Abstract
Het kwantificeren van de luchtwegen vloei-eigenschappen in de pulmonaire acinaire diepten en hoe beïnvloeden ze geïnhaleerd aerosol vervoer is van cruciaal belang in de richting van het optimaliseren van drug inademing technieken als het voorspellen van depositie patronen van potentieel giftige deeltjes in de lucht in de longblaasjes. Hier worden soft-lithografie technieken die gebruikt worden om complexe acinar-achtige luchtwegen structuren fabriceren in het waarheidsgetrouw anatomische lengte-schalen die fysiologische acinar stromingsfenomenen reproduceren in een optisch toegankelijk systeem. De microfluïdische apparaat beschikt over 5 generaties bifurcating cell kanalen met periodiek uit te breiden en contracting muren. Wand activering wordt bereikt door het veranderen van de druk in-water gevulde kamers rond de dunne PDMS acinaire kanaalwanden zowel de zijkanten en de bovenkant van de inrichting. In tegenstelling tot gewone multilayer microfluïdische inrichtingen waar het stapelen van verschillende PDMS mallen vereist, is een eenvoudige werkwijze gepresenteerd boven fabricerenkamer door het inbedden van de sectie loop van een injectiespuit in de PDMS mal. Deze roman microfluïdische setup levert fysiologische ademhaling bewegingen die op hun beurt leiden tot karakteristieke acinar luchtstromen te geven. In de huidige studie, micro particle image velocimetry (μPIV) met vloeistof zwevende deeltjes werd gebruikt om dergelijke lucht te kwantificeren stromen op basis van hydrodynamische gelijkenis matching. De goede overeenstemming tussen μPIV Resultaten en verwachte acinaire transportprocessen suggereren dat de microfluïdische platform in de nabije toekomst kan dienen als een aantrekkelijk vitro hulpmiddel om direct lucht representatieve deeltjes transport en afzetting in de acinaire gebieden van de longen te onderzoeken.
Introduction
Een gedetailleerde kwantificatie van ademstroom dynamiek in de distale cell gebieden van de longen naar het ontrafelen grootste menging luchtstroom in de longen acinus en voorspellen van het lot van geïnhaleerde aerosolen in het diepste luchtwegen 1-3. Dit laatste is van bijzonder belang bij de aanpak van enerzijds de gevaren van geïnhaleerde verontreinigende deeltjes of omgekeerd bij het zoeken naar nieuwe strategieën voor betere en doelgerichte geneesmiddelafgifte geïnhaleerde therapeutica gelokaliseerde long plaatsen 4, 5 en voor systemische afgifte.
Tot op heden hebben de luchtwegen stromen in de diepe pulmonale acinar regio's zijn meestal onderzocht in silico met behulp van computational fluid dynamics (CFD) of in vitro met opgeschaald experimentele modellen volgende hydrodynamische gelijkenis matching. In de afgelopen decennia zijn CFD methodes in toenemende mate toegepast op acinar stroom fenomenen te bestuderen, uit enke alveolaire modellen 6, 7 en cell kanalen 8-12 voor meer uitgebreide in silico modellen capture anatomisch realistische acinaire boomstructuren met meerdere generaties cell kanalen tot enkele honderden individuele alveoli 13-15.
Samen hebben numerieke inspanningen cruciaal in licht werpen op de rol en invloed van wandbeweging tijdens de ademhaling bewegingen op daaropvolgende acinar luchtstroom patronen geweest. Bij afwezigheid van ademhaling beweging, statische alveoli feature recirculerende stromen binnen hun holtes die geen convectieve luchtuitwisseling tussen de acinaire kanaal en de alveolus 6, 7 vertonen; Met andere woorden, zou alvéolaire stromen volledig geïsoleerd van stromen in de acinaire bomen en luchtverversing zou uniek gevolg van diffuse mechanismen. Met de aanwezigheid van cyclische uitbreidingen van het alveolaire gebied te voorkomen, alveolaire stroom topologieën drastisch gewijzigd en de resulting stroompatronen binnen alveoli zijn nauw verbonden met de locatie van een alveole langs de acinaire structuur (bijv., proximale versus distale generaties).
Met name is gespeculeerd in simulaties dat alveolaire stromingspatronen sterk beïnvloed door de verhouding van alveolaire tot stroomsnelheden ductale zodat proximale generaties van de pulmonaire acinaire boom, waarbij deze verhouding relatief groot massacategorieën instandhouding in een boomstructuur, feature complex recirculatie stroomt binnen in de alveolaire holten met onomkeerbare vloeistof stroombanen. Met elke diepere acinaire generatie, de verhouding van alveolaire om ductale stroomsnelheden geleidelijk afneemt zodat distale acinaire generaties vertonen meer radiaal-achtige stroomlijnen die doen denken aan eenvoudige inflaties en deflations van een ballon zijn. Met de vooruitgang in de moderne beeldvormende modaliteiten, long- beeldgegevens 16, 17 van knaagdieren, met inbegrip van ratten en muizen, hebben aanleiding gegeven tot een aantal van de eerste CFD Simulaties van anatomisch gereconstrueerd acinaire stromen in gereconstrueerde alveoli. Ondanks deze veelbelovende vooruitgang, zijn deze recente studies nog steeds beperkt tot het aanpakken van de luchtstroom verschijnselen in terminal longblaasjes slechts 18, 19 of een paar alveoli rond één kanaal 20. Hierdoor blijven state-of-the-art onderzoeken ademstroom verschijnselen in de acinus gedomineerd door studies betreffende de aspecifieke anatomisch geïnspireerd geometrie van de acinaire milieu 2.
Op de experimentele zijde zijn verschillende opstellingen die een luchtweg met één of meerdere alveoli ontwikkeld in de jaren 21-24. Toch bestaat er geen experimentele modellen van bifurcating cell luchtwegen die in staat is na te bootsen fysiologische ademhaling door uitbreiding en contracting van projecten in een adem-achtige mode zijn. Gezien het gebrek aan aantrekkelijke experimentele platforms bij de hand, de studie van acinar transport verschijnselen blijft beperkt met betrekking tot validaTing computational studies en kritisch, blijft er een gebrek aan experimentele gegevens beschikbaar. . In de afgelopen jaren, Ma et al (2009) hebben een opgeschaalde stijve wand model van een acinus uit drie generaties acinaire geconstrueerd; echter, het gebrek aan wandbeweging in dit model beperkt zijn vermogen om realistische alveolaire stromingspatronen onder ademhalingsomstandigheden vangen.
Andere opgeschaalde experimenten, inclusief een bewegende muur model gebaseerd op anatomische gegevens van cast replica werden onlangs geïntroduceerde 25; Aangezien het model alleen gevangen de laatste twee acinaire generaties (bijv., terminal zakken), zij geen complexe recirculerende stromen die meer proximaal acinaire generaties karakteriseren vangen. Deze laatste voorbeelden van opgeschaalde experimenten verder onderstrepen de voortdurende beperkingen met dergelijke benaderingen. Specifiek is er geen bestaande experiment tot nu toe gebleken dat de hypothese overgang van recirculerende stromen naar radial meede acinus en daardoor numerieke voorspellingen van stroming topologieën hypothese bevestigt dat er in real pulmonale acinaire bomen 7, 15. Misschien het meest kritisch worden opgeschaald experimenten uiterst beperkte het onderzoeken geïnhaleerde deeltjes transport en depositie dynamiek 26 vanwege problemen in bijpassende alle relevante niet dimensionale parameters (bijv., deeltje diffusie, een kritische transportmechanisme voor sub-micron deeltjes volledig verwaarloosd).
Met de lopende experimentele uitdagingen, nieuwe experimentele platforms dat onderzoeken van respiratoire luchtstromen en particle dynamics toestaan in complexe bewegende muren acinar netwerken worden gezocht. Hier, een anatomisch-geïnspireerde in vitro acinar model wordt geïntroduceerd. Deze microfluïdische platform bootst pulmonale acinar stroomt direct aan de vertegenwoordiger acinaire schaal, en vergroot het groeiende aanbod van pulmonale microfluïdische modellen 27, met inbegrip van bronchiale vloeibare plug-flows 28-30 en de alveolaire-capillaire barrière 31.
Namelijk, het huidige ontwerp is voorzien van een vereenvoudigde vijf generatie cell luchtwegen boom met cyclisch uitbreiden en contracteren van muren, waar de cyclische bewegingen worden bereikt door het regelen van de druk in een water kamer die de dunne PDMS zijwanden omgeeft en waar de top muur wordt vervormd door een extra water kamer zitten direct boven de acinar structuur. In tegenstelling tot gewone multilayer microfluïdische apparaten, wordt deze kamer gewoon gevormd door het inbedden van de sectie loop van een spuit in de PDMS apparaat, en heeft de voorbereiding van een extra PDMS mal nodig.
De geminiaturiseerde hier gepresenteerde benadering biedt een eenvoudige en veelzijdige voor het reproduceren gecompliceerde acinaire structuren met bewegende wanden tegenover opgeschaalde modellen tijdens het vastleggen van de onderliggende eigenschappen van de acinaire stroom milieu. Dit platform kan worden gebruikt voor flow visualisatie met behulp van vloeistof zwevende deeltjes in de luchtwegen (zie Representatieve resultaten hieronder). In de nabije toekomst zal het model worden gebruikt met de lucht zwevende deeltjes te bestuderen ingeademd acinar particle dynamics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Master Fabrication
- Gebruik diepe reactief ionen etsen (DRIE) van een silicium op isolator (SOI) wafer om een master silicium wafer fabriceren, zoals beschreven in het voormalige werken 32, 33.
OPMERKING: DRIE voorkeur standaard SU-8 micromachining vanwege de hoge aspectverhouding kenmerken (40 urn brede en 90 urn diepe geulen).
2. Gieten en afdichten van de microfluïdische apparaat
- PDMS mengen en verharder bij een 10: 1 gewichtsverhouding in een schone kleine houder, zoals een plastic weegschaal.
- Ontgas het mengsel in een exsiccator onder vacuüm totdat alle luchtbellen worden verwijderd.
OPMERKING: Bereid genoeg PDMS voor alle volgende stappen. Hieronder, de afkorting "PDMS" verwijst altijd naar de ontgaste 10: 1 PDMS: curing agent mengsel dat bereid is in stappen 2,1 en 2,2. - Giet het ontgaste mengsel een hoogte van ongeveer 1 mm boven de master wafer. Ontgas opnieuw minstens40 min om alle luchtbellen te verwijderen boven de wafel en de bellen onder de wafel te minimaliseren.
OPMERKING: Controleer of de wafel zo dicht mogelijk bij de bodem van het schaaltje. Indien nodig drukt u op de wafer langzaam naar de bodem met behulp van 2 roeren sticks en ontgassen nogmaals. - Bakken bij 65 ° C gedurende 20 min in een natuurlijke convectie oven.
LET OP: Na 20 min het PDMS is gehard en bijna volledig uitgehard. Terwijl een langere baktijd kan bakken voor 20 min bespaart tijd en verbetert de hechting van de tweede laag PDMS (zie hieronder) om de eerste. - File de sectie loop van een plastic 2 ml spuit met een fijn schuurpapier om de naleving van PDMS te verbeteren. Daarnaast maken de schuurpapier aan de basis van de injectiespuit te vlakken door het plaatsen van het schuurpapier op een vlak oppervlak en schuiven de onderzijde van de injectiespuitcilinder erbovenop. Maak de spuit met behulp van perslucht.
- Plaats de vatsectie van de spuit bovenop de eerste laag PDMS de laRGE opening naar het oppervlak van het PDMS en giet een tweede laag van PDMS bovenop de eerste om een hoogte van ~ 5 mm en ontgas de PDMS opnieuw in een exsiccator.
OPMERKING: De tweede PDMS laag moet de kleine container rond het vat te gieten, en niet daarin voeren. - Bak de volledige setup bij 65 ° C gedurende ten minste 2 uur in een natuurlijke convectie oven.
Opmerking: Het is niet nodig om het vat op zijn plaats te houden tijdens het uitharden processen aangezien het gewicht van de PDMS drukken tegen de brede basis van de cilinder houdt het vat vast. - Knip de PDMS schimmel rond het patroon gebied van de master wafer met behulp van een scalpel. Tijdens het snijden, moet de scalpel zwak raak het oppervlak van de wafer. Dan, voorzichtig plaatst u een dun voorwerp, zoals wafer tang in de inkeping gemaakt door de scalpel, en trek het werpen van de meester wafer PDMS.
- Plaats de cast op een zacht oppervlak bedekt met aluminiumfolie aan de kant patroonomhoog (bijv. moet het vat hangen vanaf de rand van de tafel), en slaat een gat in het PDMS bij de Kamer inlaat en inlaat met een 1 mm biopsie punch.
- Bekleed een schone glasplaatje met (ontgast) 10: 1 PDMS: curing agent mengsel met behulp van een spin coater geprogrammeerd 3000 rpm gedurende 30 seconden, en bak> 1 uur bij 65 ° C. Dan, het reinigen van de glijbaan en PDMS gegoten met behulp van doorzichtige tape.
- Behandel het oppervlak van het PDMS schimmel en PDMS gecoat glasplaatje met O2 plasma (bijvoorbeeld met behulp van een handbediende corona treater) gedurende 1 min, en vervolgens voorzichtig op de oppervlakken elkaar en bakken bij 65 ° C gedurende de nacht (O / N) .
3. Inrichting Vullen en Aandrijving
- Meng water gesuspendeerd fluorescerende polystyreen deeltjes met water en glycerol in een glazen flacon op een 64/36 (v / v) glycerol / water mengsel te verkrijgen met 0,25% (w / w) deeltjes ..
- Een druppel van de glycerol oplossing bovenop de kanaal inlaat en een druppel DI water op de kamer inlaat, dan plaatst u het apparaat in een exsiccator en vacuüm voor ~ 5 min.
LET OP: Voor het vrijgeven van de vacuüm wachten op de belletjes die zich vormen in de dalingen van glycerol-oplossing en DI water tot pop. Bij het vacuüm de release van de vloeistoffen worden meegezogen in de holtes in het apparaat. Als resterende lucht in de kanalen blijft elimineren door het toepassen van uitwendige druk op de vloeistof (bijv., Met een injectiespuit) en waardoor de lucht diffunderen in de PDMS. - Injecteren ~ 2 ml van DI water in de bovenste kamer (dat wil zeggen, de spuit vat, Fig. 2b), totdat het is volledig gevuld met water. Bedek de bovenste kamer met een 19 gauge stompe spuit tip, snijd de tip van een andere stompe 19 gauge spuit en steek deze tip naar de zijkamer inlaat. Sluit beide spuit tips om een 1 ml spuit via dunne Teflon slang en een T-vormige connector.
LET OP: Zorg ervoor dat de 1 ml spuit, teflon slangen, T-vormige connector en de bovenste kamer (2 ml spuit barrel) zijn allemaal gevuld met water zonder bubbels. Dit kan worden bereikt door het openen aansluitpunten, waardoor water door de lege buissegmenten en opnieuw aansluiten van de aansluitpunten. - Sluit de spuit 1 ml van een spuitpomp voorgeprogrammeerd te bootsen bijvoorbeeld een rustige ademhalingscyclus cyclus (met een periode van T = 4 sec) geconstrueerd uit lineaire hellingen, dwz van nul tot 1,8 ml / min in 1 sec, uit 1,8 ml / min op -1,8 ml / min bij 2 sec en van -1,8 ml / min weer op nul in 1 sec.
4. Flow Visualisatie Experimenten: Micro-deeltje Image Velocimetry (μPIV)
- Terwijl het apparaat wordt bediend, het verkrijgen van een reeks van 9-12 fasevergrendelde, dubbele framebeelden van het deeltje geplaatste stroming behulp van een micro-particle image velocimetry (μPIV) bestaande bijvoorbeeld uit een dubbel frame meervoudige belichting CCD camera (bijv., 1600 × 1200 pixels om voldoende resolutie te bereiken), een dubbel gepulseerde Nd-YAG laser (golflengte: 532 nm, uitgangsenergie: 400 mJ, pulsduur: 4 nsec) en een omgekeerde microscoop.
Opmerking dergelijk systeem kan verkrijgen montuur paren met een vertraging van tot een paar microseconden tussen de eerste en tweede frames. Om te bereiken fasevergrendelde dubbel frame beelden, is het nuttig om een dubbel frame reeks in bijvoorbeeld verwerven., 10 Hz (frame paren zijn gescheiden door 0,1 sec van elkaar). Vervolgens kunnen de gegevens worden gereorganiseerd zodat alle frame-paren die gescheiden worden door een cyclustijd (here T = 4 sec) een nieuwe tijdreeks. Beeldacquisitie moet meerdere malen worden herhaald bij het aanpassen van de vertraging tussen de eerste en tweede frames in elk frame paren (bijv., 100 psec tot 0,1 sec) voor het oplossen van verschillende stroomgebieden in de alveolaire holte.
Opmerking: alternatieve opstellingen met betrekking tot de beste combinaties van beeld acquisitie systemen (. Dwz camera) en de verlichting bronnen (dwz, lasers) om de afbeelding zodanigmicroflows zijn ook beschikbaar 34, 35. - Gebruik een som-van-correlatie algoritme om fasevergrendelde snelheidsvector kaarten van het resulterende stromingsveld van de beeldreeks voor elke vertraging gebruikt. Herhaal dit proces meerdere malen met verschillende vertraging tijd tussen de eerste en tweede frames in elk frame paar voor het oplossen van verschillende stroomgebieden in de alveolaire holte. Gebruik vervolgens een data-analyse programma om de individuele stroom kaarten in een compleet en high-gedetailleerde kaart van stromingspatronen samenvoegen door het gemiddelde overlappende datapunten 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Computer-aided design (CAD) en microscoop beelden van de in vitro acinar platform worden gepresenteerd in Fig. 1. De biomimetic acinaire model heeft vijf generaties van vertakking rechthoekige kanalen omzoomd met alveolaire-achtige cilindrische holtes (afb. 1). Hier wordt het model van generatie generaties genummerd 1 (de meest proximale generatie) generatie 5 (de meest distale generatie). Alleen de kanaalinlaat leidt op generatie 1 is open naar de buitenomgeving via een opening in het PDMS. De 16 kanalen leidt weg van generatie 5 worden gesloten aan de lucht (afb. 1a). Door het moduleren periodiek de waterdruk in de kamers, worden de dunne muren die de alveolaire holtes en leidingen cyclisch vervormd. Tegelijkertijd wordt het maximum van de luchtwegen verticaal vervormd door middel van een extra waterreservoir boven de leidingen bevinden; deze bovenste kamer in een creëreneenvoudige wijze zonder voorbereiding van een extra laag microfluidic de cilinder van een injectiespuit werd in het PDMS ondergedompeld voordat verknoping. Dit resulteerde in een PDMS laag van ongeveer 1 mm scheiden van de cell leidingen en boven waterreservoir (zie fig. 2).
De waterkamer zijn verbonden met een injectiespuit pomp geprogrammeerd om een aantal lineair oplopende stroomsnelheden herhalen om een normale nabootsen zware rustademhaling scenario van een gemiddelde menselijke volwassene met een 4 sec cyclustijd (T). Dit resulteert in een periodiek afname en toename van het volume luchtwegen; aangezien de uitlaten worden verzegeld en alleen de inlaat open naar de omgeving, wordt de vloeistof in de kanalen in- en uitgeademde uit de inrichting door de inlaat, in analogie met een natuurlijke ademhaling. Hier werden de luchtweg kanalen gevuld met een glycerol oplossing geënt met fluorescente deeltjes (zie Protocol) en micro particle image velocimetry (μPIV) werd gebruikt om de kaart te resulti ng stroom velden over de luchtwegen boom 33.
De genormaliseerde snelheid magnitude (u x / u x, max) in de streamwise (bijv., Axiale) richting over de breedte van de kanalen wordt getoond in Fig. 3. De resultaten worden optimaal inhalatie snelheid voor elk van de 5 productgeneraties en vertegenwoordigen de 2D-projectie van de stroming in een dunne plaat nabij het kanaal mid-plane. Ter vergelijking, wordt de analytische oplossing van de steady-state laminaire stroming voor een oneindig lange kanaal 36 ook weergegeven in Fig. 3.
Figuur 4 toont stroomlijnen patronen en snelheid grootheden in alveolaire holten in het middenvlak van de luchtwegen bij diepste inademing. Figuren 4a, b en c tonen acinaire generaties 1, 3 en 5, respectievelijk.
guur 1 "src =" / files / ftp_upload / 53588 / 53588fig1.jpg "/>
Figuur 1: microfluïdische Model van de Acinaire Tree Network (a) CAD-tekening van de volledige inrichting.. (B) Close-up foto's van de acinar boomstructuur toont de kanalen, de kamers, en de dunne muren die hen scheidt. Paarse pijlen geven de overeenkomstige plaatsen en positieve y -directions van de stromingsprofielen weergegeven in Fig. 3. Aangepast met toestemming van ref. 33.
Figuur 2:. CAD ontwerp van de microfluïdische apparaat (a) gebroken lijnen de slangen die van de laterale en bovenste kamers om de spuitpomp via een T-vormige connector. (B) zijde gesneden door het midden van de inrichting illustreert de locatie van de injectiespuit binnen het PDMS cast. EENdapted met toestemming van ref. 33.
Figuur 3: Acinaire stroomsnelheden genormaliseerde ductale snelheidsprofielen (u x / u x, max) geëxtraheerd uit PIV over de breedte van het kanaal generaties 1 tot 5 in de in fig locaties.. 1; y = 0 samenvalt met het middelpunt locatie tegenover het kanaal en U X, max = 0,0104 m / sec komt overeen hier om de piek streamwise snelheid gemeten in het apparaat generatie 1. PIV metingen worden hier getoond op de piek van inhalatie (t = 0,6 sec) en de zwarte lijn komt overeen met de analytische snelheid profiel voor sluipende stroming in een rechthoekig kanaal met w d = 345 pm en <em> h = 92 micrometer. Aangepast met toestemming van ref. 33.
Figuur 4: Velocity Magnitudes en Overeenkomstige Streamline Patterns. Gegevens verkregen uit micro-PIV voor projectie van de stroom onttrokken aan het middenvlak van een alveole zich op productgeneraties 1, 3 en 5. Flow velden zijn vertegenwoordigd ongeveer diepste inademing (t = 0,6 sec). Velocity grootheden worden weergegeven op een logaritmische schaal. Aangepast met toestemming van ref. 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een kritisch kenmerk van de microfluïdische acinaire platform hier gepresenteerde is de mogelijkheid om fysiologisch realistisch ademhaling bewegingen die leiden tot fysiologische stromingsprofielen en snelheden in acinaire leidingen en binnen alveoli reproduceren. Aangezien de microkanalen worden met een relatief lage verhouding (dwz., W d / h ≈ 3,9, waarbij w d de kanaalbreedte en h de puthoogte), de gemeten stromen toon meer plugvormige stroomeigenschappen vergeleken de verwachte parabolische stroom profielen die zou bestaan in ronde kanalen. Toch is de gemeten snelheden zijn ruim binnen de fysiologische range; blijkt dat de karakteristieke dimensieloze Reynoldsgetal vergelijken inertiële visceuze krachten levert een maximum van ongeveer 0,01 overeenkomend met middellange en distale gebieden acinaire na semi-empirische schattingen 2.
content "> hier het Reynoldsgetal wordt gedefinieerd als Re = û x, max D h / ν glycerol oplossing, waarbij U X, max is de gemiddelde streamwise snelheid in het kanaal middenvlak op het moment van maximale stromingssnelheid, D h de hydraulische diameter van het kanaal en ν glyceroloplossing de kinematische viscositeit van de glycerol oplossing voor procesweergaverapporten die is afgestemd op de kinematische viscositeit van lucht bij ~ 24 ° C (ν lucht = 1,55 x 10 -5 m 2 / sec, ν glyceroloplossing = 1,51 x 10 -5 m 2 / sec). Bovendien werd een afname stroomgrootte met ongeveer een factor twee wordt ingelast bifurcatie zoals verwacht vande dichotome vertakking patronen van de acinar model. Namelijk, deze cascade van stroomsnelheden is een belangrijk kenmerk van acinaire stroomt bomen luchtwegen.Flow profielen in de buurt en binnen alveolaire holten (Fig. 4) laten zien dat ductaal snelheden geleidelijk afneemt in de richting van dieper acinar generaties. Bovendien stroom grootheden vallen steil langs de opening van de longblaasjes waardoor stroomsnelheid regel twee of drie ordes van grootte lager in vergelijking met de alveoli kanalen zijn; dergelijke stroming topologieën waren eerder vermeld voor diverse numerieke studies 1, 9, 15 Bovendien stroompatronen aanzienlijk van de ene acinaire generatie naar de andere, zoals voorspeld in simulaties 7, 15. terwijl generation 1 heeft een hercirculeringszone die ongeveer samenvalt met het midden van de alveole (fig. 4, links), generatie 3 wordt gekenmerkt door een recirculatie sectie die wordt verschoven naar de proximale zijde van dealveolus met een meer open stroomlijn patroon (afb. 4, midden). Tenslotte radiale stroomlijnen zonder hercirculeringszone waargenomen in inrichting generatie 5 (fig. 4, rechts). Om de beste van de kennis van de auteurs, dit is de eerste keer dat het bestaan van een breed scala van alveolaire stromingspatronen experimenteel wordt vastgelegd.
Het succes van de onderhavige methode afhankelijk is van verschillende kritische stappen in de microfabrication protocol. Ten eerste, om te voorkomen dat de dunne PDMS muren scheuren bij het vrijgeven van de master wafer de geëtste patroon op het oppervlak van de wafer moet rechte wanden hebben en mag niet aan de uitgeharde PDMS. Het wordt dan ook sterk aangeraden om de wafers met behulp van DRIE van een SOI wafer zoals beschreven in Fishler et al produceren. (2013). Dergelijke grote wafel is duurzaam en kan gemakkelijk worden voorzien van een anti-kleeflaag door ofwel silaneren van het oppervlak zoals beschreven in Fishler et al. (2013) of door erop tpet de laatste stap in het proces DRIE is die van passivering met CF4. Een andere belangrijke stap is het indienen van (stap 2.5) en insluiten (stap 2.6) de injectiespuit naar de bovenste kamer te creëren. Luchtbellen gevangen tussen de basis en de spuit PDMS eerste laag kan de integriteit en duurzaamheid van de vervaardigde inrichting sterk verminderen. Om belvorming te voorkomen, is het essentieel dat de basis van de injectiespuitcilinder is vlak en uniform ingediend.
Hoewel het huidige ontwerp staat vervaardiging van tweelaags-toestel uitsluitend één master wafer, kan een gemodificeerde werkwijze erin bestaan een extra PDMS laag die een cirkelvormige inkeping boven kamer te vormen. Voor deze tweede PDMS laag een extra meester wafer met een cirkelvormige nok kunnen worden vervaardigd met behulp van standaard SU-8 fotolithografie. Een extra modificatie van het protocol kan een andere werkwijze voor PDMS binding die geen corona treater vereist omvatten. Om de PDMS mal zich aan het glasdia eerste laag het glaasje zoals beschreven in stap 2.10 van het protocol maar gebruik een 5: 1 in plaats van 10: 1 PDMS: curing agent gewichtsverhouding. Bak het beklede glas gedurende 15 minuten bij 65 ° C in een natuurlijke convectie oven, op de PDMS mal om de PDMS gecoat glas, en bak gedurende de nacht bij 65 ° C in een natuurlijke convectie oven.
Ter gelegenheid van de vloeistof lekt uit de hechting oppervlak tussen PDMS schimmel en glas de volgende maatregelen kunnen worden genomen: (1) Zorg ervoor dat de corona treater is de productie van elektrische vonken tijdens de behandeling, zo niet, verhoging van de uitgangsspanning, (2) verlengen behandelingstijd met corona behandelingsinrichting en (3) gebruikt alternatieve methode voor het binden van de PDMS mal om het glas (zie paragraaf hierboven). Vaak water kunnen lekken door de verbinding van de dunne Teflon slang aan de kamerinlaat. Om dergelijke lekken te omzeilen, zorg ervoor dat de 19-gauge stompe spuit wordt gebruikt om de Teflon slang aan te sluiten op de inlaat. Als er water lekt tussen de PDMS mal en the bovenste kamer (2 ml spuit) ervoor zorgen dat de basis van de injectiespuit correct is ingesteld (zie stap 2,5 in Protocol), en dat de tweede laag van PDMS hoog genoeg is gegoten (~ 5 mm boven de eerste PDMS laag ).
Merk op dat de mate van vervorming wand sterk afhankelijk PDMS mechanische eigenschappen. Kleine veranderingen in de bereidingsprocedure van de inrichtingen kunnen aanzienlijke variabiliteit van de gemeten snelheden tussen verschillende apparaten. Om ervoor te zorgen maximale herhaalbaarheid gebruik constante voorbereiding omstandigheden (luchtvochtigheid, baktijden enz.). Bovendien kan fijnafstelling van de volumeverandering tijdens activeringstijd worden bereikt door het visualiseren van het bovenvlak van de kanalen met fasecontrastmicroscopie en aanpassen van de snelheid hellingen van de spuitpomp zodat het bovenoppervlak van het kanaal wordt afgebogen naar de gewenste afstand zoals gemeten door de z-beweging van de microscoop podium.
Een belangrijke bepertie van de huidige techniek is dat de nauwkeurige morfologische eigenschappen (bv anatomie, morfometrie) van de longen niet nauwkeurig kan worden gereproduceerd. Inderdaad, het planaire ontwerp van de acinaire model niet vastleggen bijvoorbeeld uit het vlak acinaire vertakkingen en de verhouding van alveolaire voor ductale volume veel lager dan in vivo gemeten waarden 37. Bovendien, de vereenvoudigde geometrie microfluïdische slechts een relatief klein gedeelte van een volledige acinus. Ondanks deze beperkingen het onderhavige model kan verwachten stromingspatronen en snelheden reproduceren direct bij de werkelijke anatomische lengteschalen, en dus een waardevolle testplatform voor acinaire transportverschijnselen.
Tot slot, de gekenmerkte microfluïdische modellen van de pulmonaire acinus tonen grote belofte als een in vitro tool voor kwantitatieve onderzoeken van respiratoire acinar stromen nabootsen ademhaling. Hier, de eenvoudige acinar model bestaat uit vijf generations van uitzetten en samentrekken cell leidingen, waardoor reproduceren enkele belangrijke onderliggende stromingseigenschappen verwachting bestaan binnen de acinaire gebied van de longen. Procesweergave, met behulp van micro-PIV, in alveolaire holten verschaft voor het eerst experimentele bewijs van het gamma complexe recirculerende en radiale alveolaire stroomt langs de acinaire boom. Deze microfluïdische aanpak maakt vervaardiging van complexe acinaire structuren met bewegende muren na een relatief eenvoudige procedure en biedt een aantrekkelijk alternatief voor opgeschaald acinaire modellen. Vooral met het belangrijkste voordeel van het leveren van een model van één-op-één schaal waar geïnhaleerde deeltjes acinaire dynamiek kan worden onderzocht zonder verdere behoefte aan dynamische gelijkenis matching.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent | Dow Corning | (240)4019862 | Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit |
| Plastipak 2 ml syringe | BD | 300185 | |
| Norm-Ject Luer slip 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | |
| 1 mm Biopsy punch | Kai Medical | BP-10F | |
| Laboratory Corona Treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| PHD Ultra Syringe pump | Harvard apparatus | 703006 | |
| Dyed red rqueous fluorescent particles | Thermo-Scientific | Uncatalloged 0.86 µm beads were used | |
| Glycerin AR | Gadot | 830131320 | |
| FlowMaster MITAS micro-particle image velocimetry (µPIV) system | LaVision | 1108630 |
References
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z. Airflow and Particle Transport in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 301-334 (2010).
- Sznitman, J. Respiratory microflows in the pulmonary acinus. J. Biomech. 46 (2), 284-298 (2013).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Gas and aerosol mixing in the acinus. Respir. Physiol. Neurobiol. 163 (1-3), 139-149 (2008).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted Drug-Aerosol Delivery in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10 (1), 195-220 (2008).
- Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Schulz, H., Takenaka, S., Butler, J. P., Henry, F. S., Tsuda, A. Nanoparticle delivery in infant lungs. Proc. Natl. Acad. Sci. 109 (13), 5092-5097 (2012).
- Sznitman, J., Heimsch, F., Heimsch, T., Rusch, D., Rosgen, T. Three-Dimensional Convective Alveolar Flow Induced by Rhythmic Breathing Motion of the Pulmonary Acinus. J. Biomech. Eng. 129 (5), 658-665 (2007).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Chaotic mixing of alveolated duct flow in rhythmically expanding pulmonary acinus. J. Appl. Physiol. 79 (3), 1055-1063 (1995).
- Henry, F. S., Butler, J. P., Tsuda, A. Kinematically irreversible acinar flow: a departure from classical dispersive aerosol transport theories. J. Appl. Physiol. 92 (2), 835-845 (2002).
- Kumar, H., Tawhai, M. H., Hoffman, E. A., Lin, C. L. The effects of geometry on airflow in the acinar region of the human lung. J. Biomech. 42 (11), 1635-1642 (2009).
- Lee, D. Y., Lee, J. W. Characteristics of particle transport in an expanding or contracting alveolated tube. J. Aerosol Sci. 34 (9), 1193-1215 (2003).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. I. Diffusional deposition in the absence of gravity. J. Appl. Physiol. 76 (6), 2497-2509 (1994).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. II. Gravitational sedimentation and inertial impaction. J. Appl. Physiol. 76 (76), 2510-2516 (1994).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol bolus dispersion in acinar airways—influence of gravity and airway asymmetry. J. Appl. Physiol. 113 (3), 442-450 (2012).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol deposition characteristics in distal acinar airways under cyclic breathing conditions. J. Appl. Physiol. 110 (5), 1271-1282 (2011).
- Heimsch, J., Sznitman, T., Wildhaber, J. H., Tsuda, A., Rösgen, T. Respiratory Flow Phenomena and Gravitational Deposition in a Three-Dimensional Space-Filling Model of the Pulmonary Acinar Tree. J. Biomech. Eng. 131 (3), 031010 (2009).
- Litzlbauer, H. D., Korbel, K., Kline, T. L., Jorgensen, S. M., Eaker, D. R., Bohle, R. M., Ritman, E. L., Langheinrich, A. C. Synchrotron-Based Micro-CT Imaging of the Human Lung Acinus. Anat. Rec. Adv. Integr. Anat. Evol. Biol. 293 (9), 1607-1614 (2010).
- Tsuda, A., Filipovic, N., Haberthür, D., Dickie, R., Matsui, Y., Stampanoni, M., Schittny, J. C. Finite element 3D reconstruction of the pulmonary acinus imaged by synchrotron X-ray tomography. J. Appl. Physiol. 105 (3), 964-976 (2008).
- Berg, E. J., Weisman, J. L., Oldham, M. J., Robinson, R. J. Flow field analysis in a compliant acinus replica model using particle image velocimetry (PIV). J. Biomech. 43 (6), 1039-1047 (2010).
- Sznitman, J., Sutter, R., Altorfer, D., Stampanoni, M., Rösgen, T., Schittny, J. C. Visualization of respiratory flows from 3D reconstructed alveolar airspaces using X-ray tomographic microscopy. J. Vis. 13 (4), 337-345 (2010).
- Henry, F. S., Haber, S., Haberthür, D., Filipovic, N., Milasinovic, D., Schittny, J. C., Tsuda, A. The Simultaneous Role of an Alveolus as Flow Mixer and Flow Feeder for the Deposition of Inhaled Submicron Particles. J. Biomech. Eng. 134 (12), 121001 (2012).
- Chhabra, S., Prasad, A. K. Flow and Particle Dispersion in Lung Acini: Effect of Geometric and Dynamic Parameters During Synchronous Ventilation. J. Fluids Eng. 133 (7), 071001 (2011).
- Cinkotai, F. F. Fluid flow in a model alveolar sac. J. Appl. Physiol. 37 (2), 249-251 (1974).
- Karl, A., Henry, F. S., Tsuda, A. Low reynolds number viscous flow in an alveolated duct. J. Biomech. Eng. 126 (4), 420-429 (2004).
- Tippe, A., Tsuda, A. recirculating flow in an expanding alveolar model: experimental evidence of flow-induced mixing of aerosols in the pulmonary acinus. J. Aerosol Sci. 31 (8), 979-986 (2000).
- Berg, E. J., Robinson, R. J. Stereoscopic particle image velocimetry analysis of healthy and emphysemic alveolar sac models. J. Biomech. Eng. 133 (6), 061004 (2011).
- Ma, B., Ruwet, V., Corieri, P., Theunissen, R., Riethmuller, M., Darquenne, C. CFD simulation and experimental validation of fluid flow and particle transport in a model of alveolated airways. J. Aerosol Sci. 40 (5), 403-414 (2009).
- Kumar Mahto, S., Tenenbaum-Katan, J., Sznitman, J. Respiratory Physiology on a Chip. Scientifica. 2012, e364054 (2012).
- Huh, D., Fujioka, H., Tung, Y. C., Futai, N., Paine, R., Grotberg, J. B., Takayama, S. Acoustically detectable cellular-level lung injury induced by fluid mechanical stresses in microfluidic airway systems. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (48), 18886-18891 (2007).
- Song, Y., Baudoin, M., Manneville, P., Baroud, C. N. The air–liquid flow in a microfluidic airway tree. Med. Eng. Phys. 33 (7), 849-856 (2011).
- Tavana, H., Huh, D., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microfluidics, Lung Surfactant, and Respiratory Disorders. Lab Med. 40 (4), 203-209 (2009).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Pihl, J., Sinclair, J., Sahlin, E., Karlsson, M., Petterson, F., J, O. lofsson, Orwar, O. Microfluidic Gradient-Generating Device for Pharmacological Profiling. Anal. Chem. 77 (13), 3897-3903 (2005).
- Fishler, R., Mulligan, M. K., Sznitman, J. Acinus-on-a-chip: A microfluidic platform for pulmonary acinar flows. J. Biomech. 46 (16), 2817-2823 (2013).
- Lindken, R., Rossi, M., Grosse, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (microPIV): recent developments, applications, and guidelines. Lab. Chip. 9 (17), 2551-2567 (2009).
- Wereley, S. T., Meinhart, C. D. Recent Advances in Micro-Particle Image Velocimetry. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 557-576 (2010).
- Bruus, H. Theoretical Microfluidics. Oxford Master Series in Condensed Matter Physics. , (2008).
- Haefeli-Bleuer, B., Weibel, E. R. Morphometry of the human pulmonary acinus. Anat. Rec. 220 (4), 401-414 (1988).
