipi di tessuti cutanei (A) rispetto al Intact cutanei tessuti (B). La pelle, Ded e derma tessuti derivati da quattro diversi donatori sono stati disaggregati con disru tessutoptors come indicato in apposita sezione nel testo. La vitalità cellulare è stata valutata mediante test MTT eseguito in duplicato per ciascun campione di tessuto. Il grafico rappresentativa quattro diversi esperimenti condotti in duplicato per ciascun campione. I risultati sono espressi come rapporto tra la densità ottica (OD) e grammi (gr) di tessuto; la deviazione standard è stata calcolata dal rapporto tra densità ottica (OD) e grammi (gr) di tessuto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Livelli Figura 4. C ell vitalità di un campione disaggregata dei tessuti cutanei (A), Ded (B) e il derma (C) per l'avvio di tempo (t 0) e dopo Subculture per 24 ore e 7 giorni. I tessuti sono stati omogeneizzati con i tessuti interferenti come indicaTE nella sezione appropriata nel testo. I campioni erano disaggregati successivamente coltivate per 24 ore e 7 giorni dopo la disaggregazione e mantenute in terreno RPMI 1640 supplementato con siero fetale bovino al 10% e antibiotici a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO2 / aria. La vitalità cellulare è stata valutata mediante MTT come precedentemente descritto. Il grafico è rappresentativo di un esperimento eseguito in duplicato per ciascun campione di tessuto cutaneo, Ded e derma derivato da un singolo donatore. I risultati sono espressi come rapporto tra la densità ottica (OD) e grammi (gr) di tessuto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Analisi morfologica di scomposizione in tessuto cutaneo (A) e Ded / derma (B) dopo 24 ore e 7 giorni su Cult ure. L'analisi morfologica è stata effettuata utilizzando un microscopio ottico dopo 24 ore e 7 giorni di coltura in presenza di terreno RPMI sul tessuto cutaneo e Ded / tessuti del derma. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. cellulare Caratterizzazione citometria a flusso. Dopo la disgregazione meccanica, micro-innesti ottenuti dal derma sono stati messi in coltura e dopo 7 giorni sono stati analizzati per la positività al mesenchimali e marker delle cellule ematopoietiche, compresi gli antigeni CD146, CD34 e CD45. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
les / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg "/>
Figura 7. Analisi microbiologiche di scomposizione in tessuto cutaneo, Ded e derma Campioni. I piccoli frammenti di campioni di tessuto disaggregati sono state seminate su Columbia agar aggiunto del 5% di sangue di montone (BioMerieux Company) sotto cappa a flusso laminare e incubata a 37 ° C per tre giorni a eseguire l'analisi microbiologica e valutare la sterilità del procedimento. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Campioni di tessuto | DISAGGREGAZIONE TIMES (sec / min) |
| Pelle | 30 sec |
| 1 minuto | |
| 2 min | |
| 5 minuti | |
| Ded | 1 minuto |
| 2 min | |
| 5 minuti | |
| 10 minuti | |
| derma | 1 minuto |
| 2 min | |
| 5 minuti | |
| 10 minuti |
Tabella 1. rappresentazione schematica dei Quattro tempi diversi utilizzati per la disaggregazione della pelle, Ded e derma. Otto, quattro e tre biopsie di pelle, Ded e derma, rispettivamente, sono stati disaggregati in quattro momenti diversi, a seconda delle loro caratteristiche biologiche.
| tessuto cutaneo | |||||
| A | 24 ore | 7 giorni | |||
| 2 ' | 5 ' | 2 ' | 5 ' | 2 ' | 5 ' |
| 37.1 | 41,07,143 mila | 41,07,143 mila | 65,78,571 mila | 41,14,286 mila | 37,42,857 mila |
| 35.8 | 43,82,143 mila | 36,60,714 mila | 66.5 | 41,46,429 mila | 38,67,857 mila |
| Ded | |||||
| T 0 | 24 ore | 7 giorni | |||
| 5 ' | 10 ' | 5 ' | 10 ' | 5 ' 10 ' | |
| 6,649485 | 8.237113 | 5.463918 | 5.731959 | 7.835052 | 7,85,567 mila |
| 6,845361 | 8,360825 | 5.257732 | 5.989691 | 8 | 7.938144 |
| derma | |||||
| A | 24 ore | 7 giorni | |||
| 10 ' | 5 ' | 10 ' | 5 ' | 10 ' | |
| 1.690909 | 2,77,193 mila | 0.293898 | 0.786704 | 2.880952 | 2.869048 |
| 1.736364 | 2.830409 | 0.306351 | 0.814404 | 2.940476 2.928571 | |
Tabella 2. Intervallo di valori espressi in OD / gr per un replicato biologica. I valori di vitalità cellulare dal tessuto della pelle, Ded e derma valutata per ora di inizio e dopo disaggregazione meccanica per tempi indicati. I risultati sono rappresentativi di un esperimento eseguito in duplicato ed espressa come rapporto tra la densità ottica (OD) e in grammi (gr) di tessuto.
| Campione | La disaggregazione Tempo |
| tessuto cutaneo | 5 minuti |
| Ded | 1 minuto |
| derma | 2 min |
Tabella 3. Rappresentazione schematica del miglior tempo di disaggregazione per mantenere una buona vitalità cellulare in different tessuto Campioni. pelle, Ded e campioni di tessuto Derma mostrano la vitalità cellulare ottimale dopo 5, 1 e 2 min di disaggregazione, rispettivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo studio preliminare ha mostrato che micro-innesti ottenuti con tale protocollo possono essere combinate con le spugne di collagene, come già riportato in altre applicazioni cliniche, per ottimizzare l'efficacia delle protesi micro-innesti 9, 10. In particolare, questo studio ha riportato la capacità di bio -complessi, costituito da micro-innesti e spugne di collagene, per adiuvante la cicatrizzazione della lesione gamba dopo 30 giorni dalla applicazione clinica. Inoltre, i risultati in vitro forniscono evidenze circa l'efficacia di questo protocollo per disaggregare tre diversi tessuti cutanei, il mantenimento di un apprezzabile vitalità cellulare sia immediatamente dopo la disaggregazione meccanica e anche dopo 24 ore e 7 giorni di coltura.
Il mantenimento della vitalità cellulare dopo questo tipo di omogeneizzazione permette di ottenere in un unico passaggio sterili autologhi micro-innesti, evitando vasta manipolazione. Questa prova è in accordocon altri lavori recenti, in cui l'efficacia di questo protocollo in vitro, è stato testato anche in altri tipi di tessuti, tra cui periostio, la biopsia di atri cardiaco e muscolo retto laterale del bulbo oculare 5. In particolare, abbiamo osservato nei campioni Ded e derma una maggiore vitalità cellulare dopo 7 giorni di coltura, probabilmente a causa dell'uso di un mezzo supplementato con 10% di siero fetale bovino.
Oltre al mantenimento della vitalità cellulare, questo sistema è sicuro e facile da usare e in pochi minuti è in grado di disaggregare meccanicamente diversi tipi di tessuti impedendo la rottura delle strutture cellulari, rispetto ai metodi tradizionali di isolamento cellulare, come enzimatica digestione che richiedono più tempo di esecuzione. Inoltre, questo sistema è in grado di selezionare le celle con un cut-off di 50 micron e questo aspetto è molto importante in considerazione del successo di iniettabili micro-innesti, perché questa gamma comprendecellule progenitrici capaci di differenziarsi in molti tipi di cellule e quindi migliorare la riparazione della lesione. Questo protocollo permette non solo di ottenere valide ma anche autologhi micro-innesti, dato che il soggetto donatore è anche l'accettore di tali micro-innesti. La capacità di questo sistema per ottenere autologhe micro-innesti stato particolarmente segnalato nel campo odontoiatrico dove è stato dimostrato che il trapianto di cellule staminali autologhe Dental Pulp (DPSCs) in un non conteneva difetto infraossei contribuito alla riparazione e rigenerazione parodontale di atrofica mascella 5,6. La capacità di queste micro-innesti per migliorare il processo di cicatrizzazione è stato anche riportato in precedenza nella gestione di ferite complesse dopo interventi chirurgici o complicazioni 4.
Un altro vantaggio dell'uso dei autologo e pronto all'uso micro-innesti è certamente il mantenimento di condizioni di sterilità in vista del loro successivo impianto sulle lesioni cutanee.
In conclusione, il protocollo descritto in questo documento ha mostrato la capacità di creare tessuto micro-graft umana pronti all'uso intervento clinico per migliorare la guarigione delle ferite cutanee acute / croniche, come quelle indicate in questo studio. Risultati in vitro sulla possibilità di creare vitali micro-innesti sono stati riportati anche e questo parametro è certamente significativo per aumentare la percentuale di successo nella riparazione dei tessuti. Presi insieme, i dati hanno mostrato che questo nuovo sistema potrebbe essere considerato uno strumento promettente per i medici che hanno bisogno di uno strumento di rapida e sicura nella gestione di ferite cutanee.
Al momento, non ci sono particolari modifiche o limitazioni per il protocollo in questa specifica applicazione, dato che la pelle rappresenta un tessuto facile da usare e in altri studi abbiamo riportato l'efficacia dello stesso protocollo in diverse lesioni cutanee 6,7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L'autore Antonio Graziano è il Direttore Scientifico di Human Brain Wave srl che produce e commercializza il sistema Rigenera. L'autore Letizia Trovato è un collaboratore della Divisione Scientifica di Human Brain Wave srl
Acknowledgments
Gli autori desiderano grazie Dr. Federica Zanzottera per contribuire allo studio di eseguire analisi di citometria a flusso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rigenera Machine | Human Brain Wave | 79210R | |
| Rigeneracons | Human Brain Wave | 79450S | |
| MTT | Roche Diagnostic GmbH | 11465007001 | |
| RPMI medium | PBI International | 733-2292 | |
| DMEM medium | PBI International | F 0415 | |
| Antibiotics | Biological Industries PBI | 03-038-1 | |
| Antibodies for FACS Analysis | eBiosciences | code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349 for CD34-APC | |
| Columbia agar | BioMerieux Company | 43041 | |
| Condress® | Abiogen Pharma | collagen sponge used for bio-complexes | |
| DMSO | Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL | ||
| NaCl solution | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany | ||
| Xylene | Carlo Erba |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
- Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
- Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
- Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18 (2), 59-70 (2001).
- Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. , (2015).
- Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4 (4), 268-274 (2014).
- Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1 (3), 3 (2014).
- Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34 (3), s27-s33 (2014).
- Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1 (2), 20 (2013).
- Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17 (5), 644-647 (2013).
- Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).
