Abstract
Kvantifisering luftstrømningsegenskaper i lunge acinar dypet og hvordan de påvirker inhalert aerosol transport er kritisk til å optimalisere stoffet innånding teknikker samt forutsi deponering mønstre av potensielt giftige luftbårne partikler i pulmonal alveolene. Her er soft-litografi teknikker som brukes til å dikte komplekse acinar-lignende luftveis strukturer på sannferdig anatomiske lengdeskalaer som reproduserer fysiologiske acinar strømningsfenomener i en optisk tilgjengelig system. Den microfluidic Enheten har 5 generasjoner av bifurcating Cell kanaler med jevne mellomrom utvide og entreprenør vegger. Vegg aktivering oppnås ved å endre trykket i vannfylte kammere som omgir de tynne PDMS acinar kanalveggene både fra sidene og toppen av enheten. I motsetning til vanlige flerlags microfluidic-enheter, hvor det kreves stabling av flere PDMS former, er en enkel fremgangsmåte presentert for å fremstille toppkammeret ved å bygge den løpseksjon av en sprøyte inn i PDMS formen. Denne romanen microfluidic oppsettet gir fysiologiske pustebevegelser som igjen gir opphav til karakteristiske acinar luftstrømmer. I denne studien ble det mikropartikkel bilde velocimetry (μPIV) med flytende suspenderte partikler brukes for å kvantifisere slike luftstrømmer basert på hydrodynamisk likhet matching. Det god overensstemmelse mellom resultatene μPIV og forventede acinar strømningsfenomener antyder at mikrofluid plattformen kan tjene i nær fremtid som en attraktiv in vitro redskap for å undersøke direkte luftbårne representative partikkeltransport og deponering i acinar områder av lungene.
Introduction
En detaljert kvantifisering av luftstrømningsdynamikken i distal, Cell regioner i lungene er akutt mot å forstå luftstrøm blanding i lunge acinus og forutsi skjebnen til innånding av aerosoler i den dypeste airways 1-3. Dette siste aspektet er spesielt opptatt av når adressering på den ene siden farene ved innånding forurensende partikler eller omvendt i å søke nye strategier for økt og målrettet levering av legemidler av inhalerte therapeutics til lokaliserte lungesider 4, 5 samt for systemisk levering.
Hittil har luftveisstrømmer i de dype lunge acinar regioner blitt typisk undersøkt i silico å bruke Computational Fluid Dynamics (CFD) eller alternativt in vitro med skalert opp eksperimentelle modeller følgende hydrodynamisk likhet matching. I de siste tiårene, har CFD metoder blitt stadig mer brukt til å studere acinar strømningsfenomener, fra single alveolære modeller 6, 7 og Cell kanaler 8-12 til mer forseggjort i silikoaluminofosfater modeller som fanger anatomisk realistisk acinar trestrukturer med flere generasjoner av Cell kanaler og opp til flere hundre enkelt alveolene 13-15.
Sammen har numeriske innsats har vært sentral i å belyse den rolle og påvirkning av veggen bevegelse under puste bevegelser på påfølgende acinar luftstrøm mønstre. I fravær av pustebevegelse, strømmer statisk alveolene trekk resirkulerende i sine hulrom som oppviser ingen konvektive utveksling av luft mellom acinar kanalen og tannhulen 6, 7; Med andre ord, vil alveolare strømmer være helt isolert fra strømmene i de acinar trær og utveksling av luft ville resultere entydig fra diffusiv mekanismer. Med eksistensen av cykliske utvidelser av alveolar domene, men alveolare strømnings topologier blir drastisk endret og den resulting strømningsmønstre inne i alveolene er intimt knyttet til plasseringen av et tannhulen langs acinar treet (f.eks., proksimale distale vs. generasjoner).
Spesielt har det vært en teori i simuleringer som alveolære strømningsmønstre er sterkt påvirket av forholdet mellom alveolar til ductal strømningshastigheter slik at det proksimale generasjoner av pulmonal acinar treet, hvor dette forhold er forholdsvis stor følgende massebevarings over en trestruktur, funksjonen komplekset resirkulering flyter inne alveolar hulrom med irreversible væske pathlines. Med hver dypere acinar generasjon, forholdet mellom alveolar til ductal strømningshastigheter gradvis reduseres slik at distale acinar generasjoner oppviser flere radiale lignende strømlinjene som minner om enkle inflations og innklapper av en ballong. Med fremskritt innen moderne bildediagnostikk, lunge bildedata 16, 17 av gnagere, blant rotter og mus, har gitt opphav til noen av de første CFD simulasjon av anatomisk rekonstruerte acinar strømmer i rekonstruerte alveolene. Til tross for lovende fremgang, er disse nyere studier fortsatt begrenset til adressering luftstrøm fenomener i terminal alveolære sekker bare 18, 19 eller noen få alveolene rundt en enkelt kanal 20. Som et resultat, forblir state-of-the-art undersøkelser av luftstrømningsfenomener i acinus dominert av studier som fokuserer på generiske anatomisk-inspirerte geometrier av acinar miljø 2.
På den eksperimentelle siden, har ulike oppsett med en luftveier med en eller flere alveolene blitt utviklet gjennom årene 21-24. Likevel, det finnes ingen eksperimentelle modeller av bifurcating Cell luftveiene som er i stand til å etterligne fysiologiske åndedrett ved å utvide og trekke seg sammen i en pust-aktig måte. Gitt en mangel på attraktive eksperimentelle plattformer for hånden, forblir studie av acinar transport fenomener begrenset med hensyn til validating beregningsstudier og kritisk, det er fortsatt en mangel på eksperimentelle data tilgjengelig. . I de senere årene, Ma et al (2009) har konstruert en skalert opp stive-vegg modell av en acinus bestående av tre acinar generasjoner; Men mangelen på veggen bevegelse i denne modellen er begrenset dets evne til å fange realistiske alveolare strømningsmønstre i henhold til pusteforhold.
Andre skalert opp eksperimenter, inkludert en bevegelig vegg modell basert på anatomiske data fra oppleggs kopi ble nylig introdusert 25; men siden modellen bare tatt de to siste acinar generasjoner (ie., terminal blærer), det klarte ikke å fange opp de komplekse resirkuleringsstrømmer som preger mer proksimale acinar generasjoner. Disse sistnevnte eksempler på skalert opp eksperimenter videre understreke de pågående begrensninger med slike tilnærminger. Nærmere bestemt har ingen eksisterende eksperiment hittil vist hypotese overgang fra resirkulerende til den radiale strømmer langsden acinus og dermed bekrefte numeriske spådommer om strømnings topologier antatt å eksistere i det virkelige lunge acinar trær 7, 15. Kanskje mest kritisk, blir skalert opp eksperimenter svært begrenset i å undersøke inhalert partikkel transport og avsetning dynamikk 26 på grunn av vanskeligheter med å matche alle relevante ikke dimensjonale parametre (f.eks., partikkel diffusjon, et kritisk transportmekanisme for sub-micron partikler, er fullstendig neglisjert).
Med pågående eksperimentelle utfordringer, nye eksperimentelle plattformer som tillater undersøkelser av luftluftstrømmer og partikkel dynamikken i komplekse bevegelige vegger acinar nettverk er søkt. Her, en anatomisk-inspirert in vitro acinar modellen er innført. Dette microfluidic plattform ligner lunge acinar renner direkte ved representant acinar skala, og utvider stadig voksende utvalg av lunge microfluidic modeller 27, inkludert bronkial væske plug-flows 28-30 og alveolar-kapillært barriere 31.
Nemlig den foreliggende konstruksjon har en forenklet fem generasjon Cell luftveis tre med syklisk ekspanderende og kontraherende vegger, hvor sykliske bevegelser oppnås ved å styre trykket i et vannkammer som omgir de tynne PDMS sidevegger og hvor toppveggen er deformert ved en ytterligere vann kammer sitter direkte over acinar struktur. I motsetning til vanlige flerlags microfluidic enheter, er dette kammer ganske enkelt dannes ved å inkludere løpseksjon av en sprøyte inne i PDMS-enhet, og ikke krever fremstillingen av en ytterligere PDMS mugg.
Den miniatyriserte tilnærmingen presenteres her gir en enkel og allsidig middel for å reprodusere kompliserte acinar strukturer med bevegelige vegger i forhold til skalert opp modeller mens fange de underliggende egenskapene til acinar flyt miljø. Denne plattformen kan benyttes for flow visualisering ved hjelp av væske-suspenderte partikler inne i luftveiene (se Representant Resultater nedenfor). I nær fremtid vil modellen brukes med luftbårne partikler for å studere inhalert acinar partikkel dynamikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Master Fabrication
- Bruk dypreaktiv ioneetsing (DRIE) av et silisium på isolator (SOI) skive for å fremstille en hovedsilisiumskive som er beskrevet i tidligere arbeider 32, 33.
MERK: DRIE er å foretrekke til standard SU-8 mikro på grunn av de høye størrelsesforhold funksjoner (40 mikrometer brede og 90 mikrometer dype grøfter).
2. Støping og tetting av microfluidic Device
- Bland PDMS og herder på en 10: 1 vektforhold inne i en ren liten beholder for eksempel en plast veiing parabolen.
- Avgasse blandingen i en eksikator under vakuum inntil alle luftbobler er fjernet.
MERK: Forbered nok PDMS for alle påfølgende trinn. Her nedenfor, forkortelsen "PDMS" refererer alltid til de avgassede 10: 1 PDMS: herding agent blanding som ble utarbeidet i trinn 2.1 og 2.2. - Hell avgasset-blandingen til en høyde på omkring 1 mm over hovedplaten. Degas igjen i minst40 min for å fjerne alle luftbobler over wafer og minimalisere bobler under wafer.
MERK: Pass på at wafer er så nært som mulig til bunnen av tallerkenen. Hvis du trykke på wafer forsiktig til bunnen med 2 rørepinner og Degas igjen nødvendig. - Bake ved 65 ° C i 20 min i en naturlig konveksjonsovn.
MERK: Etter 20 minutter PDMS er herdet og nesten fullstendig kurert. Mens en lengre steketiden er mulig baking i 20 min sparer tid og forbedrer vedheftningen av det andre PDMS lag (se nedenfor) til den første. - Fil fat delen av en plastisk 2 ml sprøyte med en fin strø sand papir for å bedre etterlevelse av PDMS. I tillegg bruker sandpapir til å flate bunnen av sprøyten ved å plassere sandpapir på et flatt underlag og skyve bunnen av sprøyten på toppen av det. Rengjør sprøyten ved hjelp av trykkluft.
- Plasser løpseksjon av sprøyten på toppen av det første lag PDMS med large åpning som vender mot overflaten av PDMS, og helle et andre lag av PDMS på toppen av den første en til en høyde på ~ 5 mm, og avgasse PDMS nok en gang i en eksikator.
MERK: den andre PDMS lag skal helles fra den lille beholderen rundt sylinderen, og skal ikke gå inn i den. - Bake hele oppsettet ved 65 ° C i minst 2 timer i en naturlig konveksjonsovn.
Merk: Det er ikke nødvendig å holde hylsen på plass under herdingen prosesser siden vekten av PDMS å trykke mot den brede basen av sylinderen holder hylsen fast på plass. - Skjær gjennom PDMS mugg rundt mønstrede regionen av master wafer ved hjelp av en skalpell. Mens kutte, bør skalpell svakt berøre overflaten av wafer. Deretter forsiktig inn en tynn verktøy som wafer tang i hakket skapt av skalpell, og skrelle av PDMS kastet fra master wafer.
- Plasser kastet på en myk overflate dekket med aluminiumsfolie med mønstrede sidenvendt opp (det vil si., bør sylinderen henger fra kanten av bordet), og slå et hull i PDMS ved kammerets innløp og kanalen ved hjelp av et 1 mm biopsi slag.
- Coat et rent glass lysbilde med en (avgasser) 10: 1 PDMS: herding agent blanding ved hjelp av en spin coater programmert på 3000 rpm i 30 sek, og stek i> 1 time ved 65 ° C. Deretter rydde raset og PDMS kastet hjelp klar tape.
- Unn overflaten av PDMS mold og PDMS belagt glass lysbilde med O 2 plasma (for eksempel ved hjelp av en håndholdt corona treater) i 1 minutt, og trykk deretter forsiktig overflatene sammen og stek ved 65 ° C over natten (O / N) .
3. Enhet Fylling og Betjenings
- Blande vann suspenderte fluoriserende polystyrenpartikler med vann og glycerol i en glassflaske for å oppnå en 64/36 (v / v) glycerol / vannblanding med 0,25% (vekt / vekt) partikler ..
- Plassere en dråpe av glycerol oppløsning på toppen av kanalinnløpet og en dråpe DI water på kammeret innløpet, deretter plassere apparatet inne i en eksikator og vakuum for ~ 5 min.
MERK: Før du slipper vakuumet vente på boblene som dannes i dråpene av glyserol løsning og DI vann til pop. Ved vakuum utgivelsen væskene sugd inn i hulrommene inne i enheten. Dersom gjenværende luft forblir inne i kanalene, eliminere det ved påføring av ytre trykk på væsker (f.eks., Ved hjelp av en sprøyte) og tillater luften å diffundere inn i PDMS. - Injiser ~ 2 ml DI-vann inn i det øvre kammeret (dvs. sprøytesylinderen, fig. 2b) til den er helt fylt med vann. Deretter dekker den øverste kammer med en 19 måler sløv sprøytespissen, kuttet tuppen av en annen stump 19 måler sprøytespissen, og sett dette tipset til side kammerinnløp. Koble begge sprøyte tips til en 1 ml sprøyte via tynne Teflon slange og en T-formet kontakt.
MERK: Kontroller at en ml sprøyte, Teflon slanger, T-formet kontakten og topp kammer (2 ml sprøyte barrel) er alle fylt med vann uten bobler. Dette kan oppnås ved å åpne tilknytningspunkter, presser vann gjennom tomme seksjoner av rør og koble koblingspunktene. - Koble en ml sprøyte til sprøytepumpe forhåndsprogrammert til å etterligne for eksempel en rolig tidevannspustesyklus (med en periode med T = 4 sek) konstruert av lineære ramper, dvs. fra null til 1,8 ml / min i 1 sek, fra 1,8 ml / min til -1,8 ml / min i 2 sek og fra -1.8 ml / min tilbake til null i 1 sek.
4. Flow Visualisering Experiments: Micro-partikkel bilde velocimetry (μPIV)
- Mens enheten blir aktivert, får en rekke 9 - 12 faselåste, dobbel-ramme bilder av partikkel-seeded strøm ved hjelp av en mikropartikkel bilde velocimetry (μPIV) system som består for eksempel av en dobbel ramme-multieksponering CCD kameraet (f.eks., 1600 × 1200 piksler for å oppnå tilstrekkelig oppløsning), et dobbelt pulset Nd-YAG laser (bølgelengde: 532 nm, utgangsenergi: 400 mJ, pulsvarighet: 4 EFF), og en invertert mikroskop.
NB: Et slikt system er i stand til å oppnå ramme parene med en tidsforsinkelse på ned til noen få mikrosekunder mellom de første og andre rammer. For å oppnå faselåste dobbel rammebilder, er det nyttig å få en dobbel ramme serie på f.eks., 10 Hz (ramme parene er atskilt med 0,1 sek fra hverandre). Deretter, kan dataene bli omorganisert, slik at alle rammeparene som er atskilt med en full syklus tid (her T = 4 sek) for å danne en ny tidsserie. Bildeinnlastingen bør gjentas flere ganger mens den endrer lag tid mellom de første og andre ramme i hver ramme par (dvs., 100 usek til 0,1 sek) for å løse ulike strømnings regioner inne i alveolar hulrom.
Merk: alternative oppsett med hensyn til beste kombinasjonene av bildeinnhentingssystemer (. Dvs. kamera) og belysning kilder (dvs. lasere) til bilde slikmicroflows er også tilgjengelig 34, 35. - Bruk en sum-av-korrelasjonsalgoritme for å beregne faselåste hastighetsvektorkart av den resulterende strømningsfeltet fra bildeserien for hver tidsforsinkelse anvendes. Gjenta denne fremgangsmåten flere ganger med varierende etterslep ganger mellom den første og andre ramme i hver ramme par for å løse forskjellige strømnings regioner inne i alveolar hulrom. Deretter bruker du en dataanalyse program for å sy sammen de individuelle strømningskart i en fullstendig og detaljert kart over strømningsmønster ved gjennomsnitt overlappende datapunkter 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataassistert konstruksjon (DAK) og mikroskop bilder av in vitro acinar plattformen er presentert i Fig. En. Den biomimetic acinar modellen har fem generasjoner av forgrening rektangulære kanaler foret med alveolære-lignende sylindriske hulrom (Fig. 1). Her blir modell generasjoner nummerert fra generasjon 1 (for den mest proksimale generasjon) til generasjon 5 (for den mest distale generasjon). Legg merke til at bare den kanalen som fører til en generasjon er åpen til det ytre miljø ved hjelp av en åpning i PDMS. De 16 kanaler som fører bort fra generasjon 5 er igjen lukket til luft (fig. 1a). Ved å modulere med jevne vanntrykket i kamrene, er de tynne vegger som utgjør alveolære hulrom og kanaler syklisk deformert. Samtidig er taket av luftveiene deformert vertikalt ved hjelp av et ytterligere vannkammer som befinner seg over kanalene; å lage denne topp kammer i enenkel måte uten fremstilling av en ytterligere mikrofluidsjikt løpet av en sprøyte ble neddykket inne i PDMS før tverrbinding. Dette resulterte i en PDMS lag på omtrent 1 mm skille Cell kanaler og den øverste vannkammeret (se fig. 2).
De vann kamrene er forbundet med en sprøytepumpe som er programmert for å gjenta en serie av lineært skråstrømningshastigheter for å etterligne en vanlig å tung respirasjonsåndedrett scenario for et gjennomsnittlig voksent menneske med en 4-sec syklustiden (T). Dette resulterer i en periodisk reduksjon og økning av luftveis volum; siden uttakene er forseglet og bare innløpet er åpent til omgivelsene, blir fluidet inne i kanalene innåndet og utåndet fra anordningen gjennom innløpet, i analogi med en naturlig puste prosessen. Her ble de luftveiskanalene er fylt med en glycerol-oppløsning podet med fluorescerende partikler (se Protocol) og mikropartikkelbildet velocimetry (μPIV) ble anvendt for å kartlegge resulti ng strømnings felt over luftveiene treet 33.
Den normaliserte hastighet størrelse (u x / u x, max) i strømvis (f.eks., Aksial) er retningen på tvers av bredden av kanalene er vist i fig. 3. Resultatene er presentert på topp inhalering hastighet for hver av de 5 enhets generasjoner, og representerer 2D-projeksjon av strømningen i en tynn skive nær kanalens midtplan. For sammenligning er den analytiske løsning av steady-state laminær strømning for en uendelig lang kanal 36 også presentert i fig. 3.
Figur 4 viser strømlinjemønster og hastighetsstørrelser innenfor alveolære hulrom i midtplanet i luftveiene ved inhalering topp. Figurene 4a, b og c viser acinar generasjoner 1, 3 og 5, henholdsvis.
gur 1 "src =" / files / ftp_upload / 53588 / 53588fig1.jpg "/>
Figur 1: microfluidic Modell av acinar treet Network (a) CAD tegning av hele enheten.. (B) Close-up bilder av den acinar trestruktur som viser kanaler, kamrene, og de tynne veggene som skiller dem. Lilla piler indikerer de tilsvarende steder og positive y -Retninger av strømningsprofiler som er presentert i fig. 3. Tilpasset med tillatelse fra dommeren. 33.
Fig. 2: CAD Design av en mikrofluid enhet (a) Brutte linjer angir de rør som fører fra de laterale og øverste kammer til sprøytepumpe via en T-formet kontakt. (B) side skjære gjennom midten av anordningen som illustrerer plasseringen av sprøyten i den PDMS kastet. ENdapted med tillatelse fra dommeren. 33.
Figur 3: acinar strømningshastigheter Normaliserte ductal hastighetsprofiler (u x / u x, max) ekstrahert fra PIV langs bredden av kanalen i generasjoner 1 til 5 på de steder som er vist på fig.. 1, y = 0 faller sammen med midtpunktet plasseringen over kanalen og u x, max = 0,0104 m / sek tilsvarer her til toppen strømvis hastighet måles i enheten generasjon 1. PIV målinger er vist her på topp innånding (t = 0,6 sek) og den sorte linje tilsvarer den analytiske hastighetsprofilen for krypstrømning inne i en rektangulær kanal med W d = 345 um og <em> h = 92 mikrometer. Tilpasset med tillatelse fra dommeren. 33.
Figur 4: Velocity størrelser og tilsvarende effektivisere mønstre. Data oppnådd fra mikro PIV for en projeksjon av strømnings ekstrahert i midtplanet av en tannhule som ligger på enhets generasjoner 1, 3 og 5. Strømningsfelt er vist ved tilnærmet maksimal inhalering (t = 0,6 sek). Velocity størrelser vises på en logaritmisk skala. Tilpasset med tillatelse fra dommeren. 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritisk funksjon i microfluidic acinar plattform som presenteres her er dens evne til å reprodusere fysiologisk-realistiske pustebevegelser som gir opphav til fysiologiske strømningsprofiler og hastigheter innen acinar kanaler og innen alveolene. Siden microfluidic kanalene er produsert med et relativt lavt sideforhold (dvs., W d / h ≈ 3,9, hvor w d er kanalbredden, og h er den kanalhøyde), de målte strømmene vis mere plugglignende flyteegenskaper sammenlignet de forventede parabolske strømningsprofiler som ville eksistere i sirkulære kanaler. Likevel er de målte hastighetene er godt innenfor det fysiologiske område; er det funnet at den karakteristiske dimensjons Reynolds tall, sammenligner treghets til viskøse krefter, gir et maksimum på 0,01 svarende til midten for å distale acinar regioner, etter semi-empiriske beregninger 2.
innhold "> Her Reynolds tall er definert som Re = ¾ x, maks D h / ν glyserol løsning, der U x, er maks gjennomsnittlig strømvis hastighet over kanalen midtplanet i det øyeblikket av maksimal strømningshastighet, er D h hydrauliske diameter av kanalen og ν glycerol løsning er den kinematiske viskositet av glycerol oppløsning som anvendes for strømningsvisualisering som var tilpasset den kinematiske viskositet av luft ved ~ 24 ° C (ν luft = 1,55 x 10 -5 m2 / sek, ν glycerol-løsning = 1,51 x 10 -5 2 m / sek). i tillegg ble en reduksjon i strømnings størrelse med omtrent en faktor på to observeres etter hvert som forventet fra forgreningende dikotome forgreninger mønstre av acinar modellen. Nemlig, er denne kaskade av strømningshastigheter et viktig trekk ved acinar strømmer i luftveis trær.Strømningsprofiler i nærheten av og innenfor alveolære hulrom (fig. 4) viser at ductal hastighetene er gradvis avtagende mot dypere acinar generasjoner. I tillegg, strømningsstørrelser faller bratt langs åpningen av alveolene som resulterer i fluidhastigheter som er to til tre størrelsesordener langsommere inne i alveolene i forhold til kanalene; slike strømnings topologier ble tidligere rapportert i flere numeriske studier 1, 9, 15 I tillegg strømningsmønstrene endrer seg vesentlig fra en acinar generasjon til en annen, som spådd i simuleringer 7, 15., mens generasjon 1 har et resirkuleringssone som omtrent sammenfallende med sentrum av tannhulen (fig. 4, til venstre), generasjon 3 er karakterisert ved en resirkuleringssone som er forskjøvet mot den proksimale siden avalveolus med en mer åpen strømlinjemønster (Fig. 4, midten). Endelig er radialstrømlinjer uten noen resirkuleringssone observert i enheten generasjon 5 (fig. 4, til høyre). Så langt forfatternes kunnskap, er dette første gang at eksistensen av et bredt spekter av alveolære strømningsmønster fanges eksperimentelt.
Suksessen til presenterte metoden avhenger av noen kritiske trinn i microfabrication protokollen. Først, for å hindre at de tynne PDMS veggene fra å rive ved frigjøring fra hovedplaten etset mønster på overflaten av skiven skal ha rette vegger og må ikke fester seg til de herdede PDMS. Det er derfor sterkt anbefalt å fremstille waferne ved hjelp av DRIE av en SOI-skive som beskrevet i Fishler et al. (2013). Slik master wafer er holdbare og kan lett bli belagt med et anti-klebesjikt ved enten silanizing overflaten som beskrevet i Fishler et al. (2013), eller ved å sørge that det siste trinnet i DRIE-prosessen er at av passivering med CF4. Et annet kritisk punkt er innlevering (trinn 2,5) og innebygging (trinn 2.6) sprøytesylinderen for å skape den øverste kammeret. Luftbobler fanget mellom sprøyten base og første PDMS lag kan i stor grad redusere integritet og holdbarhet av produsert enhet. For å hindre bobledannelse, er det kritisk at bunnen av sprøyteløpet er flatt og jevnt arkivert.
Mens dagens design muliggjør fabrikasjon av en to-lags-enheten ved hjelp av bare en hovedplaten, kan en modifisert fremgangsmåte inkluderer å skape et ytterligere PDMS lag som inneholder en sirkulær hakk for å danne det øverste kammer. For denne andre PDMS lag en ekstra hovedplaten med en sirkulær ås kan fremstilles ved hjelp av standard SU-8 fotolitografi. En ytterligere modifikasjon av protokollen kan omfatte en annen metode for PDMS binding som ikke krever en korona-behandlings. For å feste PDMS formen til glassetslide, første strøk av objektglass som beskrevet i trinn 2.10 i protokollen, men bruke en 5: 1 i stedet for en 10: 1 PDMS: herding-agenten vektforhold. Stek belagt glass i 15 minutter ved 65 ° C i en naturlig konveksjon ovn, trykker du på PDMS mold til PDMS belagt glass, og stek over natten ved 65 ° C i en naturlig konveksjon ovn.
I anledning av væske lekker fra bindeflate mellom PDMS mugg og glass følgende tiltak kan iverksettes: (1) sørge for at koronaen treater produserer elektriske gnister under behandling, hvis ikke, øke utgangsspenning, (2) forlenge behandlingstiden med korona-behandlings og (3) bruke alternativ metode for binding av PDMS formen til glasset (se avsnittet ovenfor). Ofte vann kan lekke gjennom forbindelsen av den tynne teflonslange til kammerinnløpet. For å omgå slike lekker, sørg for at 19-gauge butte sprøytespissen brukes til å koble Teflon slangen til innløpet. Hvis det lekker vann mellom PDMS mold og the øverste kammer (2 ml sprøyte fat) sørge for at bunnen av sprøyteløpet ble riktig registrert (se trinn 2,5 i Protocol), og at det andre lag av PDMS ble hellet høy nok (~ 5 mm over den første PDMS sjikt ).
Legg merke til at graden av deformasjon veggen er svært avhengig av PDMS mekaniske egenskaper. Små endringer i fremstillingsprosedyren av anordningene kan medføre betydelig variasjon av de målte hastigheter mellom forskjellige enheter. For å sikre maksimal repeterbarhet bruk konstant forberedelse forhold (fuktighet, steketider osv.). I tillegg kan finjustering av volumendringen i løpet av anordningen aktivering oppnås ved å visualisere den øvre overflate av kanalene ved hjelp av fasekontrastmikroskopi og justering av hastighets ramper av sprøytepumpen, slik at den øvre overflate av kanalen er avbøyd til den ønskede avstand som målt ved hjelp av z-motion til mikroskoptrinnet.
En viktig limitasjon av den nåværende teknikk er at de nøyaktige morfologiske egenskaper (for eksempel anatomi, morfometri) i lunger ikke kan gjengis nøyaktig. Faktisk tillater den plane utformingen av acinar modellen ikke fanger for eksempel out-of-plane acinar bifurcations og forholdet mellom alveolar til ductal volum er mye lavere enn målt in vivo verdier 37. I tillegg er den forenklede mikrofluid geometrien fanger opp bare en liten del av en hel acinus. Til tross for disse begrensninger, er den foreliggende modell i stand til å reprodusere forventede strømningsmønstre og hastigheter direkte på den sanne anatomiske lengdeskala, og representerer derfor et verdifullt testplattform for acinar transportfenomener.
For å konkludere, de utvalgte microfluidic modeller av lunge acinus viser store løftet som en in vitro verktøy for kvantitative undersøkelser av luft acinar mene etterligne pustemønster. Her er den enkle acinar modellen består av fem generations å utvide og kontrahering Cell kanaler, og dermed gjengi noen av de viktigste underliggende strømningsegenskaper forventet å eksistere innenfor acinar regionen i lungene. Flow visualisering, ved hjelp av mikro-PIV, innenfor alveolar hulrom gir for første gang eksperimentelle bevis på omfanget av komplekse resirkulerende og radial alveolære strømmer langs acinar treet. Dette microfluidic tilnærmingen gjør fabrikasjon av komplekse acinar konstruksjoner med bevegelige vegger etter en relativt enkel prosedyre, og tilbyr et attraktivt alternativ til skalert opp acinar modeller. Spesielt med den viktigste fordelen med å levere en modell på en en-til-en-skala, sanne inhalert acinar partikkel dynamikk kan undersøkes uten videre behov for dynamisk likhet matching.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent | Dow Corning | (240)4019862 | Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit |
| Plastipak 2 ml syringe | BD | 300185 | |
| Norm-Ject Luer slip 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | |
| 1 mm Biopsy punch | Kai Medical | BP-10F | |
| Laboratory Corona Treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| PHD Ultra Syringe pump | Harvard apparatus | 703006 | |
| Dyed red rqueous fluorescent particles | Thermo-Scientific | Uncatalloged 0.86 µm beads were used | |
| Glycerin AR | Gadot | 830131320 | |
| FlowMaster MITAS micro-particle image velocimetry (µPIV) system | LaVision | 1108630 |
References
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z. Airflow and Particle Transport in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 301-334 (2010).
- Sznitman, J. Respiratory microflows in the pulmonary acinus. J. Biomech. 46 (2), 284-298 (2013).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Gas and aerosol mixing in the acinus. Respir. Physiol. Neurobiol. 163 (1-3), 139-149 (2008).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted Drug-Aerosol Delivery in the Human Respiratory System. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10 (1), 195-220 (2008).
- Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Schulz, H., Takenaka, S., Butler, J. P., Henry, F. S., Tsuda, A. Nanoparticle delivery in infant lungs. Proc. Natl. Acad. Sci. 109 (13), 5092-5097 (2012).
- Sznitman, J., Heimsch, F., Heimsch, T., Rusch, D., Rosgen, T. Three-Dimensional Convective Alveolar Flow Induced by Rhythmic Breathing Motion of the Pulmonary Acinus. J. Biomech. Eng. 129 (5), 658-665 (2007).
- Tsuda, A., Henry, F. S., Butler, J. P. Chaotic mixing of alveolated duct flow in rhythmically expanding pulmonary acinus. J. Appl. Physiol. 79 (3), 1055-1063 (1995).
- Henry, F. S., Butler, J. P., Tsuda, A. Kinematically irreversible acinar flow: a departure from classical dispersive aerosol transport theories. J. Appl. Physiol. 92 (2), 835-845 (2002).
- Kumar, H., Tawhai, M. H., Hoffman, E. A., Lin, C. L. The effects of geometry on airflow in the acinar region of the human lung. J. Biomech. 42 (11), 1635-1642 (2009).
- Lee, D. Y., Lee, J. W. Characteristics of particle transport in an expanding or contracting alveolated tube. J. Aerosol Sci. 34 (9), 1193-1215 (2003).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. I. Diffusional deposition in the absence of gravity. J. Appl. Physiol. 76 (6), 2497-2509 (1994).
- Tsuda, A., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Effects of alveolated duct structure on aerosol kinetics. II. Gravitational sedimentation and inertial impaction. J. Appl. Physiol. 76 (76), 2510-2516 (1994).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol bolus dispersion in acinar airways—influence of gravity and airway asymmetry. J. Appl. Physiol. 113 (3), 442-450 (2012).
- Ma, B., Darquenne, C. Aerosol deposition characteristics in distal acinar airways under cyclic breathing conditions. J. Appl. Physiol. 110 (5), 1271-1282 (2011).
- Heimsch, J., Sznitman, T., Wildhaber, J. H., Tsuda, A., Rösgen, T. Respiratory Flow Phenomena and Gravitational Deposition in a Three-Dimensional Space-Filling Model of the Pulmonary Acinar Tree. J. Biomech. Eng. 131 (3), 031010 (2009).
- Litzlbauer, H. D., Korbel, K., Kline, T. L., Jorgensen, S. M., Eaker, D. R., Bohle, R. M., Ritman, E. L., Langheinrich, A. C. Synchrotron-Based Micro-CT Imaging of the Human Lung Acinus. Anat. Rec. Adv. Integr. Anat. Evol. Biol. 293 (9), 1607-1614 (2010).
- Tsuda, A., Filipovic, N., Haberthür, D., Dickie, R., Matsui, Y., Stampanoni, M., Schittny, J. C. Finite element 3D reconstruction of the pulmonary acinus imaged by synchrotron X-ray tomography. J. Appl. Physiol. 105 (3), 964-976 (2008).
- Berg, E. J., Weisman, J. L., Oldham, M. J., Robinson, R. J. Flow field analysis in a compliant acinus replica model using particle image velocimetry (PIV). J. Biomech. 43 (6), 1039-1047 (2010).
- Sznitman, J., Sutter, R., Altorfer, D., Stampanoni, M., Rösgen, T., Schittny, J. C. Visualization of respiratory flows from 3D reconstructed alveolar airspaces using X-ray tomographic microscopy. J. Vis. 13 (4), 337-345 (2010).
- Henry, F. S., Haber, S., Haberthür, D., Filipovic, N., Milasinovic, D., Schittny, J. C., Tsuda, A. The Simultaneous Role of an Alveolus as Flow Mixer and Flow Feeder for the Deposition of Inhaled Submicron Particles. J. Biomech. Eng. 134 (12), 121001 (2012).
- Chhabra, S., Prasad, A. K. Flow and Particle Dispersion in Lung Acini: Effect of Geometric and Dynamic Parameters During Synchronous Ventilation. J. Fluids Eng. 133 (7), 071001 (2011).
- Cinkotai, F. F. Fluid flow in a model alveolar sac. J. Appl. Physiol. 37 (2), 249-251 (1974).
- Karl, A., Henry, F. S., Tsuda, A. Low reynolds number viscous flow in an alveolated duct. J. Biomech. Eng. 126 (4), 420-429 (2004).
- Tippe, A., Tsuda, A. recirculating flow in an expanding alveolar model: experimental evidence of flow-induced mixing of aerosols in the pulmonary acinus. J. Aerosol Sci. 31 (8), 979-986 (2000).
- Berg, E. J., Robinson, R. J. Stereoscopic particle image velocimetry analysis of healthy and emphysemic alveolar sac models. J. Biomech. Eng. 133 (6), 061004 (2011).
- Ma, B., Ruwet, V., Corieri, P., Theunissen, R., Riethmuller, M., Darquenne, C. CFD simulation and experimental validation of fluid flow and particle transport in a model of alveolated airways. J. Aerosol Sci. 40 (5), 403-414 (2009).
- Kumar Mahto, S., Tenenbaum-Katan, J., Sznitman, J. Respiratory Physiology on a Chip. Scientifica. 2012, e364054 (2012).
- Huh, D., Fujioka, H., Tung, Y. C., Futai, N., Paine, R., Grotberg, J. B., Takayama, S. Acoustically detectable cellular-level lung injury induced by fluid mechanical stresses in microfluidic airway systems. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (48), 18886-18891 (2007).
- Song, Y., Baudoin, M., Manneville, P., Baroud, C. N. The air–liquid flow in a microfluidic airway tree. Med. Eng. Phys. 33 (7), 849-856 (2011).
- Tavana, H., Huh, D., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microfluidics, Lung Surfactant, and Respiratory Disorders. Lab Med. 40 (4), 203-209 (2009).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Pihl, J., Sinclair, J., Sahlin, E., Karlsson, M., Petterson, F., J, O. lofsson, Orwar, O. Microfluidic Gradient-Generating Device for Pharmacological Profiling. Anal. Chem. 77 (13), 3897-3903 (2005).
- Fishler, R., Mulligan, M. K., Sznitman, J. Acinus-on-a-chip: A microfluidic platform for pulmonary acinar flows. J. Biomech. 46 (16), 2817-2823 (2013).
- Lindken, R., Rossi, M., Grosse, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (microPIV): recent developments, applications, and guidelines. Lab. Chip. 9 (17), 2551-2567 (2009).
- Wereley, S. T., Meinhart, C. D. Recent Advances in Micro-Particle Image Velocimetry. Annu. Rev. Fluid Mech. 42 (1), 557-576 (2010).
- Bruus, H. Theoretical Microfluidics. Oxford Master Series in Condensed Matter Physics. , (2008).
- Haefeli-Bleuer, B., Weibel, E. R. Morphometry of the human pulmonary acinus. Anat. Rec. 220 (4), 401-414 (1988).
