Summary
Her presenterer vi en protokoll for spesifikke siRNA-mediert mRNA uttømming fulgt av immunofluorescensanalyse å evaluere meiotisk spindelenheten og organisasjon i mus oocytter. Denne protokollen er egnet for in vitro uttømming av vitnemål og funksjonell vurdering av ulike spindel og / eller MTOC-tilknyttede faktorer i eggceller.
Introduction
Meiose er en unik divisjon prosess som skjer i kjønnscellene (egg og sperm) og innebærer to delin uten å gripe DNA syntese å skille homologe kromosomer og søsterkromatider under meiose-I og meiose-II, henholdsvis 1. Feil i kromosom segregering under meiotisk divisjon i ubefruktede egg kan resultere i Aneuploidy, som er arvet av fosteret under befruktning. Spesielt var forekomsten av Aneuploidy i utviklings embryoer øker med stigende mors alder og er en viktig årsak til medfødte misdannelser samt graviditet tap på kvinner 1,2, altså, understreker et viktig behov for å forstå den molekylære grunnlaget for Aneuploidy under meiotisk divisjon .
Under celledeling, er avgjørende avhengig montering av microtubule spindelapparatet og etablering av stabile kromosom-microtubule interaksjoner for riktig vedlegg til motsatt spindel kromosom segregeringpolene. Viktigere, meiotisk spindel formasjonen i pattedyr oocytter skiller seg fra mitose i somatiske celler, og er regulert av unike mikrotubul organiserende sentre (MTOCs) som mangler Sentrioler 3,4. Essensielle proteiner som er nødvendige for microtubule kimdannelse og organisering lokalisere til oocytten MTOCs, inkludert γ-tubulin som katalyserer microtubule montering. I tillegg pericentrin fungerer som en viktig stillas protein, som binder og ankere y-tubulin så vel som andre faktorer på MTOCs 5. Spesielt våre studier viser at uttynning av nøkkel MTOC-assosierte proteiner forstyrrer meiotisk spindel organisasjon og fører til kromosom segregering feil i ubefruktede egg, som ikke er fullt ut løses av spindelenheten sjekkpunkt (SAC) 6,7. Derfor mangler i spindel stabilitet, som ikke utløser meiotisk arrest, utgjøre en betydelig risiko i å bidra til Aneuploidy. Til tross for sin avgjørende rolle i spindelenheten og organisasjon, eggcelle MTOC protein komposisjon og funksjonen er fortsatt dårlig forstått.
Å teste funksjonen av spesifikke target-proteiner i pattedyr oocytter er krevende, ettersom cellene blir transkripsjonelt hvilende kort tid før gjenopptakelse av meiose 8,9. Derfor preovulatoriske eggceller stole på mors mRNA butikker å gjenoppta meiose og støtte meiotisk divisjon samt de første cleavage divisjoner etter befruktning 10,11. Effekten av RNA-interferens (RNAi) mediert degradering av mRNA transkripter i pattedyr ubefruktede egg er godt etablert og mødre RNA rekruttert for oversettelse under meiotisk modning er spesielt mottagelig for siRNA målgruppe 12-14. Derfor mikroinjeksjon av korte interfererende RNA (siRNAs) inn oocytter gir en verdifull tilnærming til å utarme målet mRNAs for funksjonell testing.
Her beskriver vi fremgangsmåter for isolering av muse-oocytter og siRNA-mediert nedbrytning av spesifikk transcripts å teste funksjonen av en essensiell MTOC-assosiert protein, pericentrin. I tillegg har vi beskrive immunfluorescens analyse forhold til å evaluere meiotisk spindel formasjonen i oocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Georgia.
1. Forberedelser
- For eggcelle kultur, kjøp eller fersk forberede Minimal Essential Medium (MEM) og supplere med 3 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) som skissert i tabell 1. Plasser en polystyren flaske på en laste balanse (tare til null). Legg alle reagenser, med unntak av BSA, for å hente opp og sluttvolumet med MQ-vann på vektbasis, til totalt 250 g. Deretter legger BSA, tillate å oppløse og filter sterilisere.
Merk: Den beskrevne MEM medium krever likevekt og celle inkubasjon med en medisinsk gassblanding av 5% CO2, 5% O2 og 90% N2. Imidlertid kan andre medier (f.eks CZB) brukes som gir mulighet for celle inkubasjon i 5% CO 2 under atmosfæriske forhold. - For eggcelle mikroinjeksjon, kjøpe eller forberede M2 medium.
- Forbered pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) til en konsentrasjon på 5 IU / 100 ul.
- Kjøp og rekonstituere siRNA aksjer til en fungerende konsentrasjon på 1 mikrometer.
2. Mouse Oocyte Collection
- DAG 1: Å stimulere eggstokkfollikkelen utvikling og øke antall preovulatoriske follikler, administrere 5 IE PMSG intraperitonealt til hunnmus 48 timer før eggcelle samling.
- DAG 3: For eggcelle innsamling og kultur, sette opp 35 mm kultur retter med 3 ml MEM / BSA supplert med 1 mg / ml milrinon. Dette fosfodiesteraseinhibitor opprettholder ubefruktede egg i profase-jeg arrestere og hindrer Germinal vesikkel sammenbrudd (GVBD). Stabilisere de kulturskåler i en medisinsk gassblanding i minst 15 min.
Merk: Milrinone supplert media er nødvendig i hele eggcelle samling, samt eggcelle mikroinjeksjon og 24 timers kultur hold perioden etter siRNA. - Hente eggstokkene fra hunnmus ved hjelp etablert laboratoriepraksis 15 og overføre til en ny kultur tallerken med forvarmet og likevekt MEM / BSA / milrinon.
- Plasser dyrkningsskålen på scenen av en stereomikroskop for eggcelle samling. Slipp cumulus-oocytten-komplekser (COC-tallet) ved manuelt å stikke hull antrum folliklene med 27 G kanyler. Fastsette en eggstokk til bunnen av kulturskålen, med en 27 G nål festet til en 1 ml sprøyte, og bruke en andre nål til å stikke hull på alle store follikler. Gjenta for hver eggstokk.
- Ved hjelp av standard Munnpipettering prosedyrer eller andre former for eggcelle aspirasjon, samle alle ubefruktede egg som er omgitt av 2 eller flere lag av kompakte cumulus celler. Overføre COC tallet til en ny rett og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Fjern forsiktig de omkringliggende cumulus celler ved gjentatt forsiktig pipettering med en 1 ml pipette satt til en aspirasjon volum på 750 mL. Gjenta pipettering steg ca 12 gangerog la oocytter for å gjenopprette i 5 min. Fortsett på denne måten til alle eller de fleste av cumulus cellene er blitt fjernet. Overfør utarmede oocyttene til et annet dyrkningsskål og lar komme i likevekt ved 37 ° C i 15 min.
- Fordele blottet ubefruktede egg inn i tre forsøksgrupper som skal brukes til: (i) mikroinjeksjon av spesifikke siRNAs mot mål av interesse, (ii) mikroinjeksjon av uspesifikke (kontroll) sirnas, og (iii) en ikke-injisert kontrollgruppe å gjøre rede for dyrkningsforhold.
3. Oocyte Mikroinjeksjon
- Sett opp kultur retter med 3 ml M2 media supplert med milrinon (1 mikrogram / ml) for eggcelle mikroinjeksjon. Forbered kultur retter som inneholder MEM / BSA / milrinon for vasking og påfølgende kultur injisert ubefruktede egg.
Merk: M2 medium inneholder HEPES-buffer og krever pre-oppvarming ved 37 ° C i 15 min under atmosfæriske betingelser. MEM krever pre-oppvarming og likevekt ved hjelp av medisinsk gass som beskriverd ovenfor. - Forbered mikroinjeksjon system. Laste kanylen med 5 mL av en mikrometer bestemt siRNA løsning. Fest holde pipette og kanyle til micromanipulators av mikroinjeksjon system og sette opp Injection Unit med kalibrert volum og trykk.
- Plasser en 200 mL mikrodråpe M2 materiale på innsiden av lokket på en 3 cm kulturskål legg til en oocytt for å sette opp og justering for mikroinjeksjon system.
- Bruke eggcelle som en guide, justere posisjonene av holding og kanyler. Anvende undertrykk til holde pipette for å sikre forsiktig eggcelle og justere posisjonen til injeksjonsnålen i den bredeste diameteren til cellen. Justere innstillingene for å tillate mikroinjeksjon på ca 10 pl av siRNA løsning hvor som helst i eggcelle cytoplasma.
Figur 1. Oocyte mikroinjeksjon satt opp. ( - Returner lokket til stereo scenen og legge en 200 mL mikro-slipp av fersk M2 media. Legge til en gruppe av ubefruktede egg (~ 10) til mikro-slipp av Munnpipettering, eller alternative metoder, og deretter tilbake lokket med micro-slipp til mikroinjeksjon scenen.
- Fortsett til microinject de enkelte eggceller. Sikre én eggcelle med holding pipette, sakte inn tuppen på kanylen inn i cytoplasma og utvise injeksjonsvolumet siRNA løsning. Trekke forsiktig nålen og mohar det injiserte oocytten til en stilling ved bunnen av den lille dråpe. Flytt hell injiserte oocytter til en posisjon på toppen av den lille dråpe.
- Gjenta mikroinjeksjon prosedyren med hver eggcelle. For å opprettholde optimal oocytt levedyktighet, microinject bare et lite antall oocytter på en gang. Sørg for at denne prosessen tar ikke mer enn noen få minutter for å hindre temperatur og pH-endringer i mikro-slipp.
- Aspirer hell injisert ubefruktede egg eller nøye flytte lokket med mikro-slipp av injisert eggceller til stereomikroskopet. Overfør de injiserte oocyttene levedyktige gjennom munnen pipettering eller alternative metoder, til MEM / BSA / milrinon medium for å vaske og likevekt ved 37 ° C.
- Ved hjelp av en annen gruppe av oocytter, mikroinjeksjon gjenta prosessen med en ny injeksjonsnål lastet med ikke-spesifikke sirnas for kontrollgruppen. Vask ubefruktede egg i MEM / BSA / milrinon og overføring til en egen kultur parabolen.
- Kultur alle grupper avOocytter i 24 timer i MEM / BSA / milrinon ved 37 ° C under en atmosfære av medisinsk gass.
Merk: 'milrinon blokk "kultur periode er nødvendig for effektiv target mRNA / protein utarming.
4. Oocyte Kultur for meiotisk Modning
- DAG 4: For hver forsøksgruppe av ubefruktede egg satt opp 4 kultur retter (35 mm) med 3 ml MEM / BSA. Supplere ett medium tallerken per gruppe med 10% (høy kvalitet) føtalt bovint serum (FBS) som skal brukes til oocytmodningen. Tillat alle kulturskåler ekvilibrere ved 37 ° C med medisinsk gassblandingen.
- Å frigjøre eggceller fra 'milrinon block', sekvensielt vaske ubefruktede egg tre ganger i retter som inneholder MEM / BSA og deretter overføre eggceller til modning fatet inneholder media med 10% FBS. Culture oocytten alle grupper for 17 timer ved 37 ° C, for å muliggjøre gjenopptagelse og progresjon av meiose.
- Dag 5: Forbered løsninger for eggcelle fixasjon, inklusive: (i) 4% paraformaldehyd (PFA) i PEM-buffer (100 mM PIPES [pH 6,9], 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA) med 0,5% Triton-X-100, og (ii) PBS supplert med 5 % FBS som vil bli brukt til å vaske og blokkere oocyttene.
Merk: Disse løsningene krever forhånds oppvarming til 37 ° C før eggcelle fiksering. - For oocyte fiksering (etter 17 timers kultur), raskt overføre hver forsøksgruppe oocytter gjennom munnen pipettering eller alternative metoder i de enkelte brønner (for en 4-brønners skål) inneholdende 750 ul av forvarmet 4% PFA-løsning og inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Deretter vaskes hver gruppe av oocytter 3 ganger (15 min hver) i 750 pl av forvarmet PBS inneholdende 5% FBS.
- Blokk oocytter i 200 ul PBS / 5% FBS O / N ved 4 ° C for å redusere uspesifikke antistoffbinding.
5. Immunofluorescensanalyse
- DAG 6:
Note: Farging utføres i en multi-brønn-plate og OOCytes er serie overført til sekvensielle brønner, som inneholder respektive antistoff og vaskeløsninger. Enten 48 eller 96-brønners plater kan anvendes, er det bare å justere volumet av oppløsningen basert på aner størrelse. For 96-brønners plater bruke 200 pl per brønn. Ubefruktede egg blir overført til de ulike løsningene i følgende rekkefølge: primær antistoff løsning - 3 vaske brønner - sekundært antistoff løsning - 3 vaske brønner. For å begrense lyseksponering platen kan dekkes med folie.
Forbered fersk PBS / 5% FBS og bruke denne løsningen for å fremstille antistoff-fortynninger (f.eks kanin anti-pericentrin (1/1000), muse-anti-tubulin (1/1000)). - Overfør de faste oocyttene i hver forsøksgruppe for å individuelle brønnene som inneholder 200 ul (eller 100 ul, hvis mindre volum er ønskelig) av det primære antistoff-oppløsning og dekker godt med Parafilm. Inkuber i henhold til optimale antistoff-spesifikke tilstander (f.eks, 37 ° C i 1 time, eller 4 ° CO / N).
Merk: Primær antistoff dilution så vel som spesifikk inkubasjonstid og temperatur krever testing for å bestemme de optimale betingelser for forskjellige antistoffer brukt. - Etter inkubasjon med det primære antistoff, vask oocyttene tre ganger i PBS / 5% FBS (10-15 min hver).
- Overfør oocyttene inn i løsningen inneholdende fluorescensmerket-konjugerte sekundære antistoffer (f.eks, 1/1000-fortynning av anti-kanin og anti-mus-antistoffer konjugert med fluorokromer av forskjellige bølgelengder). Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
- Vask oocyttene tre ganger i PBS / 5% FBS (10 - 15 min hver).
- Etter den siste vasketrinn, overføres oocyttene på en ren glassplate og forsiktig å suge overflødig vaskeløsning. Dette vil immobilisere oocyttene på glassets overflate. Legg 8 mL av montering media (som inneholder DAPI) og klæ monterings media forsiktig med en 22 mm x 22 mm dekkglass. Senk dekk sakte for å unngå overlapping luftbobler og / eller ødelegger eggceller.
Merk: Alternativt, for å opprettholde den 3-dimensjonale egenskaper av egget for konfokal mikroskopi-analyse, legge til et lite volum på 100 pm glassperler (blandet med vaselin) til hjørnene av dekkglasset før montering på lysbildet. - Oppbevar lysbilder ved 4 ° C, eller fortsette til vurdering av meiotisk progresjon, samt analyse av ekspresjonsnivåer og subcellulære lokalisering protein ved hjelp av et fluorescens mikroskop utstyrt med de nødvendige filtre for å samsvare med de sekundære antistoffer som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroinjeksjon av sirnas gir en effektiv tilnærming for mRNA nedbrytning og påfølgende protein utarming i ubefruktede egg, som muliggjør effektiv og svært spesifikke funksjonstesting av ulike målgrupper faktorer in vitro. Deretter blir immunfluorescens brukes for spesifikk fenotype analyse, så vel som for å validere protein uttømming i siRNA-injiserte oocytter. I dagens eksempel fluorescerende merking av individuelle ubefruktede egg med DAPI sammen med anti-tubulin og anti-pericentrin antistoffer aktivert: (i) bekreftelse av pericentrin uttømming samt (ii) en helhetlig vurdering av både kromatin og meiotisk spindel konfigurasjoner i kontroll og PCNT - utarmet ubefruktede egg.
Representative immunfluorescens bilder av oocytter microinjected med uspesifikk kontroll eller Pcnt sirnas er vist i figur 2 7. Etter en 17 timers kultur, de fleste kontroll oocytter nådd metafase-II stage og inneholder organisert meiotisk spindler med justert kromosomer og lyse pericentrin merking den spindel polene (Figur 2A). Spesielt, pericentrin ble ikke påvist i oocytter injisert med Pcnt siRNA, noe som bekrefter effektiv protein knockdown i disse cellene. Videre, de fleste av PCNT fattige eggceller holdt seg på meta-I scenen og viser uorganisert spindel strukturer med feiljustert kromosomer (figur 2B). De få PCNT fattig ubefruktede egg som utviklet seg til metafase-II også utstilt forstyrret spindler (Figur 2C).
Figur 2. Immunofluorescensanalyse for meiotisk spindel organisasjon i mus oocytter Representative bilder av oocytter injisert med enten (A) å kontrollere ikke-spesifikk sirnas eller med (B, C), spesifikt Pcnt. -sirnas. Oocytter ble dobbeltmerket med anti-pericentrin (rød) sammen med et anti-acetylert α-tubulin-antistoff for påvisning av mikrotubuli (grønn). DNA ble merket med DAPI, og er vist i blått. Det innfelte viser en 2X forstørrelse av spindelen pol området. Pilene angir feiljustert kromosomer. * Spindel pol. Pb: Først polar kroppen. Scale bar på 10 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra Ma og Viveiros 2014 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Oppskrift for forberedelse av MEM. Notering av alle reagenser og konkrete beløp for å forberede 250 ml MEM. Mediet er filtersterilisert ved bruk av en 0,45 um celluloseacetat (CA) membranfilterenhet og lagret ved 4 ° C i maksimalt 7 dager.
| Kjemisk | Amount |
| Earle balanserte saltoppløsning (10x) | 25 ml |
| Natrium bikarbonat | 0.550 g |
| Pyruvinsyre | 0,0063 g |
| Penicillin G | 0,0188 g |
| Streptomycin Sulfat | 0,0125 g |
| L-Glutamin | 0,073 g |
| EDTA, dinatriumsaltdihydrat | 0,1 mg |
| Essential Amino Acids (50x) | 5,0 ml |
| MEM Vitamin Blanding (100x) | 2,5 ml |
| Fenol Red Solution | 0,2 ml |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | 0,75 g |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om det finnes flere metoder for eksogen nukleinsyre overføring inn i somatiske celler, som for eksempel elektroporering og transfeksjon, mikroinjeksjon er den optimale fremgangsmåten for levering av RNA-molekyler inn i transkripsjonelt hvilende muse-oocytter. Den nåværende protokollen gir en effektiv tilnærming for in vitro uttømming av spesifikke mRNA som muliggjør funksjonstesting av ulike spindel og / eller MTOC-tilknyttede faktorer i eggceller. Denne tilnærmingen resulterer i effektiv transkripsjon depletion og er svært tilpasningsdyktig. Selv sirnas ble brukt spesifikt mot Pcnt transkripsjoner, kan lignende tilstander brukes til å målrette nesten alle genet av interesse.
Flere aspekter av denne protokollen, inkludert eggcelle samling, kultur og manipulasjon krever praksis og erfaring til å bevare eggcelle kvalitet og for å unngå tekniske gjenstander. Svingninger i pH-verdien og / eller temperaturen i kulturmedier, må unngås ved å arbeide expediently og nøye. Mikroinjeksjon av små grupper av oocytter, og tilgjengeligheten av et oppvarmet fase i mikroinjeksjon systemet vil begrense skadelige temperaturendringer. Bruken av forhånds validert sirnas er anbefalt og effektiv målprotein utarming krever bekreftelse av immunfluorescens eller Western blotting. Noen skritt vil kreve modifikasjon for å målrette ulike gener av interesse. For eksempel er den anbefalte 24-timers 'hold periode "i milrinon-supplert medium er effektiv for ulike siRNAs. Imidlertid kan denne tidsperioden krever justeringer for svært rike mRNA og / eller målproteiner med spesielt lange halveringstider, eller kunne bli forkortet for mindre rikelig mål. Likevel er det viktig å tenke på at eggcelle kvalitet og meiotisk potensial bevares best ved hjelp hold perioder på 24 timer eller mindre. Forsiktig med eggcelle håndtering er også nødvendig under fiksering og immunofluorescensanalyse. Eggcelle fiksering ved 37 ° C begrenser microtubule depolymerization, noe som skjer ved lavere temperatur, og bedre bevarer meiotisk spindel struktur. Imidlertid kan disse forholdene må justeres avhengig av målet protein av interesse. I tillegg optimale forhold for immunfluorescens (dvs. antistoffkonsentrasjoner samt inkubasjon tid og temperatur) må også etableres for alle antistoffer av interesse, og testet grundig før gjennomføring av siRNA mikroinjeksjon.
Denne teknikken kan ikke effektivt utarme svært rikelig proteiner innen en rimelig tidsramme som holder eggcelle kvalitet og kompetanse til å gjennomgå meiotisk divisjon, som eggcelle levedyktighet kan bare opprettholdes for en begrenset tid i kultur. Hypomorph fenotyper kan observeres med delvis knockdown av målet transkripsjoner. Imidlertid kan ko-injeksjon av bestemte morpholinos bli brukt som en parallell strategi for ytterligere inhibering av translasjon. Det er også noen begrensninger med hensyn til potensielle nedstrøms analysis som er gjennomførbare med microinjected eggceller. For eksempel kan den nødvendige håndtering og utvides kulturen begrense oocytten evne til å gjennomgå vellykket in vitro fertilisering (IVF) og være til hinder for studiet av funksjonelle effekter på pre-implantation embryo utvikling. Videre store utvalgsstørrelsene er vanskelig å oppnå med denne tilnærmingen som er nødvendig for noen nedstrøms programmer, for eksempel immunoblotting eller biokjemiske analyser.
Til tross for noen begrensninger, fremmer denne tilnærmingen effektive in vitro uttømming av spesifikke mRNA som gjør den funksjonell testing av ulike faktorer i eggceller og har blitt brukt med hell av ulike forskningsmiljøer. Tap-av-funksjon analyse i oocytter vanligvis innebærer generasjon (betinget) knockout eller transgene RNAi musemodeller. Begge metodene er arbeids- og tidskrevende. I motsetning til dette, in vitro siRNA mikroinjeksjon kan lett anvendes for funksjonell testing med betydeligmindre tid og ressurser. Det er en spesielt verdifull tilnærming til å få innsikt i et mål protein funksjonelle konsekvenser før du tar fatt på oppgaven med å generere en knockout / transgen musemodell.
Kombinasjonen av siRNA mikroinjeksjon og immunofluorescens-analyse gir et kraftig analytisk verktøy for studier av proteinekspresjon og subcellulære fordelingsmønstre under forskjellige stadier av meiotisk progresjon i respons til siRNA-mediert målprotein uttømming. Potensielle forskjeller i siRNA effekt fra eggcelle til eggcelle er lett identifiserbare og la for nøyaktig korrelasjon mellom vellykket målprotein utarming og fenotypiske / funksjonell analyse. Videreutvikling av protokoller for co-injeksjon av spesifikke siRNA-molekyler med avkortet messenger RNA som koder histon H2B-GFP fusion-proteiner (eller annen fluorescensmerkede markører) vil gjøre det mulig å vurdere målprotein funksjon i sanntid av levende cell bildebehandling.
I sammendrag, med optimaliserte betingelser, siRNA mikroinjeksjon for transkripsjon lyddemping gir en verdifull mekanisk metode for å teste funksjonen av spesifikke target-proteiner i mus oocytter på en celle per celle basis, særlig når den kombineres med andre kraftige analyseverktøy som immunofluorescensanalyse. Dette kombinert tilnærming ble brukt for å kunne tømme MTOC-assosierte proteiner og evaluere meiotisk spindel formasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P.
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
