Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Summary

Ici, nous présentons un protocole de l'épuisement de l'ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d'une analyse d'immunofluorescence pour évaluer l'assemblage du fuseau méiotique et de l'organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l'appauvrissement de produits de transcription in vitro et l'évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes.

Abstract

Les erreurs de ségrégation des chromosomes lors de la division méiotique dans les gamètes peuvent entraîner une aneuploïdie qui est ensuite transmise à l’embryon lors de la fécondation. L’aneuploïdie qui en résulte chez les embryons en développement est reconnue comme une cause majeure de perte de grossesse et de malformations congénitales telles que le syndrome de Down. La ségrégation précise des chromosomes dépend de manière critique de la formation de l’appareil du fuseau des microtubules, mais ce processus reste mal compris chez les ovocytes de mammifères. Curieusement, l’assemblage du fuseau méiotique diffère de la mitose et est régulé, au moins en partie, par des centres d’organisation des microtubules uniques (MTOC). L’évaluation des protéines associées au MTOC peut fournir des informations précieuses sur les mécanismes de régulation qui régissent la formation et l’organisation du fuseau méiotique. Ici, nous décrivons des méthodes pour isoler les ovocytes de souris et épuiser les protéines associées au MTOC en utilisant une approche médiée par siRNA pour tester la fonction. De plus, nous décrivons les conditions de fixation des ovocytes et d’analyse d’immunofluorescence pour évaluer la formation et l’organisation du fuseau méiotique.

Introduction

La méiose est un processus de division unique qui se produit dans les gamètes (spermatozoïdes et les ovocytes) et comporte deux divisions successives sans intervenir la synthèse d'ADN à séparer les chromosomes homologues et des chromatides sœurs cours de la méiose et de la méiose-I-II, respectivement ^1. Erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la division de la méiose dans les ovocytes peuvent résulter de l'aneuploïdie, qui est héritée par l'embryon lors de la fécondation. Notamment, l'incidence de l'aneuploïdie dans les embryons en développement augmente avec l'âge de la mère et est une cause majeure de malformations con....

Protocol

Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université de Géorgie.

1. Préparatifs

1. Pour la culture de l'ovocyte, l'achat ou fraîchement préparer milieu essentiel minimal (MEM) et compléter avec 3 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) comme indiqué dans le tableau 1. Placez une bouteille de polystyrène sur une balance de chargement (de tare à zéro). Ajouter tous les réactifs, sauf BSA, dans l'ordre et faire apparaître le volume final avec MQ-eau en poids pour un total de 250 g. Puis ajouter le BSA, laisser dissoudre et stérilise....

Results

La micro-injection de siRNA offre une approche efficace pour la dégradation de l'ARNm et de protéine ultérieur épuisement dans des ovocytes, ce qui permet des tests fonctionnels efficace et hautement spécifique de différents facteurs cibles in vitro. Par la suite, l'immunofluorescence est utilisée pour l'analyse du phénotype spécifique, ainsi que pour valider protéine épuisement dans des ovocytes injectés de siARN. Dans l'exemple actuel, le marquage fluorescent des ovocytes individuels avec DAPI avec des antico.......

Discussion

Bien qu'il existe plusieurs méthodes pour le transfert d'acide nucléique exogène dans des cellules somatiques, telles que l'électroporation et la transfection, micro-injection est le procédé optimal pour la livraison de molécules d'ARN dans des ovocytes de souris transcriptionnellement quiescentes. Le protocole actuel fournit une approche efficace pour déplétion in vitro des ARNm spécifiques qui permettent des tests fonctionnels de la broche différente et / ou des facteurs de MTOC-associé dans l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
réactifs
Gonadotrophine sérique de jument enceinte (PMSG)	EMD Biosciences	367222
Minimal Essential Medium (MEM)			*Recette décrite dans le tableau 1
saline équilibrée Earle’s (10x)	Sigma	E-7510
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761
Acide pyruvique, sel de sodium  ;	Sigma	P-5280
Pénicilline G, sel de potassium	Sigma	P-7794
Sulfate de streptomycine  ;	Sigma	S-9137
L-Glutamine  ;	Sigma	G-8540
EDTA, sel disodique dihydraté	Sigma	E-4884
Acides aminés essentiels (50x)	Gibco  ;	11130-051
MEM Mélange de vitamines (100x)	Sigma	M-6895
Solution de rouge de phénol	Sigma	P-0290
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma	A1470
Milrinone	Sigma	M4659
Sérum de veau fœtal (FBS)	Hyclone	SH30070.01
EmbryoMax M2 Média avec Hepes	EMD Millipore	MR-015-D
ciblant Pericentrin	Qiagen	GS18541
les siRNAs de contrôle négatif  ;	Qiagen	SI03650318
Paraformaldéhyde (solution à 16 %)	Microscopie électronique Sciences	15710
Triton-X	Sigma	T-8787
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Hyclone	SH30028.02
Anti-Pericentrine (lapin)	Covance	PRB-432C
Anti-tubuline acétylée (souris)	Sigma	T-6793
Chèvre anti-rabbbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21430
Chèvre anti -souris Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-11017
Major Equipment
Stereomicroscope (SMZ 800)	Nikon
Upright Fluorescent Microscope	Leica Microsystems
Microscope inversé	Nikon
Système de micro-injections Femtojet
Micro-manipulateurs	Eppendorf
(femtotips)	de maintien 930000035		Eppendorf
(VacuTip)	Eppendorf	930001015
Plasticware de culture >
35 mm	Corning Life Sciences	351008
plaques 4 puits	Thermo Scientific	176740
Plaques 96 puits	Corning Life Sciences	3367
0,45 mm Système de filtration CA	Corning Life Sciences	430768