Summary
Här presenterar vi ett protokoll för specifik siRNA-medierad mRNA utarmning följt av immunofluorescensanalys att utvärdera meiotisk spindelenhet och organisation i musoocyter. Detta protokoll är lämplig för in vitro utarmning av transkript och funktionell bedömning av olika spindel och / eller MTOC associerade faktorer i oocyter.
Introduction
Meios är en unik division process som sker i gameter (äggceller och spermier) och som omfattar två på varandra följande divisioner utan mellanliggande DNA-syntes att segregera homologa kromosomer och systerkromatider under meios-I och meios-II, respektive 1. Fel i kromosomsegregation under meiotisk delning i oocyter kan resultera i aneuploidi, som ärvs av embryot under befruktningen. Noterbart ökar förekomsten av aneuploidi i utvecklings embryon med stigande moderns ålder och är en viktig orsak till medfödda missbildningar samt missfall hos kvinnor 1,2, alltså, vilket understryker en viktig behov av att förstå den molekylära grunden för aneuploidi under meiotisk delning .
Under celldelning är synnerligen beroende av monteringen av mikrotubuli spindelapparaten och etablering av stabila kromosom-mikrotubuli interaktioner för korrekt anslutning till motsatt spindelkromosomsegregationstolpar. Viktigt, meiotisk spindelbildning i däggdjurs oocyter skiljer sig från mitos i somatiska celler, och regleras av unika mikrotubuli organiserande centraler (MTOCs) som saknar centrioler 3,4. Viktiga proteiner som är nödvändiga för mikrotubuli kärnbildning och organisation lokalisera till äggcell MTOCs, inklusive γ-tubulin som katalyserar mikrotubulus aggregatet. Dessutom pericentrin fungerar som en viktig byggnadsställning protein som binder och ankare y-tubulin samt andra faktorer som MTOCs 5. I synnerhet våra studier visar att utarmning av viktiga MTOC-associerade proteiner stör meiotisk spindel organisation och leder till kromosomsegregation fel i oocyter, som inte är fullt beslutas av spindelenhet checkpoint (SAC) 6,7. Därför brister i spindel stabilitet, som inte utlöser meiotiska gripande, utgör en betydande risk för att bidra till aneuploidi. Trots deras viktiga roll i spindelenhet och organisation, äggcell MTOC protein sammansättning och funktion är fortfarande dåligt kända.
Testa funktionen hos specifika målproteiner i däggdjurs oocyter är utmanande, eftersom cellerna blir transkription vilande strax före återupptagandet av meios 8,9. Därför preovulatoriska oocyter lita på moderns mRNA butiker att återuppta meios och stödja meiotisk divisionen samt första klyvnings divisionerna efter befruktningen 10,11. Effekten av RNA-interferens (RNAi) förmedlad nedbrytning av mRNA-transkript i däggdjurs ägg är väl etablerad och moderns RNA rekryteras för översättning under meiotisk mognad är särskilt mottagliga för siRNA inriktning 12-14. Därför mikroinjektion av korta störande RNA (siRNA) i oocyter ger en värdefull metod för att utarma rikt mRNA för funktionstestning.
Här beskriver vi metoder för isolering av musoocyter och siRNA-medierad utarmning av specifik transcripts att testa funktionen av en väsentlig MTOC-associerat protein, pericentrin. Dessutom beskriver vi immunofluorescensanalys förutsättningar för att utvärdera meiotisk spindelbildning i oocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Georgia.
1. Förberedelser
- För äggcellen kultur, köp eller nyligen förbereda Minimal Essential Medium (MEM) och komplettera med 3 mg / ml bovinserumalbumin (BSA) som anges i tabell 1. Placera en polystyren flaska på en lastbalans (tara till noll). Lägg till alla reagenser, förutom BSA, i ordning och ta upp den slutliga volymen med MQ-vatten i vikt till totalt 250 g. Tillsätt sedan BSA, tillåta att upplösa och filtrera sterilisera.
Obs: Den beskrivna MEM-medium kräver ekvilibrering och cell inkubation med en medicinsk gasblandning av 5% CO2, 5% O2 och 90% N2. Däremot kan andra medier (t.ex. CZB) användas som gör det möjligt för cell inkubation i 5% CO2 under atmosfäriska förhållanden. - För äggcellen mikroinjektion, köpa eller förbereda M2-medium.
- Förbered pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) till en koncentration av 5 IU / 100 pl.
- Köp och rekonstruera siRNA aktier till en fungerande koncentration av 1 | iM.
2. Mus Oocyte Collection
- DAG 1: Att stimulera äggblåsa utveckling och öka antalet preovulatoriska folliklar, administrera 5 IE PMSG intraperitonealt till honmöss 48 timmar före äggcellen samling.
- DAG 3: För äggcellen insamling och kultur, inrätta 35 mm odlingsskålar med 3 ml MEM / BSA kompletterat med 1 mikrogram / ml milrinon. Denna fosfodiesterashämmare bibehåller ägg i profas-I gripa och förhindrar germinal vesikel uppdelning (GVBD). Jämvikta odlingsskålama i en medicinsk gasblandning i minst 15 minuter.
Obs: Milrinon kompletteras media krävs hela äggcellen samling, liksom äggcell mikroinjektion och 24 timmars odlingshåll perioden efter siRNA. - Hämta äggstockar från honmöss genom att använda etablerad laboratoriepraxis 15 och överför till en ny odlingsskål med förvärmd och jämvikt MEM / BSA / milrinon.
- Placera kulturen skålen på scenen av ett stereomikroskop för äggcellen samling. Lossa cumulus-äggcell-komplex (COC s) genom att manuellt punktera antrala folliklar med 27 G nålar. Fix en äggstock till botten av odlingsskålen, med en 27 G-nål fäst till en 1 ml spruta, och använda en andra nål för att punktera alla stora folliklar. Upprepa för varje äggstock.
- Med användning av standard Munpipettering förfaranden eller andra medel för ägguttag, samla alla ägg som omges av 2 eller flera skikt av kompakta cumulus celler. Överför COC s i ett annat skålen och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
- Försiktigt bort den omgivande cumulusceller genom upprepad försiktig pipettering med en 1 ml pipett inställd på en strävan volym av 750 ul. Upprepa pipetteringssteget cirka 12 gångeroch låta oocyter återhämta sig under 5 minuter. Fortsätt på samma sätt tills alla eller de flesta av de cumulusceller har tagits bort. Överför avklädda oocyter till en annan kultur skålen och låt jämvikt vid 37 ° C under 15 minuter.
- Fördela de blottlagda oocyter i tre experimentgrupper som ska användas för: (i) mikroinjektion av specifika siRNA mot målet av intresse, (ii) mikroinjektion av ospecifika (kontroll) siRNA, och (iii) en icke-injicerade kontrollgruppen redogöra för odlingsbetingelser.
3. Oocyte Mikroinjektion
- Sätt upp odlingsskålar med 3 ml M2-medium kompletterat med milrinon (1 | ig / ml) under oocyt mikroinjektion. Förbered odlingsskålar innehållande MEM / BSA / milrinon för tvätt och efterföljande kultur injicerade oocyter.
Obs: M2-medium innehåller HEPES-buffert och kräver för-värmning vid 37 ° C under 15 min under atmosfäriska förhållanden. MEM kräver förvärmning och jämvikt med hjälp av medicinsk gas som beskriverd ovan. - Förbered mikroinjektion systemet. Fyll på injektionsnålen med 5 pl av en iM specifik siRNA lösning. Säkra håll pipett och injektionsnål till micromanipulators av mikroinjektion systemet och ställa in insprutningsenheten med kalibrerad volym och tryck.
- Placera en 200 pl mikrodroppe M2 media på insidan av locket på en 3 cm odlingsskål och lägg till äggcell för inrättas och inriktning av mikroinjektion systemet.
- Använda äggcellen som en guide, justera positionerna för innehav och injektionsnålar. Applicera undertryck till anläggningen pipetten för att försiktigt säkra oocyten och justera positionen av injektionsnålen till den bredaste diametern av cellen. Justera inställningarna för att tillåta mikroinjektion av cirka 10 ul av siRNA lösning någonstans i äggcellen cytoplasman.
Figur 1. Oocyte mikroinjektion inrättas. ( - Återgå locket till stereo scenen och lägga till en 200 pl mikrodroppe färsk M2 media. Lägg till en grupp av oocyter (~ 10) till mikro droppe Munpipettering eller alternativa metoder, sedan tillbaka locket med mikrodroppe till mikroinjektion scenen.
- Fortsätt att mikroinjicera de enskilda ägg. Säkert en äggcell med innehavet pipett långsamt in spetsen av kanylen i cytoplasman och utvisa injektionsvolym av siRNA lösning. Försiktigt dra in injektionsnålen och move den injicerade oocyten till ett läge på botten av den mikrodroppe. Flytta framgång injicerade oocyter till en position i toppen av mikrodroppe.
- Upprepa mikroinjektion förfarande med varje äggcell. För att bibehålla optimal äggcellen lönsamhet mikroinjicera bara ett litet antal ägg åt gången. Se till att den här processen inte ta mer än ett par minuter för att förhindra temperatur- och pH-förändringar i mikro-drop.
- Sug framgångsrikt injicerade oocyter eller försiktigt flytta locket med mikrodroppe injicerade oocyter till stereomikroskop. Överför injicerade livsdugliga ägg genom Munpipettering eller alternativa metoder, till MEM / BSA / milrinon medium för att tvätta och jämvikt vid 37 ° C.
- Genom att använda en annan grupp av oocyter, upprepa mikroinjektion processen med en ny injektionsnål laddad med icke-specifika siRNA för kontrollgruppen. Tvätta ägg i MEM / BSA / milrinon och överför till en separat odlingsskål.
- Kultur alla grupper avoocyter under 24 timmar i MEM / BSA / milrinon vid 37 ° C under en atmosfär av medicinsk gas.
Obs! "Milrinon block odlingsperioden behövs för effektiv mål-mRNA / protein utarmning.
4. Oocyte Kultur för meiotiska Mognad
- DAG 4: För varje experimentell grupp av oocyter set-up 4 odlingsskålar (35 mm) med 3 ml MEM / BSA. Supplement ett medie skålen per grupp med 10% (hög kvalitet) fetalt bovint serum (FBS) som ska användas för oocytmognad. Tillåt alla odlingsskålar till jämvikt vid 37 ° C med medicinsk gasblandning.
- För att frigöra ägg från "milrinon block, sekventiellt tvätta ägg tre gånger i skålar innehållande MEM / BSA och sedan överföra ägg till mognads skål innehållande medium med 10% FBS. Kultur alla oocyt grupper för 17 timmar vid 37 ° C, för att möjliggöra återupptagande och progression av meios.
- DAG 5: Förbered lösningar för äggcellen fixation, inklusive: (i) 4% paraformaldehyd (PFA) i PEM-buffert (100 mM PIPES [pH 6,9], 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA) med 0,5% Triton-X 100, och (ii) PBS kompletterad med 5 % FBS som kommer att användas för att tvätta och blockera oocyter.
Obs: Dessa lösningar kräver förvärmning till 37 ° C före äggcellen fixering. - För oocyt fixering (efter 17 tim odling), snabbt överföra varje experimentell grupp av oocyter genom munnen pipettering eller alternativa metoder i individuella brunnar (av en 4-brunnars skål) innehållande 750 | il förvärmd 4% PFA-lösning och inkubera vid 37 ° C i 1 timme. Därefter tvättas varje grupp av oocyter 3 gånger (15 min vardera) i 750 pl av förvärmda PBS innehållande 5% FBS.
- Block oocyter i 200 pl PBS / 5% FBS O / N vid 4 ° C för att minimera ospecifik antikroppsbindning.
5. immunofluorescensanalys
- DAG 6:
Obs: Immunfärgning görs i en flerbrunnsplatta och OOCytes är seriellt överföras till sekventiella brunnar, innehållande respektive antikropps- och tvättlösningar. Antingen 48 eller 96 brunnar kan användas, helt enkelt justera lösningens volym bygger på väl storlek. För 96-brunnsplattor använda 200 | il per brunn. Oocyter överförs till de olika lösningarna i följande ordning: primär antikropp lösning - 3 tvätta brunnar - sekundär antikropp lösning - 3 tvätta brunnar. För att begränsa ljusexponering plattan kan täckas med folie.
Bered en färsk PBS / 5% FBS och använda denna lösning för att förbereda spädantikropps (t.ex. kanin anti-pericentrin (1/1000), mus-anti-tubulin (1/1000)). - Överför de fasta oocyter i varje experimentgrupp till individuella brunnar innehållande 200 | j, l (eller 100 | j, l, om mindre volym önskas) av den primära antikroppslösningen och täcka väl med parafilm. Inkubera enligt optimala antikroppsspecifika förhållanden (t ex 37 ° C under en timme, eller 4 ° CO / N).
Obs: Primär antikropp dilution samt särskilda inkubationstid och temperatur kräver tester för att avgöra de optimala förhållandena för olika antikroppar som används. - Efter inkubering med den primära antikroppen, tvätta oocyter tre gånger i PBS / 5% FBS (10-15 min vardera).
- Överför oocyter i lösningen innehållande fluorescerande-konjugerade sekundära antikroppar (t.ex., en / 1000-spädning av anti-kanin och anti-mus-antikroppar konjugerade med fluorokromer med olika våglängder). Inkubera i en timme vid 37 ° C.
- Tvätta oocyter tre gånger i PBS / 5% FBS (10 - 15 min vardera).
- Efter den sista tvättsteget, överföra oocyter på ett rent objektglas och försiktigt aspirera eventuellt överskott tvättlösning. Detta kommer att immobilisera oocyter på glasytan. Tillsätt 8 il montering media (innehållande DAPI) och försiktigt överlagra montering media med en 22 mm x 22 mm täckglas. Sänk täck långsamt för att undvika att droppa luftbubblor och / eller skada ägg.
Obs: Du kan, för att upprätthålla de 3-dimensionella egenskaper äggcellen för konfokalmikroskopi analys, tillsätt en liten volym av 100 um glaspärlor (blandat med vaselin) till hörn av täckglaset före montering på bilden. - Förvara glider vid 4 ° C, eller gå vidare till bedömningen av meiotiska progression samt analys av uttrycksnivåer och subcellulär protein lokalisering med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med nödvändiga filter för att matcha de sekundära antikroppar som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroinjektion av siRNA ger en effektiv strategi för mRNA nedbrytning och efterföljande proteinbristen i oocyter, vilket möjliggör en effektiv och mycket specifika funktionstestning av olika målgrupper faktorer in vitro. Därefter är immunofluorescens används för specifik fenotypanalys samt att validera proteinbrist i siRNA-injicerade oocyter. I det aktuella exemplet, fluorescerande märkning av enskilda oocyter med DAPI tillsammans med anti-tubulin och anti-pericentrin antikroppar aktiverat: (i) bekräftelse av pericentrin utarmning samt (ii) en omfattande utvärdering av både kromatin och meiotisk spindel konfigurationer i kontroll och PCNT - utarmat ägg.
Representativa immunofluorescens bilder av oocyter mikroinjicerade med icke-specifik kontroll eller Pcnt siRNA visas i fig 2 7. Efter en 17 timmars kultur, de flesta kontroll oocyter nått metafas II svene och innehåller organiserade meiotiska spindlar med inriktade kromosomer och ljusa pericentrin märkning på spindel polerna (Figur 2A). Notably var pericentrin detekterades inte i oocyter injicerade med Pcnt siRNA, vilket bekräftar effektiv protein knockdown i dessa celler. Dessutom majoriteten av PCNT utarmade oocyter kvar på metafas-I-stadiet och uppvisar oorganiserade spindelstrukturer med felinriktade kromosomer (figur 2b). De få PCNT utarmade oocyter som framskridit till metafas-II uppvisade också störda spindlar (figur 2C).
Figur 2. Immunofluorescensanalys av meiotisk spindel organisation musoocyter Representant bilder av oocyter injicerade med antingen (A) kontrollerar ospecifika siRNA eller med (B, C) specifik Pcnt. -siRNA. Oocyter var dubbelmärktes med anti-pericentrin (röd) tillsammans med en anti-acetylerad α-tubulin antikropp för detektion av mikrotubuli (grön). DNA märktes med DAPI och visas i blått. Den infällda bilden visar en 2X förstoring av spindel pole området. Pilar anger sneda kromosomer. * Spindel stolpe. Pb: Första polära kroppen. Skal av 10 | j, m. Denna siffra har ändrats från Ma och Viveiros 2014 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Recept för framställning av MEM. Notering av alla reagenser och specifika belopp som behövs för att framställa 250 ml MEM. Medierna är filtersteriliseras med användning av ett 0,45 | im cellulosaacetat (CA), membranfilterenhet och förvarades vid 4 ° C under högst 7 dagar.
| Kemisk | Amount |
| Earles balanserade saltlösning (10x) | 25 ml |
| Natriumbikarbonat | 0,550 g |
| Pyrodruvsyra | 0,0063 g |
| Penicillin G | 0,0188 g |
| Streptomycinsulfat | 0,0125 g |
| L-glutamin | 0,073 g |
| EDTA, dinatriumsalt dihydrat | 0,1 mg |
| Essentiella aminosyror (50x) | 5,0 ml |
| MEM vitaminblandning (100x) | 2,5 ml |
| Fenolrött-lösning | 0,2 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0,75 g |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan det finns flera metoder för exogen syra överföring till somatiska celler, såsom elektroporering och transfektion nuklein, är mikroinjektion den optimala metoden för leverans av RNA-molekyler i transkriptionellt vilande musoocyter. Den nuvarande protokollet ger en effektiv metod för in vitro utarmning av specifika mRNA som möjliggör funktionstestning av annan spindel och / eller MTOC associerade faktorer i oocyter. Detta synsätt leder till effektiv utskrift utarmning och är mycket anpassningsbar. Även siRNA användes för att specifikt rikta Pcnt transkript, kan liknande förhållanden användas för att rikta nästan vilken gen som helst av intresse.
Flera aspekter av detta protokoll, inklusive äggcellen samling, kultur och manipulation kräver övning och erfarenhet för att bevara äggcellen kvalitet och för att undvika tekniska artefakter. Fluktuationer i pH och / eller temperaturen hos odlingsmedia måste undvikas genom att arbeta expediently och försiktigt. Mikroinjektion av små grupper av oocyter, och tillgång till ett uppvärmt steg i mikroinjektion systemet kommer att begränsa skadliga temperaturförändringar. Användningen av i förväg validerats siRNA rekommenderas och effektiv målprotein utarmning kräver bekräftelse genom immunofluorescens eller Western blotting. Vissa åtgärder kommer att kräva modifiering för att rikta olika gener av intresse. Till exempel, det rekommenderade 24 timmar "håller period" i milrinon-kompletterat medium är effektiv för olika siRNA. Dock kan denna tidsperiod kräver justeringar för mycket rikligt mRNA och / eller målproteiner med särskilt långa halveringstider, eller skulle kunna förkortas för mindre rikliga mål. Ändå är det viktigt att beakta att äggcell kvalitet och meiotisk potential bäst bevarade använder hold perioder av 24 timmar eller mindre. Behövs också försiktighet med äggcellen hantering vid fixering och immunofluorescensanalys. Äggcellen fixering vid 37 ° C begränsar mikrotubulus depolymersering, vilket sker med lägre temperaturer, och bättre bevarar meiotisk spindelstruktur. Dock kan dessa villkor måste justeras beroende på målproteinet av intresse. Dessutom optimala förhållanden för immunfluorescens (dvs antikroppskoncentrationer samt inkubationstid och temperatur) måste också fastställas för alla antikroppar av intresse, och testas noggrant innan de genomför siRNA mikroinjektion.
Denna teknik kan inte effektivt bryter mycket rikliga proteiner inom en rimlig tid som upprätthåller äggcell kvalitet och kompetens att genomgå meiotiska divisionen, som äggcellen livskraft endast kan upprätthållas under en begränsad tid i kultur. Hypomorph fenotyper kan observeras med partiell knockdown av mål transkript. Emellertid kan co-injektion av specifika morpholinos användas som en parallell strategi för ytterligare hämning av translation. Det finns också vissa begränsningar som potentiell nedströms analysis som är möjliga med mikroinjicerade ägg. Till exempel kan den nödvändiga hantering och förlängt kultur begränsa äggcellen förmåga att genomgå framgångsrik in vitro fertilisering (IVF) och hindrar studiet av funktionella effekter på preimplantatorisk embryoutveckling. Dessutom, stora provstorlekar är svåra att uppnå med detta tillvägagångssätt som behövs för en del nedströms applikationer, såsom immunoblotting eller biokemiska analyser.
Trots vissa begränsningar, främjar detta tillvägagångssätt effektivt in vitro utarmning av specifika mRNA som gör det möjligt för funktionstestning av olika faktorer i oocyter och har använts framgångsrikt av olika forskargrupper. Förlust-av-funktionsanalys i oocyter vanligtvis innebär generering av (villkorligt) knockout eller transgena RNAi musmodeller. Båda tillvägagångssätten är arbets- och tidskrävande. I motsats, in vitro siRNA mikroinjektion kan lätt användas för funktionstestning med betydligtmindre tid och resurser. Det är en särskilt värdefull metod för att få inblick i ett målprotein funktionella konsekvenser innan man börjar på uppgiften att skapa en knockout / transgen musmodell.
Kombinationen av siRNA mikroinjektion och immunofluorescensanalys ger ett kraftfullt analysverktyg för studier av proteinuttryck och subcellulära distributionsmönster under olika stadier av meiotiska progression som svar på siRNA-medierad målproteinet utarmning. Eventuella skillnader i siRNA effekt från äggcellen till äggcellen är lätt att identifiera och möjliggöra noggrann korrelation mellan framgångsrik målprotein utarmning och fenotypiska / funktionsanalys. Vidareutveckling av protokoll för samtidig injektion av specifika siRNA-molekyler med utjämnade budbärar-RNA som kodar för histon H2B-GFP fusionsproteiner (eller andra fluorescerande markörer) kommer att möjliggöra en bedömning av målproteinet funktion i realtid med levande cell avbildning.
Sammanfattningsvis med optimerade betingelser, siRNA mikroinjektion för transkriptet tystande ger en värdefull mekanistisk strategi för att testa funktionen av specifika målproteiner i musoocyter på en cell per cell-basis, särskilt i kombination med andra kraftfulla analytiska verktyg såsom immunofluorescensanalys. Detta kombinerat tillvägagångssätt användes för att framgångsrikt tömma MTOC-associerade proteiner och utvärdera meiotiska spindeln bildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P. Renaissance of mammalian endogenous RNAi. FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
