Abstract
Kvantifiera andningsflödesegenskaper i lung acinära djup och hur de påverkar transport inhalerad aerosol är kritisk till att optimera läkemedels inandning tekniker samt att förutsäga deponeringsmönster av potentiellt giftiga luftburna partiklar i lungblåsorna. Här är mjuk litografitekniker som används för att tillverka komplexa körtelliknande luftvägsstrukturer på sanningsenliga anatomiska längdskalor som reproducerar fysiologiska acinar strömningsfenomen i ett optiskt tillgängligt system. Mikroflödessystem enhet har 5 generationer av bifurcating i celler kanaler med jämna mellanrum expanderande och upphandlande väggar. Vägg aktivering uppnås genom att ändra trycket inuti vattenfyllda kammare som omger den tunna PDMS acinar kanalväggarna både från sidorna och toppen av enheten. Till skillnad från vanliga flerskiktsmikroflödessystem enheter, där det krävs stapling av flera PDMS formar, är en enkel metod som presenteras för att tillverka toppenkammare genom att bädda pippartiet av en spruta in i PDMS formen. Denna nya mikroflödesinställnings levererar fysiologiska andningsrörelser som i sin tur ger upphov till karakteristiska acinära luftkapacitet. I den aktuella studien var mikropartikel bild Velocimetry (μPIV) med flytande suspenderade partiklar som används för att kvantifiera en sådan luftflöden baserat på hydrodynamisk likhet matchning. Den god överensstämmelse mellan μPIV resultat och förväntade acinar flödesfenomen antyder att mikroflödes plattformen kan tjänstgöra inom en snar framtid som en attraktiv in vitro verktyg för att undersöka direkt luftburna representativ partikeltransport och deponering i körtel regionerna i lungorna.
Introduction
En detaljerad kvantifiering av luftvägsflödesdynamik i den distala, är av största vikt i att förstå luftflöde blandning i lung acinus och förutsäga ödet för inhalerade aerosoler i den djupaste luftvägarna 1-3 i celler regioner av lungorna. Den sistnämnda aspekten är särskilt oroande när han talade å ena sidan riskerna med inhalerade förorenande partiklar eller omvänt att söka nya strategier för förbättrad och riktad läkemedelstillförsel av inhalerade läkemedel till lokala lung platser 4, 5 samt för systemisk leverans.
Hittills andnings flöden i de djupa lung acinära regioner har typiskt undersökts in silico med hjälp av Computational Fluid Dynamics (CFD) eller alternativt in vitro med skalade upp experimentmodeller efter hydrodynamiska likheten matchning. Under de senaste decennierna har CFD metoder allt större utsträckning för att studera acinar strömningsfenomen, från single alveolära modeller 6, 7 och i celler kanaler 8-12 till mer genomarbetade in silico-modeller som fångar anatomiskt realistisk acinar trädstrukturer med flera generationer i celler kanaler och upp till flera hundra enskilda alveolerna 13-15.
Tillsammans har numeriska ansträngningar varit avgörande i att belysa den roll och inflytande vägg rörelse under andning rörelser på efterföljande acinar luftflödesmönster. I avsaknad av andningsrörelse, flödar statisk alveoler funktion recirkulerande inom sina hålrum som uppvisar ingen konvektiva luftväxling mellan acinar kanalen och alveol 6, 7; Med andra ord skulle alveolära flöden vara helt isolerad från flöden inom körtel träd och utbyte av luft skulle leda unikt från diffusiva mekanismer. Med förekomsten av cykliska utökningar av den alveolära domänen emellertid alveolära flödes topologier drastiskt modifieras och Resulting strömningsmönster inuti alveolerna är intimt knuten till platsen för en alveol längs acinar träd (eg., proximal vs distala generationer).
Framför allt har det varit en hypotes i simuleringar som alveolära strömningsmönster är starkt påverkade av förhållandet mellan alveolär att duktal flödeshastigheter så att proximala generationer av lung acinar träd, där detta förhållande är relativt stor efter mass bevarande över en trädstruktur, funktion komplexa recirkulerande strömmar inuti alveolära hålrum med oåterkalleliga vätske pathlines. Med varje djupare acinar generation, förhållandet mellan alveolär till duktala flödeshastigheter gradvis minskar så att distala acinar generationer uppvisar flera radiella liknande strömlinjer som påminner om enkla fyllningar och deflations av en ballong. Med framsteg inom moderna avbildningsmetoder, lungbilddata 16, 17 av gnagare, inklusive råtta och mus, har gett upphov till några av de första CFD simulheten av anatomiskt rekonstruerade acinar flöden i rekonstruerade alveoler. Trots en sådan lovande framsteg, dessa nya studier fortfarande begränsad till att ta itu med luftflödes fenomen i terminal alveolära säckarna bara 18, 19 eller några alveoler kring en enda kanal 20. Som ett resultat förblir state-of-the-art undersökningar av andningsströmningsfenomen i acinus domineras av studier som fokuserar på generiska anatomiskt inspirerade geometrier av acinar miljön 2.
På den experimentella sidan har olika inställningar som presenterar en luftväg med en eller flera alveoler utvecklats under åren 21-24. Men det finns inga experimentella modeller av bifurcating i celler i luftvägarna som kan imitera fysiologiska andning genom att expandera och kontrakt i en andningsliknande sätt. Med tanke på bristen på attraktiva experimentella plattformar till hands, förblir studiet av acinar transportfenomen begränsad när det gäller validating computational studier och kritiskt, finns det fortfarande en brist av experimentella data tillgängliga. . Under de senaste åren, Ma et al (2009) har konstruerat en skalas upp styv vägg modell av en acinus bestående av tre körtel generationer; Bristen på väggen rörelse i denna modell begränsas dess förmåga att fånga realistiska alveolära flödesmönster i andningsförhållanden.
Andra skalas upp experiment inklusive en rörlig vägg modell baserad på anatomiska data från gjutna replik har nyligen infört 25; men eftersom modellen endast fångat de två sista acinära generationer (dvs.., terminal SAC), misslyckades det att fånga de komplexa cirkulationsflöden som kännetecknar mer proximala acinära generationer. Dessa senare exempel på uppskalade experiment understryker ytterligare de pågående begränsningarna med sådana metoder. Närmare bestämt har ingen befintlig experiment hittills visat hypotes övergången från recirkulerande till radiell strömmar längsden acinus och därigenom bekräfta numeriska förutsägelser om flödes topologier hypotes att existera i reala lung acinar träd 7, 15. Kanske mest kritiskt, är skalade upp experiment ytterst begränsad utreda inhalerad partikel transport- och deponerings dynamik 26 på grund av svårigheter i att matcha alla relevanta icke -dimensionella parametrar (eg., partikelspridning, en kritisk transportmekanism för submikrona partiklar är helt försummas).
Med pågående experimentella utmaningar, nya experimentella plattformar som möjliggör undersökningar av andningsluftflöden och partikeldynamik i komplexa rörliga väggar körtel nätverk söks. Här, en anatomiskt inspirerad in vitro acinar modell införs. Denna mikroflödes plattform härmar lung acinar strömmar direkt på den representativa acinar skala, och breddar det växande utbudet av lungmikroflödes modeller 27, inklusive bronkial flytande plug-floWS 28-30 och alveolär kapillär barriär 31.
Nämligen den nuvarande designen presenterar en förenklad fem generation i celler i luftvägarna träd med cykliskt expanderande och upphandlande väggar, där cykliska rörelser uppnås genom att reglera trycket inuti en vattenkammare som omger de tunna PDMS sidoväggar och där den övre väggen deformeras med ytterligare vatten kammaren sitter direkt ovanför acinar strukturen. Till skillnad från vanliga flerskikts mikrofluidikanordningar är denna kammare helt enkelt bildas genom att bädda pippartiet hos en spruta inuti PDMS Device, och inte kräver framställning av en ytterligare PDMS mögel.
Den miniatyriserade tillvägagångssätt presenteras här erbjuder ett enkelt och mångsidiga medel för att återge komplicerade acinar strukturer med rörliga väggar jämfört med skalade upp modeller samtidigt fånga de underliggande egenskaperna hos acinar flödesmiljön. Denna plattform kan användas för flow visualisering med hjälp av vätske suspenderade partiklar inne i luftvägarna (se Representativa resultat nedan). Inom en snar framtid, kommer modellen att användas med luftburna partiklar för att studera inhalerade körtelpartikeldynamik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. master Fabrication
- Använd djup reaktiv jonetsning (DRIE) av en Silicon On Insulator (SOI) wafer att tillverka en master kiselskiva som beskrivs i tidigare arbeten 32, 33.
OBS: DRIE föredrages till standard SU-8 mikrobearbetning på grund av de höga sidoförhållande egenskaper (40 ^ m breda och 90 um djupa diken).
2. Gjutning och försegling av mikroflödessystem enhet
- Blanda PDMS och härdningsmedel vid en 10: 1 viktförhållande inuti en ren liten behållare såsom en plast vågskål.
- Avlufta blandningen i en torkapparat under vakuum tills samtliga luftbubblor avlägsnas.
OBS: Förbered tillräckligt PDMS för alla efterföljande steg. Här nedan förkortningen "PDMS" hänvisar alltid till den avgasade 10: 1 PDMS: härdning-medelsblandning som framställdes i steg 2.1 och 2.2. - Häll avgasad-blandningen till en höjd av cirka 1 mm ovanför master wafer. Degas gång för åtminstone40 minuter för att avlägsna alla luftbubblor ovanför wafern och minimera bubblorna nedan wafern.
OBS: Se till att den tunna skivan är så nära som möjligt till botten av plattan. Om det behövs trycker skivan försiktigt till botten med 2 omrörnings pinnar och avgasa igen. - Baka vid 65 ° C under 20 min i en naturlig konvektionsugn.
OBS: Efter 20 min PDMS är härdad och nästan fullständigt härdade. Medan en längre gräddningstiden är möjlig bakning under 20 min sparar tid och förbättrar vidhäftningen av det andra PDMS skiktet (se nedan) till den första. - Fila fat del av en plast 2 ml spruta med en fin grus sandpapper för att förbättra efterlevnaden av PDMS. Dessutom använder sandpapper för att platta till basen av sprutcylindern genom att placera sand papper på en plan yta och glidande basen av sprutcylindern på toppen av det. Rengör sprutan med hjälp av tryckluft.
- Placera pippartiet av sprutan ovanpå det första PDMS skiktet med laRGE öppning vänd mot ytan av PDMS, och häll ett andra skikt av PDMS på toppen av den första en till en höjd av ~ 5 mm, och avlufta PDMS återigen i en exsickator.
OBS: bör hällas Det andra PDMS skiktet från den lilla behållaren runt tunnan, och bör inte komma in i den. - Baka hela installationen vid 65 ° C under minst 2 h i en naturlig konvektionsugn.
OBS: Det finns inget behov av att hålla cylindern på plats under härdningsprocesserna eftersom vikten av PDMS som pressar mot den breda basen av cylindern håller pipan stadigt på plats. - Skär genom PDMS mögel runt mönstrade regionen masterskiva med hjälp av en skalpell. Samtidigt som man skär ska skalpell svagt röra vid ytan av skivan. Sedan försiktigt in ett tunt verktyg som rån tång i skåran som skapats av skalpell, och dra av PDMS avgivna från masterskiva.
- Placera gjutna på en mjuk yta täckt med aluminiumfolie med den mönstrade sidanvänd uppåt (dvs., bör pipan hänger från kanten av bordet), och stansa ett hål i PDMS vid inlopp kammarens inlopp och kanal med användning av en 1 mm biopsistans.
- Coat en ren glasskiva med en (avgasad) 10: 1 PDMS: härdning-agent blandning med hjälp av en spinnbeläggnings programmerad vid 3000 rpm under 30 sekunder, och grädda i> 1 timme vid 65 ° C. Sedan rengör bilden och PDMS kasta med hjälp av genomskinlig tejp.
- Behandla ytan hos PDMS mögel och PDMS belagd glasskiva med O 2 plasma (t.ex., med användning av en handhållen coronabehandlingsanordning) under 1 min, och sedan försiktigt pressa ytorna tillsammans och baka vid 65 ° C över natten (O / N) .
3. Enhets Fyllning och Aktivering
- Blanda vatten suspenderade fluorescerande polystyrenpartiklar med vatten och glycerol i en glasflaska för att erhålla en 64/36 (vol / vol) glycerol / vatten-blandning med 0,25% (vikt / vikt) partiklar ..
- Placera en droppe av glycerollösning ovanpå kanalinloppet och en droppe DI water på kammarens inlopp, sedan placera apparaten i en exsickator och vakuum under ~ 5 min.
OBS: Innan du släpper vakuum vänta för bubblor som bildas i de droppar glycerollösning och DI vatten till pop. Vid vakuumfrigör vätskorna sugs in i tomrummen inuti enheten. Om restluft förblir inuti kanalerna, eliminera den genom att anbringa yttre tryck på de vätskor (t.ex.., Med användning av en spruta) och låta luft att diffundera in i PDMS. - Injicera ~ 2 ml DI-vatten i den övre kammaren (dvs sprutcylindern, Fig. 2b) tills den är helt fylld med vatten. Sedan täcka den övre kammaren med en 19 gauge trubbig sprutspetsen, skär toppen av en annan trubbig 19 gauge sprutspetsen och infoga denna spets åt sidan kammarinloppet. Anslut båda sprut tips till en 1 ml spruta via tunn Teflon slang och en T-formad kontakt.
OBS: Se till att en ml spruta, Teflon slang, T-formad kontakt och övre kammaren (2 ml spruta barrEL) är alla fyllda med vatten utan bubblor. Detta kan åstadkommas genom att öppna anslutningspunkter, driver vatten genom tomma sektioner av slangen och återansluta anslutningspunkterna. - Anslut en ml sprutan till en sprutpump förprogrammerad att efterlikna exempelvis en lugn tidvatten andningscykeln (med en period av T = 4 sek) uppbyggd av linjära ramper, dvs från noll till 1,8 ml / min i en sekund, från 1,8 ml / min till -1,8 ml / min i 2 sek och från -1.8 ml / min tillbaka till noll i en sekund.
4. Flödesvisualiserings Experiment: Micro-Particle Image Velocimetry (μPIV)
- Medan anordningen manövreras, erhålla en serie av 9 - 12 faslåsta dubbel frame bilder av partikel seedade flöde med hjälp av en mikropartikel bild Velocimetry (μPIV) som består av exempelvis en dubbel ram-multiexponering CCD kamera (t ex., till 1.600 × 1200 pixlar uppnå tillräcklig upplösning), en dubbel pulsad Nd-YAG-laser (våglängd: 532 nm, utgångsenergi: 400 mJ, pulslängd: 4 ns), och ett inverterat mikroskop.
OBS: Ett sådant system är i stånd att erhålla ram par med en eftersläpning på ned till några mikrosekunder mellan den första och andra ramar. För att uppnå faslåsta dubbel ram bilder, är det lämpligt att få en dubbel ram serie på eg., 10 Hz (ram par separeras med 0,1 sek från varandra). Därefter kan data omorganiseras så att alla bygg par som skiljs åt av en hel cykel tid (här T = 4 sek) bildar en ny tidsserie. Bildtagning bör upprepas flera gånger medan modifiera fördröjning mellan den första och andra ramar i varje ram par (ie., 100 ^ sek till 0,1 sek) för att lösa olika flödesområden inuti den alveolära hålrum.
Obs: alternativa uppställningar med avseende på bästa kombinationerna av bildförvärvssystem (. Dvs kamera) och belysningskällor (dvs. lasrar) och bilden såmicroflows är också tillgängliga 34, 35. - Använder en summa-av-korrelationsalgoritm för att beräkna faslåsta hastighetsvektorkartor av den resulterande flödesfält från bildserien för varje tidsfördröjning används. Upprepa denna process flera gånger med varierande ledtider mellan den första och andra ramar i varje ram par för att lösa olika flödesområden inuti den alveolära hålrum. Använd sedan en dataanalys program för att sy ihop de individuella flödes avbildas till en komplett och hög-detaljerad karta över flödesmönster genom att ta medelvärdet överlappande datapunkter 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Datorstödd konstruktion (CAD) och mikroskop bilder av in vitro acinar plattform presenteras i Fig. 1. Den biomimetiska acinar modellen har fem generationer av förgrening rektangulära kanaler kantade med alveolära liknande cylindriska håligheter (Fig. 1). Här är de modellgenerationer numrerade från generation ett (för det mesta proximala generationen) till generation 5 (för den mest distala generationen). Notera att endast den kanalinloppet leder till generering 1 är öppen mot den yttre omgivningen med hjälp av en öppning i PDMS. De 16 kanaler som leder bort från generation 5 lämnas stängd för luft (Fig. 1a). Genom att modulera regelbundet vattentrycket i kamrarna är de tunna väggarna som utgör de alveolära hålrum och kanaler cykliskt deformeras. Samtidigt är taket i luftvägarna deformeras vertikalt med hjälp av en extra vattenkammare belägen ovanför kanalerna; att skapa denna övre kammaren i ettenkelt sätt utan framställning av ett ytterligare mikrofluidskikt cylindern hos en spruta var nedsänkt inuti PDMS före tvärbindning. Detta resulterade i en PDMS skikt av approximativt 1 mm som åtskiljer de i celler ledningar och den övre vattenkammaren (se Fig. 2).
De vattenkammare är anslutna till en sprutpump programmerad att upprepa en serie av linjärt sluttande flödeshastigheter för att efterlikna en normal till tung tidalandning scenario av en genomsnittlig vuxen människa med en 4 sek cykeltid (T). Detta resulterar i en periodisk sänkning och höjning av luftvägsvolym; eftersom utloppen är förseglade och endast inloppet är öppet till miljön, är fluiden inuti kanalerna inandad och utandad från anordningen genom inloppet, i analogi med en naturlig andning process. Här var de luftvägskanalerna fylls med en glycerollösning ympades med fluorescerande partiklar (se protokoll) och mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) användes för att kartlägga den resulti ng strömningsfält över luftvägarna trädet 33.
Den normaliserade hastigheten magnitud (u x / u x, max) i strömnings (dvs., Axiell) riktning tvärs över bredden av kanalerna visas i fig. 3. Resultaten presenteras på topp inandningshastigheten för var och en av de 5 enhets generationer, och representerar 2D-projektion av flödet i en tunn platta nära kanalmittplan. Som jämförelse är den analytiska lösningen av steady-state-laminärt flöde för en oändligt lång kanal 36 presenteras också i Fig. 3.
Figur 4 visar effektivisera mönster och hastighets magnituder inom alveolära hålrum vid mittplanet i luftvägarna på topp inandning. Figurerna 4a, b och c visar acinära generationer 1, 3 och 5, respektive.
gur 1 "src =" / filer / ftp_upload / 53588 / 53588fig1.jpg "/>
Figur 1: Mikroflödes modell av körtel Tree Network (a) CAD-ritning av hela enheten.. (B) Close-up ögonblicksbilder av acinar trädstrukturen som visar kanalerna, kamrarna, och de tunna väggarna som skiljer dem. Lila pilar indikerar de motsvarande platser och positiva y -directions av flödesprofiler som presenteras i Fig. 3. Anpassad med tillstånd från ref. 33.
Figur 2:. CAD Design av mikroflödessystem enhet (a) Streckade linjer anger de rör som leder från de laterala och övre kamrarna till sprutpumpen via en T-formad kontakt. (B) sida skär genom mitten av anordningen som illustrerar placeringen av sprutan inom PDMS gjutna. endapted med tillstånd från ref. 33.
Figur 3: Acinar flödeshastigheter Normaliserade duktal hastighetsprofiler (u x / u x, max) extraherade från PIV utmed bredden av kanalen i generationer 1 till 5 på de platser som visas i fig.. 1, y = 0 sammanfaller med mittpunkten plats över kanalen och u x, max = 0,0104 m / sek motsvarar här till toppen strömningshastighet mätt i enheter generation 1. PIV mätningar visas här på topp inhalation (t = 0,6 sek) och den svarta linjen motsvarar den analytiska hastighetsprofil för krypande flöde inuti en rektangulär kanal med W d = 345 | im och <em> h = 92 pm. Anpassad med tillstånd från ref. 33.
Figur 4: Velocity Magnituder och motsvarande Streamline Mönster. Data erhålls från mikro-PIV för en projektion av flödet extraheras vid mittplanet av en alveol belägen vid enhets generationer 1, 3 och 5. Flödes fält är visade vid approximativt topp inhalation (t = 0,6 sek). Velocity storheter visas på en logaritmisk skala. Anpassad med tillstånd från ref. 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritisk egenskap hos mikroflödes acinar plattform som presenteras här är dess förmåga att återge fysiologiskt realistiska andningsrörelser som ger upphov till fysiologiska flödesprofiler och hastigheter inom acinära kanaler och inom alveolerna. Eftersom mikroflödessystem kanaler produceras med en relativt låg aspektförhållande (dvs., W d / h ≈ 3,9, där Wd är kanalbredden och h är kanalhöjden), de uppmätta flödena visar mer plug-liknande flödesegenskaper jämfört med de förväntade paraboliska flödesprofiler som skulle finnas i cirkulära kanaler. Icke desto mindre, de uppmätta hastigheterna ligger väl inom det fysiologiska intervallet; det visar sig att den karakteristiska dimensions Reynolds tal, jämföra tröghets till viskösa krafter, ger högst cirka 0,01 motsvarande till mitten till distala acinar regioner, efter semi-empiriska uppskattningar 2.
innehåll "> Här är Reynolds tal definieras som Re = U x,, max är Dh / ν glycerollösning, där U x, max är den genomsnittliga strömningshastigheten över kanalen mittplan vid ögonblicket av maximal flödeshastighet D h hydraulisk diameter av kanalen och ν glycerollösning är den kinematiska viskositeten hos den glycerollösning som används för flödesvisualisering vilket matchades till den kinematiska viskositeten för luft vid ~ 24 ° C (ν luft = 1,55 x 10 -5 m 2 / sek, ν glycerollösning = 1,51 x 10 -5 m 2 / sek). Dessutom, en minskning av flödes storlek med ungefär en faktor två observeras efter varje förgrening som förväntat frånde dikotoma förgreningsmönster för acinar modell. Nämligen, är denna kaskad av flödeshastigheter ett viktigt särdrag hos acinar flöden i luftvägs träd.Flödesprofiler nära och inom alveolära hålrum (Fig. 4) visar att duktala hastigheter gradvis minskar mot djupare acinära generationer. Dessutom flödes magnituder släppa brant längs öppningen av alveolerna vilket resulterar i flödeshastigheter som är två till tre storleksordningar långsammare inuti alveolerna jämfört med kanalerna; sådana flödes topologier tidigare rapporterats i flera numeriska studier 1, 9, 15 Dessutom, strömningsmönster förändras avsevärt från en acinar generation till en annan, som förutses i simuleringar 7, 15. medan generation 1 har en cirkulations zon som ungefär sammanfaller med centrum av alveol (Fig. 4, till vänster), generation 3 kännetecknas av en recirkulationszon vilken växlas mot den proximala sidan avalveol med en mer öppen effektivisera mönster (Fig. 4, mitten). Slutligen är radiella strömnings utan cirkulationszonen observerades i enheten generation 5 (Fig. 4, till höger). Så vitt författarnas kunskap, är detta första gången som det finns ett brett spektrum av alveolära flödesmönster fångas experimentellt.
Framgången med den presenterade metoden beror på några viktiga steg i mikro protokollet. Först, för att förhindra att de tunna PDMS väggar från att rycka vid frisättning från master wafer det etsade mönstret på ytan av skivan bör ha raka väggar och får inte hålla sig till de härdade PDMS. Därför rekommenderas att producera skivor med hjälp av DRIE av en SOI wafer som beskrivs i Fishler et al. (2013). Sådan mästare wafer är tålig och kan lätt belagd med en anti-klibbning skiktet genom antingen silanisering ytan såsom beskrivits i Fishler et al., (2013) eller genom att säkerställa thatt det sista steget i DRIE process är att passive med CF 4. En annan kritisk steg arkivering (steg 2,5) och inbäddning (steg 2,6) sprutcylindern för att skapa den övre kammaren. Luftbubblor fångad mellan sprutan basen och den första PDMS skiktet kan kraftigt minska integriteten och hållbarheten hos den tillverkade anordningen. För att förhindra bubbelbildning, är det kritiskt att basen av sprutcylindern är platt och jämnt in.
Medan den aktuella designen tillåter tillverkning av en två-lagers-enhet med hjälp av endast en huvudskiva, kan en modifierad metod innefattar att skapa ett ytterligare PDMS skikt innehållande en cirkulär inbuktning för att bilda den övre kammaren. För denna andra PDMS skikt ett ytterligare mästare wafer med en cirkulär ås kan tillverkas med hjälp av standard SU-8 fotolitografi. En ytterligare modifiering av protokollet kan inkludera en annan metod för PDMS bindning som inte kräver en coronabehandlare. Att vidhäfta PDMS mögel att glasetslide, första belägga glasskiva som beskrivs i steg 2,10 i protokollet men använder en 5: 1 i stället för en 10: 1 PDMS: härdning-agent viktförhållande. Baka det belagda glaset under 15 min vid 65 ° C i en naturlig konvektionsugn, tryck på PDMS formen till PDMS-belagda glas, och baka över natten vid 65 ° C i en naturlig konvektionsugn.
Med anledning av vätskeläckage från bindningsytan mellan PDMS mögel och glas kan följande åtgärder vidtas: (1) se till att corona treater producerar elektriska gnistor under behandlingen, om inte, ökar utspänningen, (2) förlänga behandlingstiden med korona treater och (3) använd alternativ metod för att binda PDMS formen på glaset (se punkt ovan). Ofta vatten kan läcka genom anslutningen av den tunna rör av Teflon till kammaren inlopp. För att kringgå en sådan läcker, se till att 19-gauge trubbig sprutspetsen används för att ansluta teflonslangen till inloppet. Om läckage vatten mellan PDMS mögel och the övre kammare (2 ml spruta fat) se till att basen av sprutcylinderns var korrekt inlämnad (se steg 2,5 i protokollet), och att det andra skiktet av PDMS hälldes tillräckligt hög (~ 5 mm ovanför det första PDMS lagret ).
Notera att omfattningen av väggen deformation är mycket beroende av PDMS mekaniska egenskaper. Lätta förändringar i framställningsförfarandet av anordningarna kan leda till avsevärd variabilitet av de uppmätta hastigheter mellan olika enheter. För att säkerställa maximal repeterbarhet använda konstanta framställningsförhållanden (luftfuktighet, bakning gånger osv.). Dessutom kan finjustering av volymförändringen under anordningen aktivering uppnås genom att visualisera den övre ytan av kanalerna med användning av faskontrastmikroskopi och justering av hastighetsramper av sprutpumpen, så att den övre ytan av kanalen är avlänkat till det önskade avståndet mätt som z-rörelse av mikroskopbordet.
En viktig limitation av den aktuella tekniken är att de exakta morfologiska egenskaper (t.ex. anatomi, morfometri) i lungorna inte exakt kan återges. I själva verket gör den plana utformningen av acinar modellen inte fångar till exempel utanför planet acinar bifurkationer och förhållandet mellan alveolära till duktal volymen är mycket lägre än mätt in vivo värden 37. Dessutom den förenklade mikroflödesgeometrin fångar endast en liten del av en full acinus. Trots dessa begränsningar, är den nuvarande modellen kan reproducera förväntade flödesmönster och hastigheter direkt på de verkliga anatomiska längdskalor, och därför utgör en värdefull test plattform för acinar transportfenomen.
Avslutningsvis presenterade mikrofluid modeller av lung acinus visar stort löfte som ett in vitro verktyg för kvantitativa undersökningar av andnings acinar flöden härma andningsmönster. Här består den enkla acinar modell av fem generations att expandera och contracting i celler ledningar, sålunda reproducera några av de viktiga underliggande flödesegenskaper förväntade att existera inom den acinar regionen av lungorna. Flödes visualisering, med hjälp av mikro-PIV inom alveolära hålrum ger för första gången experimentellt bevis på rad komplexa återcirkulerande och radiella alveolära strömmar längs acinar trädet. Denna mikroflödes tillvägagångssätt gör tillverkning av komplexa körtelstrukturer med rörliga väggar efter en relativt enkel procedur och erbjuder ett attraktivt alternativ till uppskalade acinära modeller. I synnerhet med den största fördelen med att leverera en modell på en en-till-en skala sanna inhalerad acinar partikeldynamik kan undersökas utan ytterligare behov av dynamisk likhet matchning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent | Dow Corning | (240)4019862 | Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit |
| Plastipak 2 ml syringe | BD | 300185 | |
| Norm-Ject Luer slip 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | |
| 1 mm Biopsy punch | Kai Medical | BP-10F | |
| Laboratory Corona Treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| PHD Ultra Syringe pump | Harvard apparatus | 703006 | |
| Dyed red rqueous fluorescent particles | Thermo-Scientific | Uncatalloged 0.86 µm beads were used | |
| Glycerin AR | Gadot | 830131320 | |
| FlowMaster MITAS micro-particle image velocimetry (µPIV) system | LaVision | 1108630 |
References
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z. Airflow and Particle Transport in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 301-334 (2010).
- Sznitman, J. Respiratory microflows in the pulmonary acinus. J. Biomech. 46 (2), 284-298 (2013).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Gas and aerosol mixing in the acinus. Respir. Physiol. Neurobiol. 163 (1-3), 139-149 (2008).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted Drug-Aerosol Delivery in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10 (1), 195-220 (2008).
- Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Schulz, H., Takenaka, S., Butler, J. P., Henry, F. S., Tsuda, A. Nanoparticle delivery in infant lungs. Proc. Natl. Acad. Sci. 109 (13), 5092-5097 (2012).
- Sznitman, J., Heimsch, F., Heimsch, T., Rusch, D., Rosgen, T. Three-Dimensional Convective Alveolar Flow Induced by Rhythmic Breathing Motion of the Pulmonary Acinus. J. Biomech. Eng. 129 (5), 658-665 (2007).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Chaotic mixing of alveolated duct flow in rhythmically expanding pulmonary acinus. J. Appl. Physiol. 79 (3), 1055-1063 (1995).
- Henry, F. S., Butler, J. P., Tsuda, A. Kinematically irreversible acinar flow: a departure from classical dispersive aerosol transport theories. J. Appl. Physiol. 92 (2), 835-845 (2002).
- Kumar, H., Tawhai, M. H., Hoffman, E. A., Lin, C. L. The effects of geometry on airflow in the acinar region of the human lung. J. Biomech. 42 (11), 1635-1642 (2009).
- Lee, D. Y., Lee, J. W. Characteristics of particle transport in an expanding or contracting alveolated tube. J. Aerosol Sci. 34 (9), 1193-1215 (2003).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. I. Diffusional deposition in the absence of gravity. J. Appl. Physiol. 76 (6), 2497-2509 (1994).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. II. Gravitational sedimentation and inertial impaction. J. Appl. Physiol. 76 (76), 2510-2516 (1994).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol bolus dispersion in acinar airways—influence of gravity and airway asymmetry. J. Appl. Physiol. 113 (3), 442-450 (2012).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol deposition characteristics in distal acinar airways under cyclic breathing conditions. J. Appl. Physiol. 110 (5), 1271-1282 (2011).
- Heimsch, J., Sznitman, T., Wildhaber, J. H., Tsuda, A., Rösgen, T. Respiratory Flow Phenomena and Gravitational Deposition in a Three-Dimensional Space-Filling Model of the Pulmonary Acinar Tree. J. Biomech. Eng. 131 (3), 031010 (2009).
- Litzlbauer, H. D., Korbel, K., Kline, T. L., Jorgensen, S. M., Eaker, D. R., Bohle, R. M., Ritman, E. L., Langheinrich, A. C. Synchrotron-Based Micro-CT Imaging of the Human Lung Acinus. Anat. Rec. Adv. Integr. Anat. Evol. Biol. 293 (9), 1607-1614 (2010).
- Tsuda, A., Filipovic, N., Haberthür, D., Dickie, R., Matsui, Y., Stampanoni, M., Schittny, J. C. Finite element 3D reconstruction of the pulmonary acinus imaged by synchrotron X-ray tomography. J. Appl. Physiol. 105 (3), 964-976 (2008).
- Berg, E. J., Weisman, J. L., Oldham, M. J., Robinson, R. J. Flow field analysis in a compliant acinus replica model using particle image velocimetry (PIV). J. Biomech. 43 (6), 1039-1047 (2010).
- Sznitman, J., Sutter, R., Altorfer, D., Stampanoni, M., Rösgen, T., Schittny, J. C. Visualization of respiratory flows from 3D reconstructed alveolar airspaces using X-ray tomographic microscopy. J. Vis. 13 (4), 337-345 (2010).
- Henry, F. S., Haber, S., Haberthür, D., Filipovic, N., Milasinovic, D., Schittny, J. C., Tsuda, A. The Simultaneous Role of an Alveolus as Flow Mixer and Flow Feeder for the Deposition of Inhaled Submicron Particles. J. Biomech. Eng. 134 (12), 121001 (2012).
- Chhabra, S., Prasad, A. K. Flow and Particle Dispersion in Lung Acini: Effect of Geometric and Dynamic Parameters During Synchronous Ventilation. J. Fluids Eng. 133 (7), 071001 (2011).
- Cinkotai, F. F. Fluid flow in a model alveolar sac. J. Appl. Physiol. 37 (2), 249-251 (1974).
- Karl, A., Henry, F. S., Tsuda, A. Low reynolds number viscous flow in an alveolated duct. J. Biomech. Eng. 126 (4), 420-429 (2004).
- Tippe, A., Tsuda, A. recirculating flow in an expanding alveolar model: experimental evidence of flow-induced mixing of aerosols in the pulmonary acinus. J. Aerosol Sci. 31 (8), 979-986 (2000).
- Berg, E. J., Robinson, R. J. Stereoscopic particle image velocimetry analysis of healthy and emphysemic alveolar sac models. J. Biomech. Eng. 133 (6), 061004 (2011).
- Ma, B., Ruwet, V., Corieri, P., Theunissen, R., Riethmuller, M., Darquenne, C. CFD simulation and experimental validation of fluid flow and particle transport in a model of alveolated airways. J. Aerosol Sci. 40 (5), 403-414 (2009).
- Kumar Mahto, S., Tenenbaum-Katan, J., Sznitman, J. Respiratory Physiology on a Chip. Scientifica. 2012, e364054 (2012).
- Huh, D., Fujioka, H., Tung, Y. C., Futai, N., Paine, R., Grotberg, J. B., Takayama, S. Acoustically detectable cellular-level lung injury induced by fluid mechanical stresses in microfluidic airway systems. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (48), 18886-18891 (2007).
- Song, Y., Baudoin, M., Manneville, P., Baroud, C. N. The air–liquid flow in a microfluidic airway tree. Med. Eng. Phys. 33 (7), 849-856 (2011).
- Tavana, H., Huh, D., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microfluidics, Lung Surfactant, and Respiratory Disorders. Lab Med. 40 (4), 203-209 (2009).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Pihl, J., Sinclair, J., Sahlin, E., Karlsson, M., Petterson, F., J, O. lofsson, Orwar, O. Microfluidic Gradient-Generating Device for Pharmacological Profiling. Anal. Chem. 77 (13), 3897-3903 (2005).
- Fishler, R., Mulligan, M. K., Sznitman, J. Acinus-on-a-chip: A microfluidic platform for pulmonary acinar flows. J. Biomech. 46 (16), 2817-2823 (2013).
- Lindken, R., Rossi, M., Grosse, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (microPIV): recent developments, applications, and guidelines. Lab. Chip. 9 (17), 2551-2567 (2009).
- Wereley, S. T., Meinhart, C. D. Recent Advances in Micro-Particle Image Velocimetry. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 557-576 (2010).
- Bruus, H. Theoretical Microfluidics. Oxford Master Series in Condensed Matter Physics. , (2008).
- Haefeli-Bleuer, B., Weibel, E. R. Morphometry of the human pulmonary acinus. Anat. Rec. 220 (4), 401-414 (1988).
