Abstract
Количественная характеристики дыхательных потока в легочных глубинах ацинарными и как они влияют на ингаляционный аэрозольный транспорт имеет решающее значение в направлении оптимизации методов ингаляции лекарственного средства, а также прогнозирования моделей осаждения потенциально токсичных частиц в воздухе в легочных альвеолах. Здесь методы мягкой литографии используются для изготовления сложных ацинарные-подобных структур в дыхательных путях на правдивых анатомических длины чешуи, которые воспроизводят физиологические явления ацинарной потока в оптически доступной системе. Микрожидкостных устройство имеет 5 поколений бифурцирующих Поликарбонат протоков с периодически расширяющей и сдерживающей стены. Стена приведение в действие достигается за счет изменения давления внутри заполненных водой камер, окружающих тонкие стенки PDMS ацинозный канала и с боков и в верхней части устройства. В отличие от обычных многослойных микрофлюидальных устройств, где требуется укладывание несколько форм PDMS, простой метод представлен изготовить верхнююкамеры путем встраивания секции ствола шприца в форму PDMS. Этот роман Микрожидкостных установка обеспечивает физиологические движения с дыханием, которые в свою очередь, привести к возникновению характерных ацинарными воздушных потоков. В текущем исследовании, микрочастица изображение велосиметрии (μPIV) с жидкими частицами приостановлено использовали для количественной оценки таких потоков воздуха на основе гидродинамического подобия согласования. Хорошее согласие между результатами μPIV и ожидаемыми явлениями ацинарной потока позволяют предположить , что Микрожидкостных платформа может служить в ближайшем будущем , как привлекательный в пробирке инструментом для исследования непосредственно бортовую представительную перенос частиц и осаждение в ацинарных отделах легких.
Introduction
Подробное количественное определение динамики дыхательных потоков в дистальной, Поликарбонат области легких имеет первостепенное значение в понимании смешивания воздушного потока в легких ацинусе и предсказания судьбы вдыхаемых аэрозолей в глубочайшем дыхательные пути 1-3. Этот последний аспект имеет особое значение при рассмотрении с одной стороны , опасности частиц вдыхаемых вредных веществ или , наоборот , в поисках новых стратегий для улучшения и адресной доставки лекарств ингаляционных терапевтических средств для локализованных участков легких 4, 5, а также для системной доставки.
На сегодняшний день, респираторные потоки в глубоких легочных регионах ацинарными были обычно исследованы в силикомарганца с использованием вычислительной гидродинамики (CFD) или , альтернативно , в пробирке с масштабируемых планом экспериментальных моделей следующие гидродинамического подобия соответствия. За последние несколько десятилетий, методы CFD все чаще применяются для изучения явлений ацинарной потока, от Singlе альвеолярных модели 6, 7 и Поликарбонат протоки 8-12 до более сложных в силикомарганца моделях , которые захватывают анатомически реалистичными ацинарной древовидные структуры с несколькими поколениями Поликарбонат протоков и до нескольких сотен отдельных альвеол. 13-15
Вместе численные усилия сыграли ключевую роль в пролить свет на роль и влияние движения стенки при дыхании движения на последующее модели ацинарной потока воздуха. При отсутствии дыхательного движения, статическая альвеолы функция рециркуляционного потоков внутри их полости , которые не обнаруживают конвективный обмен воздуха между ацинарных протоков и альвеол 6, 7; другими словами, альвеолярных потоки будут полностью изолированы от потоков внутри ацинарных деревьев и обмен воздуха приведет однозначно из диффузионных механизмов. С наличием циклических расширений альвеолярной области, однако, альвеолярные топологий потока резко изменяется, а RESUlting структуры потока внутри альвеол тесно связаны с расположением альвеолы по дереву ацинозной (например., проксимальные против дистальных поколений).
В частности, было сделано предположение, при моделировании, что альвеолярные структуры потока сильно зависят от соотношения альвеолярного к протоковой скорости потока таким образом, что проксимальные поколения легких ацинозной дерева, где это соотношение относительно велика следующие сохранения массы по всей древовидной структуре, функции комплекс с рециркуляцией потоков внутри альвеолярных полостей с необратимыми pathlines жидкости. С каждым поколением более глубокого ацинозной, отношение альвеолярной к протоковых скорости потока постепенно уменьшается таким образом, что дистальные ацинарных поколения обладают более радиальными типа линий тока, которые напоминают простые инфляций и дефляций аэростата. С развитием современных методов визуализации, визуализации данных легких 16, 17 грызунов, включая крыс и мышей, привели к некоторым из первого сеанса одновременной CFDференционных анатомически реконструированных потоков ацинарными в реконструированных альвеол. Несмотря на столь многообещающий прогресс, эти недавние исследования по - прежнему ограничены адресации явлений потока воздуха в концевых альвеолярных мешочков только 18, 19 или нескольких альвеол окружающих единственный канал 20. В результате, внедренный исследования явления дыхательных течения в ацинусе остаются во власти исследований с акцентом на общих анатомически Вдохновленных геометрии ацинарных среды 2.
На экспериментальной стороне, различные настройки , показывающие дыхательные пути с одним или несколькими альвеол были разработаны в течение многих лет 21-24. Тем не менее, не существует ни одного экспериментальных моделей бифурцирующих Поликарбонат дыхательные пути, которые способны имитируя физиологическое дыхание за счет расширения и заключения контрактов в дыхательную как мода. Принимая во внимание отсутствие привлекательных экспериментальных площадок под рукой, изучение ацинарной транспортных явлений остается ограниченным в отношении Валидатин расчетные исследования и критически, сохраняется недостаток экспериментальных данных доступна. . В последние годы, Ма и др (2009) построили уменьшенную до модели жесткой стенки с ацинусе , состоящей из трех поколений ацинарными; Однако, отсутствие движения стенки в этой модели ограничена ее способность захватывать реалистичные альвеолярные структуры потока в условиях дыхания.
Другие чешуйчатые дополнительных экспериментов , включая движущейся модели стены на основе анатомических данных из литой реплики были недавно представила 25; Однако, так как модель только захватили два последних ацинарные поколения (то есть., терминальные мешочки), он не смог захватить сложные циркуляторы потоки , которые характеризуют более проксимальных ацинарные поколений. Эти последние примеры реализации широкомасштабных экспериментов дополнительно подчеркивают продолжающиеся ограничения с такими подходами. В частности, ни одна из существующих эксперимент до сих пор продемонстрировал гипотетическое переход от рециркулирующей к радиальным потоков вдольацинуса и тем самым подтверждают численные предсказания топологий потока гипотетически существует в реальных легочных ацинарными деревьев 7, 15. Пожалуй , наиболее критически, чешуйчатые дополнительных экспериментов крайне ограничены в исследовании вдохнул переноса и осаждения динамику 26 частиц из - за трудностей в соответствие всем соответствующим неправительственным организациям мерными параметрами (например., диффузия частиц, критический транспортный механизм для субмикронных частиц, полностью пренебречь).
С текущих экспериментальных задач, новых экспериментальных площадок, которые позволяют исследования дыхательных воздушных потоков и динамики частиц в сложных подвижных стенок ацинарных сети разыскиваются. Здесь анатомически вдохновленный в пробирке модели ацинозной вводится. Это микрофлюидальные подражает платформа легочная ацинарной протекает непосредственно в представительном масштабе ацинозной, и расширяет растущий ассортимент легких микрофлюидальных моделей 27, в том числе бронхиальной жидкости штекером-FloWS 28-30 и альвеолярно-капиллярный барьер 31.
А именно, настоящее конструкция имеет упрощенный пять поколений Поликарбонат дерева в дыхательных путях с циклически расширяться и сжиматься стенки, где циклические движения достигаются за счет регулирования давления внутри водяной камеры, которая окружает тонкие PDMS боковые стенки и где верхняя стенка деформирована путем дополнительной воды камера сидит непосредственно над структурой ацинозной. В отличие от обычных многослойных микрофлюидальных устройств, эта камера просто формируется путем встраивания секции ствола шприца внутри устройства PDMS, и не требует подготовки дополнительной PDMS формы.
Миниатюрная подход, представленный здесь, предлагает простые и универсальные средства для воспроизведения сложных ацинарные структур с движущимися стенками по сравнению с масштабируется вверх моделей во время захвата основные характеристики среды ацинарной потока. Эта платформа может быть использована для флож визуализации с использованием частиц жидкостью подвешен внутри дыхательных путей (см Представитель Результаты ниже). В ближайшем будущем, модель будет использоваться частиц в воздухе для изучения динамики частиц ингаляционных ацинарные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Мастер Fabrication
- Используйте глубокое реактивное ионное травление (DRIE) от кремний на диэлектрике (SOI) пластин для изготовления мастер - кремниевой пластины , как описано в предыдущих работах 32, 33.
Примечание: DRIE предпочтительнее стандартной SU-8 микрообработки из-за особенностей высоким соотношением (шириной 40 мкм и 90 мкм глубоких траншеях).
2. Литье и Герметизация микрожидкостных устройств
- Смешайте PDMS и отвердителя в соотношении 10: 1 вес внутри чистой небольшой контейнер, такой как пластмассовый весовую тарелку.
- Дегазировать смесь в эксикаторе под вакуумом, пока все пузырьки воздуха не будут удалены.
Примечание: Подготовьте достаточное количество PDMS для всех последующих шагов. Здесь ниже, акроним "PDMS" всегда относится к дегазированной 10: 1 PDMS: отверждение агента смеси, который был подготовлен в пунктах 2.1 и 2.2. - Налейте Дегазированную-смесь до высоты примерно 1 мм над основной пластины. Дега еще раз, по крайней мере40 мин, чтобы удалить все пузырьки воздуха выше пластины и свести к минимуму пузырьки ниже пластины.
Примечание: Убедитесь, что пластина находится как можно ближе к нижней части пластины. При необходимости нажмите пластины аккуратно на дно с помощью 2 перемешивания палочки и Дега еще раз. - Выпекать при температуре 65 ° С в течение 20 мин в естественной конвекционной печи.
Примечание: Через 20 мин PDMS затвердевает и почти полностью излечена. В то время как более продолжительное время выпечки можно выпечки в течение 20 мин экономит время и улучшает адгезию второго слоя PDMS (см ниже) к первому. - Файл секции ствола пластиковой 2 мл шприц с помощью тонкой зернистости наждачной бумагой, чтобы улучшить соблюдение PDMS. Кроме того, с помощью наждачной бумагой, чтобы сгладить основание цилиндра шприца, помещая наждачную бумагу на плоской поверхности и сдвинув основание цилиндра шприца поверх него. Очистите шприц с помощью сжатого воздуха.
- Поместите секцию цилиндр шприца поверх первого слоя PDMS с LARGE отверстие, обращенное к поверхности PDMS, и заливают второй слой PDMS поверх первого до высоты ~ 5 мм, и дегазировать PDMS еще раз в эксикаторе.
Примечание: Второй PDMS слой следует вылить из малого контейнера вокруг ствола, и не должны входить в нее. - Запекать всю установку при 65 ° С в течение по меньшей мере 2 ч в естественной конвекционной печи.
Примечание: Там нет необходимости удерживать ствол на месте в ходе процесса вулканизации, так как вес PDMS прижимаясь к широкой базе ствола удерживает ствол плотно на месте. - Вырезать через форму PDMS вокруг узорчатой области задающего пластины скальпелем. При резке, скальпель должен слабо прикасаться к поверхности пластины. Затем, осторожно вставьте тонкий инструмент, таких как вафельные щипцов в паз, созданный скальпелем, и слезть, отлитые из PDMS мастер пластины.
- Поместите бросок на мягкую поверхность, покрытую алюминиевой фольгой с узорной сторонойлицевой стороной вверх (то есть., ствол должен свисать с края стола), и пробить отверстие в PDMS на впускную камеру и впускной канал с помощью трепанобиопсия 1 мм.
- Пальто чистое предметное стекло с (дегазацию) 10: 1 PDMS: отверждение агента смесь с помощью отжима для нанесения покрытий, запрограммированный при 3000 оборотах в минуту в течение 30 сек, и выпекать в течение> 1 часа при 65 ° С. Затем очистите слайд и PDMS отлиты с использованием прозрачной клейкой ленты.
- Обработать поверхность PDMS формы и PDMS покрытием стекло с O 2 плазмы (например, с использованием ручных коронный протравливатель) в течение 1 мин, а затем аккуратно нажмите поверхности вместе и выпекать при температуре 65 ° С в течение ночи (O / N) ,
3. Заполнение устройства и Actuation
- Смешать воды, подвешенная флуоресцентные частицы полистирола с водой и глицерином в стеклянную пробирку, чтобы получить 64/36 (об / об) смесь глицерина / воды с 0,25% (вес / вес) частиц ..
- Поместите каплю раствора глицерина в верхней впускного канала и каплю DI-Ватаэр на входе камеры, а затем поместите аппарат внутри эксикаторе и вакууме в течение ~ 5 мин.
Примечание: Перед тем как отпустить вакуумный ожидание пузырьков, которые образуются в капли раствора глицерина и дистиллированной воды для поп-музыки. После вакуумного выпуска жидкости всасываются в пустоты внутри устройства. Если остаточный воздух остается внутри каналов, устранить ее путем применения внешнего давления на жидкости (например, с помощью шприца) и позволяя воздуху диффундировать в PDMS. - Вводят ~ 2 мл дистиллированной воды в верхнюю камеру (т.е. цилиндр шприца, рис. 2 , б) до тех пор, пока не будет полностью заполнен водой. Затем накрыть верхнюю камеру с 19 калибра тупым наконечником шприца, отрезать кончик другого тупого 19 калибра наконечника шприца и вставьте этот наконечник на впускную сторону камеры. Соедините оба подсказки шприца 1 мл шприца через тонкую тефлоновые трубки и разъем Т-образную форму.
Примечание: Убедитесь, что 1 мл шприц, тефлоновые трубки, Т-образный разъем и верхней палаты по (2 мл шприц Баррэль) все заполнены водой без пузырьков. Это может быть достигнуто путем открытия точек соединения, толкая воду через пустые секции НКТ и повторным подключением точки соединения. - Подключение 1 мл шприц с насосом со шприцем заранее запрограммированы , чтобы имитировать, например , тихий приливные дыхательного цикла (с периодом Т = 4 сек) , изготовленным из линейных рамп, то есть, от нуля до 1,8 мл / мин в течение 1 сек, из 1,8 мл / мин до -1,8 мл / мин в течение 2 сек и от -1,8 мл / мин до нуля в течение 1 сек.
4. Визуализация потока Эксперименты: микрочастицы Velocimetry Image (μPIV)
- В то время как устройство работает приводится в действие, получаем серию 9 - 12 фазовой автоподстройки, двойной каркасных изображений частиц посеяны потока с использованием микро-частиц изображения велосиметрии системы (μPIV), состоящий, например, из двойной рамы-МУЛЬТИЭКСПОЗИЦИЯ CCD камеры (например., 1600 × 1200 пикселей для достижения достаточной разрешающей способностью ), двойной импульсный Nd-YAG лазера (длина волны: 532 нм, выходная энергия: 400 мДж, длительность импульса: 4 нсек), а инвертированный микроскоп.
Примечание: Такая система способна получать пары кадров с отставанием до нескольких микросекунд между первым и вторым кадрами. Для достижения фазовой автоподстройки изображения двойной кадр, полезно приобрести двойную серию кадров на , например., 10 Гц (пары кадров отделены друг от друга 0,1 сек друг от друга). Затем данные могут быть реорганизованы таким образом , что все пары кадров, разделенных полным временем цикла (здесь Т = 4 сек) образуют новый временной ряд. Получение изображений должно быть повторено несколько раз при изменении времени задержки между первым и вторым кадрами в каждой паре кадра (то есть., 100 мкс до 0,1 сек) для решения различных областей потока внутри альвеолярной полости.
Примечание: альтернативные настройки в отношении наилучших комбинаций систем сбора изображений (т. Е, камера) и освещение источников (например, лазеры) изображения , такиемикропотоки также доступны 34, 35. - Используйте алгоритм суммы чисел корреляции для вычисления фазовой автоподстройки вектора скорости карты результирующего поля потока из серии изображений для каждого временного лага, используемого. Повторите этот процесс несколько раз с переменным по времени задержки между первым и вторым кадрами в каждом кадре пары для решения различных областей потока внутри альвеолярной полости. Затем с помощью программы анализа данных для склеивать отдельные карты потока в полной и высокой подробные карты схем потока путем усреднения перекрывающихся точек 33 данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Системы автоматизированного проектирования (САПР) и микроскопа изображения в пробирке ацинозной платформы представлены на рис. 1. Биомиметический модель ацинарной имеет пять поколений ветвления прямоугольных каналов выстланы альвеолярного типа цилиндрических полостей (рис. 1). Здесь модели поколений пронумерованы от 1 поколения (для наиболее проксимального поколения) к поколению 5 (для наиболее дистальной поколения). Обратите внимание, что только впускной канал, ведущий к генерации 1 открыт для внешней среды посредством отверстия в PDMS. В 16 протоки , ведущие от поколения 5 остается закрытым для воздуха (рис. 1а). Модулируя периодически давление воды в камерах, тонкие стенки, образующие альвеолярных полостей и каналов циклически деформируется. В то же время, потолок дыхательных путей деформируется в вертикальном направлении посредством дополнительной камеры, расположенной над водой протоков; Для создания этой верхней камеры впростым способом, без получения дополнительного слоя микрожидком ствол шприца был погружен внутри PDMS перед тем сшивания. Это привело к PDMS слой примерно 1 мм , отделяющих Поликарбонат воздуховоды и верхнюю камеру для воды (см. Фиг.2).
Камеры воды соединены с насосом со шприцем запрограммированного повторить серию линейно рампа скорости потока , чтобы имитировать нормальный к тяжелым приливной дыхательного сценария среднего взрослого человека с временем цикла 4 сек (Т). Это приводит к периодическому снижению и увеличению объема воздушной трассы; так как выпускные отверстия уплотняются и только на входе открыт для окружающей среды, жидкость внутри протоков вдыхается и выдыхается из устройства через впускное отверстие, по аналогии с естественным процессом дыхания. Здесь, в дыхательных путях каналы были заполнены раствором глицерина, засеянного с люминесцентными частицами (см Protocol) и микро изображения частиц велосиметрии (μPIV) был использован для отображения resulti нг поля потока через дерево дыхательные пути 33.
Нормированная величина скорости (и х / х, не более) в Измерялись (то есть., Осевое) направление по ширине каналов показана на рис. 3. Результаты представлены на пиковой скорости ингаляции для каждого из поколений 5 устройств, и представляют собой 2D проекцию потока внутри тонкого сляба вблизи канала срединной плоскости. Для сравнения, аналитическое решение ламинарного потока стационарного для бесконечно длинного канала 36 также представлены на рис. 3.
На рисунке 4 показано упорядочить модели и скорости в пределах величины альвеолярных полостей в срединной плоскости дыхательных путей при максимальной ингаляции. На рисунке 4а, б и изображают ацинарные поколения 1, 3 и 5, соответственно.
1 цифра "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53588 / 53588fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Микрожидкостных Модель ацинарными Tree Network (а) САПР чертеж полного устройства.. (Б) Крупный план снимки структуры ацинарной дерева показаны каналы, камеры, а тонкие стенки, разделяющие их. Фиолетовые стрелки указывают на соответствующие места и положительных у -направлений профилей потока , представленных на рис. 3. Адаптировано с разрешения исх. 33.
Рисунок 2:. САПР Проектирование микрожидкостных устройств (а) Прерывистые линии обозначают трубки , идущие от боковых и верхних камер к шприцу насосом через Т-образный соединитель с. (Б) срезом через центр устройства, иллюстрирующего расположение шприца в гипсе PDMS.dapted с разрешения исх. 33.
Рисунок 3: Железистый скоростях потока Нормированные профили скоростей протоковой (и х / х, максимум) , извлекаемые из PIV по ширине канала в течение нескольких поколений от 1 до 5 в местах , показанных на рис.. 1, у = 0 совпадает с нейтралью месте через канал и и х, макс = 0,0104 м / сек здесь соответствует скорости пика , измеренного в вдоль потока устройства генерации 1. Измерения PIV показаны здесь на пике вдоха (т = 0,6 сек) и черная линия соответствует аналитическому профилю скорости для ползучей потока внутри прямоугольного канала с W D = 345 мкм и <EM> ч = 92 мкм. Адаптировано с разрешения исх. 33.
Рисунок 4: Velocity Магнитуды и соответственные образы Streamline. Данные получены из микро-PIV для проекции потока добываемой на средней плоскости альвеолы , расположенной в поколениях устройства 1, 3 и 5. Течения показаны приблизительно пик ингаляции (т = 0,6 сек). Скоростные величины приведены в логарифмической шкале. Адаптировано с разрешения исх. 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Отличительным признаком микрожидкостных ацинозной платформы, представленной здесь является его способность воспроизводить физиологически реалистичные движения с дыханием, которые приводят к физиологическим профилей потока и скоростей внутри ацинарных протоков и в альвеолах. Поскольку микроканалов производятся с относительно низким соотношением сторон (то есть., Ш г / ч ≈ 3,9, где W d является ширина воздуховода и ч является высота канала), измеренные потоки показывают больше пробкообразной характеристик потока по сравнению с предполагаемые профили параболические потока, которые будут существовать в круглых каналах. Тем не менее, измеренные скорости находятся в пределах физиологической нормы; установлено , что характерное безразмерное число Рейнольдса, сравнивая инерционные вязких сил, дает максимум примерно 0,01 , соответствующий середине или в дистальных отделах ацинарными, после полуэмпирических оценок 2.
Содержание "> Здесь число Рейнольдса определяется как Re = V х, макс D решение ч / ν глицерина, где Ù х, макс средняя скорость вдоль потока поперек канала срединной плоскости в момент скорости максимального потока, D ч является гидравлический диаметр воздуховода и ν растворе глицерина является кинематическая вязкость раствора глицерина , используемого для визуализации потока , который был согласован с кинематической вязкости воздуха при температуре ~ 24 ° C (v воздуха = 1,55 × 10 -5 м 2 / сек, ν растворе глицерина = 1,51 × 10 -5 м 2 / сек). Кроме того, снижение величины потока примерно наблюдается в два раза после каждого бифуркацией , как и ожидалось отДихотомический ветвящиеся структуры модели ацинозной. А именно, этот каскад скоростей потока является важной особенностью ацинарными потоков в дыхательных путях деревьев.Профили потока вблизи и внутри альвеолярных полостей (рис. 4) показывают , что протоковых скорости постепенно снижаются в направлении более глубоких ацинарными поколений. Кроме того, величины потока падение круто по открытию альвеол, что приводит к скорости потока, которые два-три порядка медленнее внутри альвеол по сравнению с протоках; такие топологии потока были ранее сообщалось в нескольких численных исследованиях 1, 9, 15 Кроме того, структура потока существенно изменяться от одного поколения ацинозной к другому, как и было предсказано в моделировании 7, 15:. в то время как поколение 1 имеет зону рециркуляции , которая примерно совпадает с центр альвеол (рис. 4, слева), поколение 3 характеризуется зоны рециркуляции , которая смещена в сторону проксимального сторонеальвеолы с более открытой рисунком обтекаемой (рис. 4, средний). Наконец, радиальные линии тока, не имеющие зоны рециркуляции наблюдаются в поколении устройства 5 (рис. 4, справа). Насколько известно авторам, это первый раз, что существование широкого спектра альвеолярных схем потока экспериментально захвачен.
Успех предложенного метода зависит от нескольких важных шагов в протоколе микроструктур. Во-первых, чтобы предотвратить тонкие стенки PDMS от разрыва при освобождении от основной пластины травленую рисунок на поверхности пластины должны иметь прямые стены и не должны придерживаться отвержденных PDMS. Поэтому настоятельно рекомендуется производить с использованием пластин DRIE из пластины с SOI , как описано в Фишлер и др. (2013). Такой мастер пластина прочен и может быть легко покрыта антиприваривание слоем либо silanizing поверхности , как описано в Фишлера и др. (2013) , или путем обеспечения тшляпа последний шаг в процессе DRIE является то , что пассивации с CF 4. Другим важным шагом является подача (шаг 2.5) и вложения (шаг 2.6) цилиндра шприца, чтобы создать верхнюю палату. Пузырьки воздуха пойманы между основанием шприца и первый слой PDMS может значительно уменьшить целостность и долговечность изготовленного устройства. Для того, чтобы предотвратить образование пузырьков, крайне важно, чтобы основание цилиндра шприца является плоской и равномерно подается.
В то время как конструкция позволяет изготовление двухслойного-устройства, используя только один мастер-пластины, модифицированный метод может включать в себя создание дополнительного PDMS слой, содержащий круговую выемку, чтобы образовать верхнюю камеру. Для этого второго слоя PDMS дополнительный мастер пластина показывая круговой гребень может быть изготовлен с использованием стандартных SU-8 фотолитографии. Дополнительная модификация протокола может включать в себя другой способ для склеивания PDMS, который не требует коронный протравливатель. Придерживаться пресс-формы PDMS к стеклуслайд, первый слой предметное стекло, как описано в шаге 2.10 Протокола, но использовать 5: 1 вместо 10: 1 PDMS: массовое соотношение отверждения агента. Выпечка стекла с покрытием в течение 15 мин при 65 ° С в естественной конвекционной печи, нажмите плесень PDMS к PDMS из покрытого стекла, и выпекать в течение ночи при 65 ° С в естественной конвекционной печи.
По случаю утечка жидкости с поверхности склеивания между PDMS формы и стекла могут быть приняты следующие меры: (1) убедитесь, что корона Термист производит электрические искры во время лечения, если нет, то увеличить выходное напряжение, (2) продлить время для обработки с коронным протравливателя и (3) использование альтернативного способа скрепления формы PDMS к стеклу (см пункт выше). Часто вода может протекать через соединение тонкого тефлоновые трубки к входу камеры. Чтобы обойти такую утечку, убедитесь, что 19-го калибра тупой шприц наконечник используется для подключения тефлоновой трубки к входному отверстию. В случае утечки воды между формой и го PDMSе верхней камеры (цилиндра шприца 2 мл), убедитесь, что основание цилиндра шприца был правильно подан (см шаг 2.5 Протокола), а также о том, что второй слой PDMS влили достаточно высока (~ 5 мм выше первого PDMS слоя ).
Следует отметить, что степень деформации стенки сильно зависит от механических свойств PDMS. Незначительные изменения в процедуре подготовки устройств может привести к значительной вариабельности измеренных скоростей между различными устройствами. Для того, чтобы обеспечить использование воспроизводимости условий максимальные постоянные препарата (влажность, выпечки и т.д. раз.). Кроме того, тонкая настройка изменения объема во время устройства приведения в действие может быть достигнуто путем визуализации верхней поверхности каналов с использованием фазово-контрастной микроскопии и регулирования скорости пандусы шприца насоса таким образом, чтобы верхняя поверхность канала отклоняется на заданное расстояние как измерено Зет движение предметный столик микроскопа.
Важным Лимитание текущего метода заключается в том , что точные морфологические характеристики (например, анатомию, морфометрия) легких не могут быть воспроизведены точно. В самом деле, плоская конструкция модели ацинозной не учитывает, например некомпланарный ацинарных бифуркаций и отношение альвеолярной к объему протоковой значительно ниже , чем измеренная в естественных условиях значения 37. Кроме того, упрощенная геометрия Микрожидкостных захватывает только небольшую часть полной ацинусе. Несмотря на эти ограничения, настоящая модель способна воспроизводить ожидаемые структуры потока и скорости непосредственно в истинных анатомических масштабах длины, и, следовательно, представляет собой ценную платформу для тестирования ацинарной явлений переноса.
В заключение, признакам микрофлюидальные модели легочных ацинусе показывают большие перспективы в качестве инструмента в пробирке для количественных исследований дыхательной ацинарными потоков , имитирующих образцы дыхания. Здесь простая модель ацинарной состоит из пяти гenerations расширения и подрядной Поликарбонат каналов, таким образом, воспроизводя некоторые из важных базовых свойств потока, которые предположительно существуют в ацинарных области легких. Поток визуализации, с помощью микро-PIV, в пределах альвеолярного полости обеспечивает впервые экспериментальные данные диапазона сложных рециркуляционного и радиальных альвеол течет вдоль дерева ацинозной. Этот Микрожидкостных подход позволяет изготовление сложных ацинарных структур с подвижными стенками следующих относительно простая процедура, и предлагает привлекательную альтернативу для реализации широкомасштабных моделей ацинарными. В частности, с основным преимуществом доставки модели в масштабе один к одному, правда динамика вдыхаемый ацинарной частиц могут быть исследованы без дальнейшей необходимости динамического согласования подобия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent | Dow Corning | (240)4019862 | Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit |
| Plastipak 2 ml syringe | BD | 300185 | |
| Norm-Ject Luer slip 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | |
| 1 mm Biopsy punch | Kai Medical | BP-10F | |
| Laboratory Corona Treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| PHD Ultra Syringe pump | Harvard apparatus | 703006 | |
| Dyed red rqueous fluorescent particles | Thermo-Scientific | Uncatalloged 0.86 µm beads were used | |
| Glycerin AR | Gadot | 830131320 | |
| FlowMaster MITAS micro-particle image velocimetry (µPIV) system | LaVision | 1108630 |
References
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z. Airflow and Particle Transport in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 301-334 (2010).
- Sznitman, J. Respiratory microflows in the pulmonary acinus. J. Biomech. 46 (2), 284-298 (2013).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Gas and aerosol mixing in the acinus. Respir. Physiol. Neurobiol. 163 (1-3), 139-149 (2008).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted Drug-Aerosol Delivery in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10 (1), 195-220 (2008).
- Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Schulz, H., Takenaka, S., Butler, J. P., Henry, F. S., Tsuda, A. Nanoparticle delivery in infant lungs. Proc. Natl. Acad. Sci. 109 (13), 5092-5097 (2012).
- Sznitman, J., Heimsch, F., Heimsch, T., Rusch, D., Rosgen, T. Three-Dimensional Convective Alveolar Flow Induced by Rhythmic Breathing Motion of the Pulmonary Acinus. J. Biomech. Eng. 129 (5), 658-665 (2007).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Chaotic mixing of alveolated duct flow in rhythmically expanding pulmonary acinus. J. Appl. Physiol. 79 (3), 1055-1063 (1995).
- Henry, F. S., Butler, J. P., Tsuda, A. Kinematically irreversible acinar flow: a departure from classical dispersive aerosol transport theories. J. Appl. Physiol. 92 (2), 835-845 (2002).
- Kumar, H., Tawhai, M. H., Hoffman, E. A., Lin, C. L. The effects of geometry on airflow in the acinar region of the human lung. J. Biomech. 42 (11), 1635-1642 (2009).
- Lee, D. Y., Lee, J. W. Characteristics of particle transport in an expanding or contracting alveolated tube. J. Aerosol Sci. 34 (9), 1193-1215 (2003).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. I. Diffusional deposition in the absence of gravity. J. Appl. Physiol. 76 (6), 2497-2509 (1994).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. II. Gravitational sedimentation and inertial impaction. J. Appl. Physiol. 76 (76), 2510-2516 (1994).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol bolus dispersion in acinar airways—influence of gravity and airway asymmetry. J. Appl. Physiol. 113 (3), 442-450 (2012).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol deposition characteristics in distal acinar airways under cyclic breathing conditions. J. Appl. Physiol. 110 (5), 1271-1282 (2011).
- Heimsch, J., Sznitman, T., Wildhaber, J. H., Tsuda, A., Rösgen, T. Respiratory Flow Phenomena and Gravitational Deposition in a Three-Dimensional Space-Filling Model of the Pulmonary Acinar Tree. J. Biomech. Eng. 131 (3), 031010 (2009).
- Litzlbauer, H. D., Korbel, K., Kline, T. L., Jorgensen, S. M., Eaker, D. R., Bohle, R. M., Ritman, E. L., Langheinrich, A. C. Synchrotron-Based Micro-CT Imaging of the Human Lung Acinus. Anat. Rec. Adv. Integr. Anat. Evol. Biol. 293 (9), 1607-1614 (2010).
- Tsuda, A., Filipovic, N., Haberthür, D., Dickie, R., Matsui, Y., Stampanoni, M., Schittny, J. C. Finite element 3D reconstruction of the pulmonary acinus imaged by synchrotron X-ray tomography. J. Appl. Physiol. 105 (3), 964-976 (2008).
- Berg, E. J., Weisman, J. L., Oldham, M. J., Robinson, R. J. Flow field analysis in a compliant acinus replica model using particle image velocimetry (PIV). J. Biomech. 43 (6), 1039-1047 (2010).
- Sznitman, J., Sutter, R., Altorfer, D., Stampanoni, M., Rösgen, T., Schittny, J. C. Visualization of respiratory flows from 3D reconstructed alveolar airspaces using X-ray tomographic microscopy. J. Vis. 13 (4), 337-345 (2010).
- Henry, F. S., Haber, S., Haberthür, D., Filipovic, N., Milasinovic, D., Schittny, J. C., Tsuda, A. The Simultaneous Role of an Alveolus as Flow Mixer and Flow Feeder for the Deposition of Inhaled Submicron Particles. J. Biomech. Eng. 134 (12), 121001 (2012).
- Chhabra, S., Prasad, A. K. Flow and Particle Dispersion in Lung Acini: Effect of Geometric and Dynamic Parameters During Synchronous Ventilation. J. Fluids Eng. 133 (7), 071001 (2011).
- Cinkotai, F. F. Fluid flow in a model alveolar sac. J. Appl. Physiol. 37 (2), 249-251 (1974).
- Karl, A., Henry, F. S., Tsuda, A. Low reynolds number viscous flow in an alveolated duct. J. Biomech. Eng. 126 (4), 420-429 (2004).
- Tippe, A., Tsuda, A. recirculating flow in an expanding alveolar model: experimental evidence of flow-induced mixing of aerosols in the pulmonary acinus. J. Aerosol Sci. 31 (8), 979-986 (2000).
- Berg, E. J., Robinson, R. J. Stereoscopic particle image velocimetry analysis of healthy and emphysemic alveolar sac models. J. Biomech. Eng. 133 (6), 061004 (2011).
- Ma, B., Ruwet, V., Corieri, P., Theunissen, R., Riethmuller, M., Darquenne, C. CFD simulation and experimental validation of fluid flow and particle transport in a model of alveolated airways. J. Aerosol Sci. 40 (5), 403-414 (2009).
- Kumar Mahto, S., Tenenbaum-Katan, J., Sznitman, J. Respiratory Physiology on a Chip. Scientifica. 2012, e364054 (2012).
- Huh, D., Fujioka, H., Tung, Y. C., Futai, N., Paine, R., Grotberg, J. B., Takayama, S. Acoustically detectable cellular-level lung injury induced by fluid mechanical stresses in microfluidic airway systems. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (48), 18886-18891 (2007).
- Song, Y., Baudoin, M., Manneville, P., Baroud, C. N. The air–liquid flow in a microfluidic airway tree. Med. Eng. Phys. 33 (7), 849-856 (2011).
- Tavana, H., Huh, D., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microfluidics, Lung Surfactant, and Respiratory Disorders. Lab Med. 40 (4), 203-209 (2009).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Pihl, J., Sinclair, J., Sahlin, E., Karlsson, M., Petterson, F., J, O. lofsson, Orwar, O. Microfluidic Gradient-Generating Device for Pharmacological Profiling. Anal. Chem. 77 (13), 3897-3903 (2005).
- Fishler, R., Mulligan, M. K., Sznitman, J. Acinus-on-a-chip: A microfluidic platform for pulmonary acinar flows. J. Biomech. 46 (16), 2817-2823 (2013).
- Lindken, R., Rossi, M., Grosse, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (microPIV): recent developments, applications, and guidelines. Lab. Chip. 9 (17), 2551-2567 (2009).
- Wereley, S. T., Meinhart, C. D. Recent Advances in Micro-Particle Image Velocimetry. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 557-576 (2010).
- Bruus, H. Theoretical Microfluidics. Oxford Master Series in Condensed Matter Physics. , (2008).
- Haefeli-Bleuer, B., Weibel, E. R. Morphometry of the human pulmonary acinus. Anat. Rec. 220 (4), 401-414 (1988).
