Summary
Her præsenterer vi en protokol for specifik siRNA-medieret mRNA udtømning efterfulgt af immunofluorescensanalyse at evaluere meiotisk spindel samling og organisation i museoocytter. Denne protokol er velegnet til in vitro-udtømning af udskrifter og funktionel vurdering af forskellige spindel og / eller MTOC-associerede faktorer i oocytter.
Introduction
Meiose er en unik division proces, der forekommer i gameter (oocytter og sæd) og involverer to på hinanden følgende opdelinger uden mellemliggende DNA-syntese at adskille homologe kromosomer og søsterchromatider under meiose-I og meiose-II, henholdsvis 1. Fejl i kromosom adskillelse under meiotiske deling i oocytter kan resultere i aneuploidi, som er arvet af fosteret under befrugtningen. Især forekomsten af aneuploidi i udviklingslandene embryoner stiger med fremrykkende moderens alder og er en væsentlig årsag til medfødte fødselsdefekter samt abort hos kvinder 1,2, således understreger et stort behov for at forstå den molekylære basis for aneuploidi i meiotiske deling .
Under celledeling, kromosom adskillelse er helt afhængig af samlingen af mikrotubuli spindel apparater og etablering af stabile kromosom-mikrotubuli interaktioner for korrekt fastgørelse til modsatte spindel denpoler. Vigtigere, meiotiske spindel dannelse i pattedyr oocytter adskiller sig fra mitosen i somatiske celler, og reguleres af unikke mikrotubulus-organisering centre (MTOCs) der mangler centrioler 3,4. Essentielle proteiner er nødvendige for mikrotubuli nukleering og organisering lokalisere til oocyt MTOCs, herunder γ-tubulin som katalyserer mikrotubulus-samling. Desuden pericentrin fungerer som en væsentlig stillads protein, som binder og ankre y-tubulin samt andre faktorer på MTOCs 5. Især vores undersøgelser viser, at udtømning af vigtige MTOC-associerede proteiner forstyrrer meiotisk spindel organisation og fører til kromosom segregation fejl i oocytter, som ikke er fuldt løst ved spindlen forsamling kontrolpunkt (SAC) 6,7. Derfor mangler i spindel stabilitet, der ikke udløser meiotisk anholdelse, udgør en betydelig risiko i at bidrage til aneuploidi. På trods af deres afgørende rolle i spindel samling og organisation, oocyt MTOC protEin sammensætning og funktion forbliver dårligt forstået.
Test af funktion af specifikke target proteiner i mammale oocytter er udfordrende, da cellerne bliver transkriptionelt hvilende kort før genoptagelsen af meiose 8,9. Derfor præovulatoriske oocytter afhængige maternale mRNA butikker for at genoptage meiose og støtte meiotiske deling samt de første spaltningsprodukter divisioner efter befrugtningen 10,11. Effekten af RNA-interferens (RNAi) medieret nedbrydning af mRNA-transkripter i mammale oocytter er veletableret og maternelle RNA'er rekrutteret til oversættelse under meiotisk modning er særligt modtagelige for siRNA rettet mod 12-14. Derfor mikroinjektion af korte interfererende RNA (siRNA'er) i oocyter giver en værdifuld tilgang til at udtømme mål mRNA til funktionel test.
Her beskriver vi fremgangsmåder til isolering af museoocytter og siRNA-medieret nedbrydning af specifikke transcriPTS for at teste funktionen af en væsentlig MTOC-associeret protein, pericentrin. Desuden beskriver vi immunofluorescensanalyse betingelser at evaluere meiotisk spindeldannelse i oocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of Georgia.
1. Forberedelser
- For oocyt kultur, køb eller forberede frisk Minimal Essential Medium (MEM) og supplerer med 3 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) som vist i tabel 1. Placer en polystyren flaske på en loading balance (tara til nul). Tilføj alle reagenser, undtagen BSA, i orden og opdrage det endelige volumen med MQ-vand efter vægt til i alt 250 g. Tilsæt derefter BSA, lad det opløse og Filtersteriliser.
Bemærk: Den beskrevne MEM-medium kræver ækvilibrering og celler inkubering med en medicinsk gasblanding af 5% CO2, 5% O2 og 90% N2. Imidlertid kan andre medier (f.eks CZB) anvendes som gør det muligt for celle inkubering i 5% CO2 under atmosfæriske betingelser. - For oocyt mikroinjektion, købe eller forberede M2 medium.
- Forbered pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) til en koncentration på 5 IU / 100 pi.
- Køb og rekonstruere siRNA lagre en arbejdsgruppe koncentration på 1 uM.
2. Mus ægudtagningen
- DAG 1: At stimulere æggestokkene follikeludvikling og øge antallet af præovulatoriske follikler, administrere 5 IU PMSG intraperitonealt til hunmus 48 timer før ægudtagningen.
- DAG 3: For ægudtagningen og kultur, der er oprettet 35 mm dyrkningsskåle med 3 ml MEM / BSA suppleret med 1 pg / ml milrinon. Denne phosphodiesteraseinhibitor fastholder oocytterne i profase-I anholdelse og forhindrer kimblære opdeling (GVBD). Ækvilibrering af dyrkningsskåle i en medicinsk gasblanding i mindst 15 min.
Bemærk: Milrinone suppleret medie kræves hele ægudtagning, samt oocyt mikroinjektion og 24 timers kultur hold perioden efter siRNA. - Hent æggestokke fra hunmus ved hjælp etableret laboratoriepraksis 15 og overføre til en ny kultur skål med forvarmet og afbalanceret MEM / BSA / milrinon.
- Placer dyrkningsskålen på scenen af et stereomikroskop for ægudtagningen. Release cumulus-oocyt-komplekser (COC s) ved manuelt at punktere de antrale hårsække med 27 g nåle. Sæt en æggestok til bunden af dyrkningsskålen, med en 27 G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte og bruge en anden nål til at punktere alle store follikler. Gentag for hver æggestok.
- Ved hjælp af standard munden pipettering procedurer eller andre midler til oocyt aspiration, indsamle alle oocyter der er omgivet af 2 eller flere lag af kompakte cumulusceller. Overfør COC til en ny skål og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Fjern forsigtigt de omgivende cumulus celler ved gentagen blid pipettering med en 1 ml pipette indstillet til en aspiration volumen på 750 pi. Gentag pipetteringstrin omkring 12 gangeog tillade oocytterne til at komme sig 5 min. Fortsæt på denne måde, indtil alle eller de fleste af de cumulusceller er blevet fjernet. Overfør blotlagte oocytter til en anden dyrkningsskål og lad det ækvilibrere ved 37 ° C i 15 minutter.
- Tildele de blotlagte oocytter i tre forsøgsgrupper, der skal anvendes til: (i) mikroinjektion af specifikke siRNA'er mod målet af interesse, (ii) mikroinjektion af uspecifikke (kontrol) siRNA'er og (iii) et ikke-injiceret kontrolgruppe til at redegøre for dyrkningsbetingelser.
3. oocyt Mikroinjektion
- Oprettet dyrkningsskåle med 3 ml M2 medium suppleret med milrinon (1 ug / ml) i oocyt mikroinjektion. Forbered dyrkningsskåle indeholdende MEM / BSA / milrinon til vask og efterfølgende dyrkning af injicerede oocytter.
Bemærk: M2 medium indeholder HEPES-puffer og kræver forvarmning ved 37 ° C i 15 minutter under atmosfæriske betingelser. MEM kræver pre-opvarmning og ligevægt ved hjælp medicinsk gas som beskriverd ovenfor. - Forbered mikroinjektion systemet. Indlæs kanylen med 5 pi 1 pM specifik siRNA løsning. Fastgør den bedrift pipette og kanyle til mikromanipulatorer af mikroinjektion systemet og konfigurere Injection Unit med kalibreret volumen og tryk.
- Placer en 200 pi mikro-dråbe M2 medier på indersiden af låget på en 3 cm dyrkningsskål og tilføj en oocyt for at oprette og tilpasning af mikroinjektion systemet.
- Brug af oocyt som en guide, justere positionerne af bedriften og injektionsnålene. Anvend negativt tryk på bedriften pipette til forsigtigt sikre oocytten og justere positionen af injektionsnålen i videst diameter af cellen. Juster indstillingerne for at tillade mikroinjektion af ca. 10 pl af opløsningen siRNA overalt i oocyt cytoplasmaet.
Figur 1. Oocyte mikroinjektion oprettet. ( - Retur låget til stereomikroskop fase og tilføje en 200 pi mikro-dråbe frisk M2 medier. Tilføj en gruppe af oocytter (~ 10) til mikro-drop gennem munden pipettering eller alternative metoder, derefter vende tilbage låget med mikro-drop til mikroinjektion scenen.
- Fortsæt til microinject de individuelle oocytter. Fastgør en oocyt med bedriften pipette, langsomt spidsen af kanylen ind i cytoplasmaet og udvise mængden af siRNA løsning injektion. Trække forsigtigt injektionsnålen og move den injicerede oocyt til en position ved bunden af mikro-drop. Flyt held injiceret oocytter til en position på toppen af mikro-drop.
- Gentag mikroinjektion proceduren med hver oocyt. For at bevare optimal oocyt levedygtighed, microinject kun et lille antal af oocytter ad gangen. Sikre, at denne proces ikke tager mere end et par minutter for at forhindre temperatur og pH ændringer i mikro-drop.
- Aspirer held injicerede oocytter eller forsigtigt flytte låget med mikro-drop af injicerede oocytter til stereomikroskop. Overfør de injicerede oocytter levedygtige gennem munden pipettering eller alternative metoder, at MEM / BSA / milrinon medium at vaske og ækvilibrere ved 37 ° C.
- Brug af en anden gruppe af oocytter, gentag mikroinjektion processen med en ny kanyle fyldt med ikke-specifikke siRNA'er for kontrolgruppen. Vask oocytterne i MEM / BSA / milrinon og overføres til en separat dyrkningsskål.
- Kultur alle grupper afoocytter i 24 timer i MEM / BSA / milrinon ved 37 ° C under en atmosfære af medicinsk gas.
Bemærk: Der er behov Den "milrinon blok 'kultur periode for effektiv target mRNA / protein udtynding.
4. oocyt Kultur for meiotiske Modning
- DAG 4: For hver eksperimentel gruppe af oocytter set-up 4 kultur retter (35 mm) med 3 ml MEM / BSA. Supplement et medie skål hver gruppe med 10% (høj kvalitet) kalvefosterserum (FBS) til brug for oocytmodning. Lad alle dyrkningsskåle at ækvilibrere ved 37 ° C med medicinsk gasblanding.
- For at frigøre oocytter fra "milrinon blok", sekventielt vaske oocytterne tre gange i skåle indeholdende MEM / BSA og derefter overføre oocytterne til modning skålen holdige medier med 10% FBS. Kultur alle oocyt grupper for 17 timer ved 37 ° C, for at muliggøre genoptagelse og progression af meiose.
- Dag 5: Forbered løsninger til oocyt FIXation, herunder: (i) 4% paraformaldehyd (PFA) i PEM-puffer (100 mM PIPES [pH 6,9], 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA) med 0,5% Triton-X 100, og (ii) PBS suppleret med 5 % FBS der vil blive anvendt til at vaske og blokere oocytterne.
Bemærk: Disse løsninger kræver forvarmning til 37 ° C før oocyt fiksering. - For oocyt fiksering (efter 17 timers kultur), hurtigt overføre hver forsøgsgruppe af oocytter gennem munden pipettering eller alternative metoder i individuelle brønde (i en 4-brønds skål) indeholdende 750 pi foropvarmede 4% PFA-opløsning og inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Efterfølgende vask hver gruppe af oocytter 3 gange (15 minutter hver) i 750 pi forvarmet PBS indeholdende 5% FBS.
- Blok oocytter i 200 pi PBS / 5% FBS O / N ved 4 ° C for at minimere uspecifik antistofbinding.
5. immunofluorescensanalyse
- Dag 6:
Bemærk: Immunofarvning sker i en multi-brønds plade og OOCytes serielt overført til sekventielle brønde, der indeholder respektive antistof og vaskeopløsninger. Enten 48 eller 96-brønds plader kan bruges, blot justere løsningen volumen baseret på godt størrelse. For 96-brøndsplader bruge 200 pi per brønd. Oocytter overføres til de forskellige løsninger i følgende rækkefølge: primært antistof løsning - 3 vaske brønde - sekundært antistof løsning - 3 vask brønde. For at begrænse lyseksponering pladen kan dækkes med folie.
Fremstilles frisk PBS / 5% FBS og bruge denne løsning til at fremstille antistoffortyndinger (f.eks kanin-anti-pericentrin (1 / 1.000), muse-anti-tubulin (1 / 1.000)). - Overfør de faste oocytter fra hver forsøgsgruppe til individuelle brønde indeholdende 200 pi (eller 100 pi, hvis der ønskes mindre volumen) af det primære antistof-opløsning og dække godt med parafilm. Inkuber ifølge optimale antistof-specifikke forhold (f.eks 37 ° C i 1 time eller 4 ° CO / N).
Bemærk: Primært antistof dilution samt specifikke inkubationstid og temperatur kræver afprøvning for at bestemme de optimale betingelser for forskellige anvendte antistoffer. - Efter inkubation med det primære antistof, vaskes oocytterne tre gange i PBS / 5% FBS (10-15 min hver).
- Overfør oocytterne i opløsningen indeholdende fluorescens-konjugerede sekundære antistoffer (f.eks 1 / 1.000 fortynding af anti-kanin- og anti-museantistoffer konjugeret med fluorochromer af forskellige bølgelængder). Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
- Vask oocytterne tre gange i PBS / 5% FBS (10 - 15 minutter hver).
- Efter slutvasketrin overføre oocytterne på en ren glasplade og forsigtigt aspireres eventuelt overskydende vaskeopløsning. Dette vil immobilisere oocytter på glasoverfladen. Tilføj 8 pi montering medier (indeholdende DAPI) og omhyggeligt overlay montering medier med en 22 mm x 22 mm dækglas. Sænk dækglasset langsomt for at undgå at fange luftbobler og / eller beskadige de oocytter.
Bemærk: Alternativt, for at opretholde de 3-dimensionelle egenskaber af oocytten for konfokal mikroskopi-analyse, tilsættes en lille volumen på 100 um glasperler (blandet med vaseline) til hjørnerne af dækglasset før montering på objektglasset. - Objektglas opbevares ved 4 ° C, eller til vurderingen af meiotisk progression samt analyse af ekspressionsniveauer og subcellulær lokalisering ved hjælp protein et fluorescensmikroskop udstyret med de nødvendige filtre, der passer til de sekundære antistoffer anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroinjektion af siRNA'er giver en effektiv metode til mRNA nedbrydning og efterfølgende protein udtynding i oocytter, der muliggør effektiv og meget specifik funktionel test af forskellige målgrupper faktorer in vitro. Efterfølgende immunofluorescens anvendes til særlige fænotype-analyse samt at validere protein udtynding i siRNA-injicerede oocytter. I den nuværende eksempel fluorescerende mærkning af individuelle oocytter med DAPI sammen med anti-tubulin og anti-pericentrin antistoffer aktiveret: (i) en bekræftelse af pericentrin udtømning samt (ii) en samlet vurdering af både kromatin og meiotisk spindel konfigurationer i kontrol og PCNT - udtømte oocytter.
Repræsentative immunofluorescens billeder af oocytter mikroinjiceret med ikke-specifik kontrol eller Pcnt siRNAs er vist i figur 2 7 Efter en 17 timers kultur, de fleste kontrol oocyter nåede metafase II-stag.e og indeholder organiseret meiotiske spindler med justeret kromosomer og lyse pericentrin mærkning ved de spindel poler (figur 2A). Især blev pericentrin ikke påvist i oocytter injiceret med Pcnt siRNA, bekræfter effektiv protein Knockdown i disse celler. Desuden ser de fleste af PCNT-forarmet oocytter forblev på metafase-I fase og udviser uorganiseret spindel strukturer med forskudte kromosomer (figur 2B). De få PCNT-udtømte oocytter, der skred til metafase-II også udstillet forstyrret spindler (Figur 2C).
Figur 2. Immunofluorescensanalyse af meiotisk spindel organisation i museoocytter Repræsentative billeder af oocytter injiceret med enten (a) Kontrollen uspecifikke siRNA'er eller med (B, C) specifikke Pcnt. -siRNA'er. Oocytter var dobbelt-mærket med anti-pericentrin (rød) sammen med et anti-acetyleret α-tubulin antistof til påvisning af mikrotubuli (grøn). DNA blev mærket med DAPI og er vist i blåt. Det indsatte viser en 2X forstørrelse af spindelpol området. Pile angiver misvisende kromosomer. * Spindel pol. PB: Første pollegeme. Målestokken på 10 um. Dette tal er blevet ændret fra Ma og Viveiros 2014 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Opskrift på Udarbejdelse af MEM. Oversigt over alle reagenser og specifikke beløb, der er nødvendige for at forberede 250 ml MEM. Medierne er filtersteriliseret under anvendelse af en 0,45 um celluloseacetat (CA) membranfilterenheden og opbevaret ved 4 ° C i maksimalt 7 dage.
| Kemisk | Amount |
| Earles Balanced Salt Solution (10x) | 25 ml |
| Natriumbicarbonat | 0,550 g |
| Pyrodruesyre | 0,0063 g |
| Penicillin G | 0,0188 g |
| Streptomycinsulfat | 0,0125 g |
| L-Glutamin | 0,073 g |
| EDTA, dinatriumsaltdihydrat | 0,1 mg |
| Essentielle aminosyrer (50x) | 5,0 ml |
| MEM vitaminblanding (100x) | 2,5 ml |
| Phenol Red Solution | 0,2 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0,75 g |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens der er flere metoder til eksogen nukleinsyre overførsel til somatiske celler, såsom elektroporering og transfektion, mikroinjektion er den optimale metode til levering af RNA-molekyler i transkriptionelt hvilende museoocytter. Den nuværende protokol giver en effektiv metode til in vitro-udtømning af specifikke mRNA, der giver den funktionelle test af forskellige spindel og / eller MTOC-associerede faktorer i oocytter. Denne tilgang resulterer i en effektiv udskrift udtynding og er meget fleksibel. Selvom siRNA'er blev anvendt til specifikt at målrette Pcnt transkripter, kan lignende betingelser anvendes til at målrette næsten enhver gen af interesse.
Flere aspekter af denne protokol, herunder ægudtagningen, kultur og manipulation kræver praksis og erfaring til at bevare oocyt kvalitet og for at undgå tekniske artefakter. Udsving i pH og / eller temperatur af dyrkningsmediet skal undgås ved at arbejde expediently og omhyggeligt. Mikroinjektion af små grupper af oocytter, og tilgængeligheden af en opvarmet etape i mikroinjektion systemet vil begrænse skadelige temperaturændringer. Det anbefales at bruge af præ-validerede siRNA'er og effektiv målprotein udtømning kræver bekræftelse ved immunofluorescens eller Western blotting. Nogle skridt vil kræve modifikation at målrette forskellige gener af interesse. For eksempel er den anbefalede 24 hr 'holder periode «i milrinon-suppleret medium er effektiv til forskellige siRNA'er. Dog kan denne periode kræver justeringer for meget rigelige mRNA og / eller målproteiner med særligt lange halveringstider, eller kan forkortes til mindre rigelige mål. Alligevel er det vigtigt at overveje, at oocyt kvalitet og meiotisk potentiale bedst bevarede Brug af Hold perioder af 24 timer eller mindre. Forsigtig med oocyt håndtering er også nødvendigt under fiksering og immunofluorescensanalyse. Oocyt fiksering ved 37 ° C begrænser mikrotubuli depolymerization, som forekommer med lavere temperaturer, og bedre bevarer meiotisk spindel struktur. Dog kan have brug for disse betingelser, der skal justeres afhængigt af target proteinet af interesse. Derudover skal også optimale betingelser for immunfluorescens (dvs. antistofkoncentrationer samt inkubation tid og temperatur) skal etableres for alle antistoffer af interesse, og afprøvet strengt før udførelse siRNA mikroinjektion.
Denne teknik kan ikke effektivt nedbryder meget rigelige proteiner inden for en rimelig tidsramme, der opretholder oocyt kvalitet og kompetence til at gennemgå meiotiske deling, som oocyt levedygtighed kun kan opretholdes i en begrænset periode i kultur. Hypomorph fænotyper kan observeres med delvis knockdown af target udskrifter. Imidlertid kan co-injektion af specifikke morpholinos anvendes som en parallel strategi for yderligere inhibering af translation. Der er også nogle begrænsninger med hensyn til potentiel nedstrøms ANALYsis, der er mulige med mikroinjicerede oocytter. For eksempel kan den nødvendige håndtering og udvidet kultur begrænse oocyt kapacitet til at undergå en succes in vitro fertilisering (IVF), og til hinder for studiet af funktionelle virkninger på præ-implantation udvikling foster. Desuden store stikprøvestørrelser er vanskelige at opnå med denne tilgang at der er behov for nogle downstream applikationer, såsom immunoblotting eller biokemiske analyser.
På trods af visse begrænsninger, denne fremgangsmåde fremmer effektiv in vitro-udtømning af specifikke mRNA, der gør det muligt for funktionelle test af forskellige faktorer i oocytter og har været anvendt med succes af forskellige forskergrupper. Tab af funktion analysen i oocytter normalt indebærer generering af (betinget) knockout eller transgene RNAi musemodeller. Begge fremgangsmåder er arbejdskrævende og tidskrævende. I modsætning hertil in vitro siRNA mikroinjektion let kan bruges til funktionel test med betydeligtmindre tid og ressourcer. Det er en særlig værdifuld tilgang til at få indsigt af et mål protein funktionelle konsekvenser, før der iværksættes på opgaven med at generere en knockout / transgen musemodel.
Kombinationen af siRNA mikroinjektion og immunfluorescensanalyse giver et stærkt analytisk værktøj til undersøgelse af proteinekspression og subcellulære fordelingsmønster under de forskellige faser af meiotisk progression som reaktion på siRNA-medieret målprotein udtynding. Potentielle forskelle i siRNA effekt fra oocyt til oocyt er let identificerbare og give mulighed for nøjagtig korrelation mellem vellykket målprotein udtømning og fænotypisk / funktionel analyse. Videreudvikling af protokoller for co-injektion af specifikke siRNA molekyler med udjævnede messenger RNA koder histon H2B-GFP-fusion-proteiner (eller andre fluorescens-mærkede markører) vil gøre det muligt at vurdere målproteinets funktion i real-tid ved levende cell billeddannelse.
Sammenfattende med optimerede betingelser, siRNA mikroinjektion for transkript dæmpning giver en værdifuld mekanisk tilgang for at teste funktionen af specifikke målproteiner i museoocytter på en celle per celle basis, især når den kombineres med andre stærke analytiske værktøjer som immunofluorescensanalyse. Denne kombinerede fremgangsmåde blev anvendt til med succes nedbryder MTOC-associerede proteiner og evaluere meiotisk spindeldannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P. Renaissance of mammalian endogenous RNAi. FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
