Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Utvikling av en Backbone Cyclic Peptide Library som Potential antiparasittisk Therapeutics Bruke Mikrobølgeovn Bestråling

Published: January 26, 2016 doi: 10.3791/53589
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

Abstract

Protein-protein interaksjoner (PPI) er nært involvert i nesten alle biologiske prosesser, og er knyttet til mange menneskelige sykdommer. Derfor er det en stor innsats for å målrette PPIs i grunnforskning og i den farmasøytiske industrien. Protein-protein grensesnitt er vanligvis stor, flat, og mangler ofte lommer, kompliserer oppdagelsen av små molekyler som er rettet mot slike nettsteder. Alternative målretting tilnærminger som bruker antistoffer har begrensninger på grunn av dårlig oral biotilgjengelighet, lav celle permeabilitet, og produksjon ineffektivitet.

Ved hjelp av peptider for å målrette PPI grensesnitt har flere fordeler. Peptider har høyere konformasjonell fleksibilitet, øket selektivitet, og er generelt billig. Imidlertid peptider har sine egne begrensninger, inkludert dårlig stabilitet og ineffektivitet krysse cellemembraner. For å overvinne disse begrensningene, kan peptidet cyklisering utføres. Syklisering har vist seg å forbedre selektiviteten peptid, Metabolsk stabilitet og biotilgjengelighet. Imidlertid forutsi den bioaktive konformasjon av et cyklisk peptid er ikke trivielt. For å overvinne denne utfordringen, til en attraktiv tilnærming det screene en fokusert bibliotek til skjermen hvor alle ryggrad sykliske peptider ha samme primærsekvens, men varierer i parametere som påvirker deres konformasjon, for eksempel ringstørrelse og posisjon.

Vi beskriver en detaljert protokoll for å syntetisere et bibliotek med ryggrad sykliske peptider rettet mot spesifikke parasitt PPIer. Ved hjelp av en rasjonell design tilnærming, har vi utviklet peptider som stammer fra scaffoldprotein L eishmania reseptor for aktivert C-kinase (mangel). Vi antok at sekvenser i MANGEL som er bevart i parasitter, men ikke i pattedyrverts homolog, kan representere interaksjons nettsteder for proteiner som er avgjørende for parasittene 'levedyktighet. De cykliske peptider ble syntetisert ved anvendelse av mikrobølgebestråling for å redusere reaksjonstiden og økeeffektivitet. Utvikle et bibliotek av ryggraden sykliske peptider med forskjellige ringstørrelser letter et systematisk skjerm for de mest biologisk aktive konformasjon. Denne metoden gir en generell, rask og lettvint måte å syntetisere cykliske peptider.

Introduction

Protein-protein interaksjoner (PPI) spiller en sentral rolle i de biologiske prosesser, fra intracellulær signaltransduksjon til celledød 1. Derfor målretting PPIs er av fundamental betydning for grunnleggende forskning og terapeutiske anvendelser. PPIer kan reguleres ved spesifikke antistoffer og stabile, men antistoffer som er dyre og vanskelige å fremstille og har dårlig biotilgjengelighet. Alternativt kan PPIs bli målrettet av små molekyler. Små molekyler som er lettere å syntetisere og billig i forhold til antistoffer; men de er forholdsvis mindre fleksibelt og passer bedre til små hulrom enn i store protein-protein-grensesnitt 2,3. Ulike studier har demonstrert at peptider, som er enklere og billigere enn antistoffene og mer fleksible enn små molekyler, kan binde proteingrenseflater og regulere PPIer 4,5. Den globale terapeutisk peptid markedet ble verdsatt rundt femten milliarder dollar i 2013 og vokser 10,5% annually 6. Videre er det mer enn 50 markeds peptider, rundt 270 peptider i ulike faser av klinisk testing, og ca 400 peptider i avanserte prekliniske faser 7. Selv om mange peptider blir brukt som narkotika, peptider fortsatt utgjøre flere utfordringer som begrenser deres utbredt program blant annet dårlig biotilgjengelighet og stabilitet, ineffektivitet i krysset cellemembraner, og conformational fleksibilitet 8,9. Et alternativ til å overvinne disse ulemper, er å bruke forskjellige modifikasjoner som lokal (D-aminosyren og N-alkylering) og global (cyklisering) begrensninger 8,10-12. Disse endringene forekommer også naturlig. For eksempel cyklosporin A, en immunosuppressant cyklisk naturlig peptid, inneholder en enkelt D-aminosyre og gjennomgår N-alkylerings modifikasjoner 13,14.

Modifikasjon av naturlige aminosyrer for å fremkalle lokale begrensninger, slik som D- og N-alkylering, ofte påvirker peptid9; s biologisk aktivitet. Men ringslutning, karakterisert ved at sekvensen av interesse kan være den samme, er det mer sannsynlig å bevare biologisk aktivitet. Ringslutning er en meget attraktiv måte å begrense peptid konformasjonell plass ved å redusere likevekt mellom forskjellige konformasjoner. Det øker vanligvis biologisk aktivitet og selektivitet ved å begrense peptidet til den aktive konformasjon som formidler bare en funksjon. Syklisering forbedrer også stabiliteten peptid ved å holde peptidet i en konformasjon som er mindre kjennes av nedbrytende enzymer. Faktisk ble sykliske peptider vist å ha forbedret metabolsk stabilitet, biotilgjengelighet, og selektivitet i forhold til sine lineære kolleger 15-17.

Imidlertid kan ringslutning være et tveegget sverd fordi det i noen tilfeller begrensningen kan hindre peptidene fra å oppnå et bioaktivt konformasjon. For å overvinne dette hinderet, et fokusert bibliotek hvor alle peptider som har samme primær-sekvensene og dermed konstant pharmacophores kan syntetiseres. Peptider i biblioteket forskjellig parametre som påvirker strukturen, slik som ring størrelse og posisjon, for deretter å screene for de bioaktive konformasjon 9,18.

Peptider kan syntetiseres både i oppløsning og ved en fast-fase peptidsyntese (SPPS) tilnærming, som nå er mer utbredt peptidsyntesen tilnærming og vil bli nærmere omtalt. SPPS er en prosess der kjemiske omdannelser utføres på en fast bærer via en linker for å fremstille et bredt spekter av 19 syntetiske forbindelser. SPPS muliggjør montering av peptider ved suksessiv kobling av aminosyrer på en trinnvis måte fra den C-terminale ende, som er festet til en fast bærer, til den N-terminale ende. De N-a-aminosyre-sidekjeder må være maskert med beskyttelsesgrupper som er stabile i de reaksjonsbetingelser som anvendes under peptid forlengelse for å sikre at tilsetning av en aminosyre pr step. I det siste trinnet blir peptidet frigjort fra harpiksen og sidekjedebeskyttende grupper samtidig fjernes. Mens peptidet blir syntetisert, kan alle oppløselige reagenser fjernes fra peptid-faststoffbærermassen ved filtrering og vasket bort ved slutten av hvert koblingstrinn. Med et slikt system kan et stort overskudd av reagenser ved høy konsentrasjon drive koblingsreaksjoner til ferdigstillelse og alle de syntesetrinn kan utføres i samme kar uten noen overføring av materiale 20.

Selv SPPS har noen begrensninger som for eksempel produksjon av ufullstendige reaksjoner, sidereaksjoner, urene reagenser, samt vanskeligheter med å overvåke reaksjons 21, har fordelene av SPPS gjort det "gullstandard" for peptidsyntese. Disse fordeler innbefatter muligheten til å inkorporere ikke-naturlige aminosyrer, automasjon, lett rensing, minimeres fysiske tap, og bruken av overskudd av reagenser, noe som resulterer ihøye utbytter. SPPS har vist seg å være svært nyttig i syntesen av vanskelige sekvenser 21,22, fluorescerende modifiseringer 23, og peptid bibliotek 24,25. SPPS er også svært nyttig for andre poly-kjeden forsamlinger som oligonukleotider 26,27, oligosakkarider 28,29 og peptid nukleinsyrer 30,31. Interessant, i noen tilfeller, ble SPPS vist seg å være fordelaktig for syntese av små molekyler som er tradisjonelt laget i oppløsning 32,33. SPPS brukes både i liten skala for forskning og undervisning 34,35 samt stor skala i bransjen 36-38.

To syntese strategier som brukes hovedsakelig i SPPS metodikk for syntese av peptider er butyloxycarbonyl (Boc) og 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc). Den opprinnelige strategi innført SPPS var Boc, noe som krever sterke sure betingelser for å fjerne sidekjedebeskyttende grupper, og spalter peptidet fra rEsin. Fmoc-baserte peptidsyntese, men anvender moderate betingelser for base, og er en mildere alternativ til syrelabile Boc-protokollen 39. Fmoc-strategien anvender ortogonale t-butyl (tBu) side-kjedebeskyttelse som er fjernet i det siste trinnet av syntesen, mens spalte peptidet fra harpiksen under sure betingelser.

Det generelle prinsipp for peptidsyntese i fast bærer er presentert i figur 1. Den første aminosyre, maskert av en midlertidig beskyttende gruppe på N-α-terminus, er satt inn på harpiksen fra C-terminus. En semi-permanent beskyttende gruppe for å maskere sidekjeden brukes også om nødvendig (figur 1, trinn 1). Syntesen av mål-peptidet er satt sammen fra den C-terminale enden til den N-terminale ende ved gjentatte sykluser av avbeskyttelse av N-α-midlertidig beskyttelsesgruppen (figur 1, trinn 2) og kobling av den neste beskyttede aminosyre (figur 1 ong>, trinn 3). Etter at den siste aminosyren er lastet inn (figur 1, trinn 4), blir peptidet spaltet fra harpiksbæreren og de ​​semi-permanente beskyttende grupper er fjernet (figur 1, trinn 5).

Figur 1
Figur 1. Generell ordningen fastfasepeptidsyntese. Er N-α-beskyttet aminosyre forankret ved hjelp av karboksylgruppen via en linker til harpiksen (trinn 1). Det ønskede peptid er montert på en lineær måte fra den C-terminale enden til den N-terminale ende ved gjentatte sykluser av avbeskyttelse av den midlertidige beskyttelsesgruppen (TPG) fra N-α (trinn 2) og aminosyresekvensen kopling (trinn 3). Etter oppnåelse av syntesen (trinn 4), blir de semi-permanente beskyttende grupper (SPG) avbeskyttes under spalting peptid (trinn 5).få = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Etter montering av komplett peptidkjeden kan cykliseringen oppnås ved flere alternativer: (a) head-to-tail syklisering - Dette er en praktisk måte, men begrenset, siden det gir bare ett alternativ for cykliseringen (Figur 2A), (B) syklisering ved hjelp av aminosyrene fra sekvensen av interesse som inneholder bioaktive funksjonelle grupper - men bruken av disse aminosyrer kan påvirke den biologiske aktivitet (figur 2B), og (C) cyklisering ved tilsetning av aminosyrer (eller andre byggeklosser) uten å forstyrre det bioaktive sekvens. Vi presenterer disse molekylene er utbredt som det tillater produksjon av fokusert biblioteker uten å endre rekkefølgen av interesse (figur 2C).

Figur 2
Figur 2. Alternative strategier cykle peptid (A) hode til hale ringslutning, via en peptid-binding mellom C-terminalen og N-terminalen.; (B) cyklisering mellom funksjonelle grupper som for eksempel en disulfidbinding mellom cystein-rester (1), eller en amidbinding mellom sidekjedene av lysin til asparaginsyre / glutaminsyre (2) eller sidekjeden til N- eller C-terminale ende (3 -4); (C) syklisering ved å legge ekstra aminosyrer eller aminosyrederivater eller små molekyler, for eksempel før (R0) og etter (R7) den bioaktive sekvens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mikrobølgeassistert syntese benytter mikrobølgestråling til å varme reaksjoner, og dermed akselerere organiske kjemiske transformasjoner 40,41. Mikrobølgekjemi er basert på evnen av reagenset / løsningsmiddel for å absorberemikrobølgeenergi og konvertere den til å varme 42. Før teknologien ble utbredt, store ulemper måtte overvinnes, herunder kontrollerbarhet og reproduserbarheten av synteseprotokoller og mangel på tilgjengelige systemer for tilstrekkelig temperatur og trykk kontroller 43,44. Den første rapporten om mikrobølgeassistert peptidsyntese ble utført ved anvendelse av en kjøkken mikrobølgeovn for å syntetisere flere korte peptider (7-10 aminosyrer) med betydelig forbedring av koblingsgraden og renheten 45. Dessuten, ble mikrobølgeenergi vist å redusere kjede aggregering, redusere sidereaksjoner, begrenser racemisering, og forbedrer koblingsrater, som alle er kritiske for vanskelige og lange sekvenser 46-53.

Dag ved bruk av mikrobølgebestråling for syntese av peptider eller beslektede forbindelser på en fast bærer er omfattende, blant (A) syntese i vann i stedet for organiske oppløsningsmiddel 54; (B) syntese av peptider medvanlig post-translasjonelle modifikasjoner, så som 55-58 glykopeptider eller fosfor 59-61, hvis syntese er vanligvis vanskelig på grunn av den lave koblingsgrad på sterisk hindrede aminosyrederivater; (C) Syntese av peptider med endring i ryggraden, slik som azapeptides, som kan dannes ved erstatning av C (α) for en aminosyrerest med et nitrogenatom 62 eller peptoids, hvis sidekjede er forbundet med amidnitrogenet snarere enn Cα atom 63,64; (D) Syntese av sykliske peptider 65-71; og (E) Syntese av kombinatoriske bibliotek 51,72. I mange tilfeller forfatterne rapporterte høyere effektivitet og redusert syntese tid ved hjelp av mikrobølgebestråling i forhold til den konvensjonelle protokollen.

Ved hjelp av en rasjonell design 73-75, har vi utviklet anti-parasittiske peptider som ble avledet fra stillaset L eishmania sin reseptor for aktivert C-kinase (mangel). MANGEL spiller en viktig rolle i den tidlige fasen av Leishmania infeksjon 76. Parasitter uttrykker lavere nivåer av MANGEL klarer å parasitize selv med svekket immunforsvar mus 77 som mangler er involvert i viktige parasittsignale prosesser og proteinsyntese 78. Derfor er MANGEL en nøkkel scaffoldprotein 79 og et verdifullt stoff målet. Fokusering på sekvenser i MANGEL som er bevart i parasittene, men ikke i verts pattedyr homolog RACK, identifiserte vi en 8 aminosyrepeptid (RNGQCQRK) at redusert Leishmania sp. Levedyktighet i kultur.

Her beskriver vi en protokoll for syntese av ryggraden sykliske peptider avledet fra mangelen proteinsekvensen som er beskrevet ovenfor. Peptidene ble syntetisert på en fast bærer ved hjelp av mikrobølgeoppvarming ved SPPS metodikk med Fmoc / tBu-protokollen. Peptider ble konjugert til en TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) bærerpeptid gjennom en amidbinding sådel av SPPS. TAT-baserte transport av en rekke av last inn i celler har vært brukt i over 15 år, og levering av lasten til subcellulære organeller har blitt bekreftet 80. Fire forskjellige linkere, ravsyre og glutarsyreanhydrid, samt adipinsyre og pimelinsyre, ble brukt til å utføre ringslutningen for å generere karboksylsyre-linkere på to til fem karbonatomer. Ringslutning ble gjort ved hjelp av mikrobølgeenergi, og de endelige cleavage og sidekjede-avbeskyttelsestrinn var gjort manuelt uten mikrobølgeenergi. Bruk av en automatisert syntetisator mikrobølge forbedret produktrenhet, økt produktutbytte, og redusert varighet av syntesen. Denne generelle protokoll kan anvendes for andre studier som anvender peptider for å forstå viktige molekylære mekanismen in vitro og in vivo og videreutvikle potensielle legemidler for sykdommer hos mennesker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utstyr og reagenser Forberedelse

  1. Forbereder utstyr
    1. Utføre alle trinnene inne i et avtrekksskap ved bruk av riktig personlig verneutstyr.
    2. Kjemisk syntetisere peptider på faste bærer ved hjelp av en mikrobølgeovn Peptide Synthesizer med en ekstra modul av Discover utstyrt med en fiberoptisk temperaturføler for styring av mikrobølgeeffekt levering i en Teflon-reaksjonsbeholder (30 ml, med en glass-fritte) eller i en engangs polypropylen patron (12 ml, med en grov fritte).
    3. For riktig blanding, kobler nitrogentilførsel til reaksjonsbeholderen, eller alternativt å forsegle begge ender av polypropylen patronen, og plassere på en rotasjonsrister.
    4. Å drenere reaksjonsblandinger eller vasker, koble til huset vakuum via en avfall felle.
    5. Plasser den fiberoptiske sonde inn i reaksjonskaret.
  2. Forbereder reagenser
    1. Forbered harpiks ved veiing Rink Amid AM resin 100-200 mesh (0,204 mg), Tilsett 5 ml av 1: 1 blanding av N, N-dimetylformamid (DMF) / diklormetan (DCM) til reaksjonsbeholderen / polypropylen kassetten for å vaske harpiksen ned, rystes i 2-4 timer for å svelle på riktig måte, og avløp.
    2. Forbered 0,2 M 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc) -amino syreløsninger ved å oppløse den tilsvarende Fmoc-aminosyren i DMF og vortex blandingen til aminosyrene blir oppløst (tabell 1).
    3. Forbered 0,45 M aktivatorløsning blanding ved å oppløse 18,96 g O - (benzotriazol-1-yl) - N, N, N ', N' -tetramethyluronium heksafluorfosfat (HBTU) i 100 ml DMF og virvling av blandingen inntil det faste stoff er oppløst (tabell 1).
    4. Forbered 2 M aktivator baseløsning blanding ved å kombinere 34,8 ml N, N-diisopropyletylamin (DIEA) med 65,2 ml 1-metyl-2-pyrrolidinon (NMP) (tabell 1).
    5. Forbered 0,1 M oppløsning avbeskyttelse blanding ved oppløsning av 3,37 g 1-hydroksybenzotriazolhydrat (HOBt)i 250 ml av en 20% volum / volum oppløsning av piperidin i DMF og virvling av blandingen inntil det faste stoff er oppløst (tabell 1).

2. Fmoc-beskyttet aminosyre Coupling

  1. Aminosyre kobling
    1. Legg aminosyre (2,5 ml) / aktivator (1 ml) / aktivator base (0,5 ml) til reaksjonsbeholder / patron polypropylen og la reaksjonen forløpe i 300 sek (25 W, 75 ° C, tabell 2). Renne løsningen.
    2. Vask harpiksen med DMF. Legg DMF til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W, RT) og tøm løsningen. Gjenta fem ganger.
  2. Fmoc-avbeskyttelse
    1. Legg 7 ml 20% piperidin i DMF med 0,1 M HOBt til reaksjonsbeholder / patron polypropylen og inkuberes i 30 sekunder (45 W, 75 ° C, tabell 2).
    2. Tapp reaksjonsblandingen.
    3. Legg 7 ml 20% piperidin i DMF med 0,1 M HOBt til reaksjonsbeholder / patron polypropylen og inkuberes i 180 sek (45 W, 75 ° C, tabell 2).
    4. Tapp reaksjonsblandingen.
    5. Vask harpiksen med DMF. Legg DMF til harpiks for 120 sek (7 ml 0 W; rt) og tapp løsningen. Gjenta fem ganger.
      Merk: Eventuelt pause prosedyren her og gjenoppta på et senere tidspunkt.
  3. Etter aminosyre koblingstrinn, vaskes harpiksen med DCM og lagre i minst flere dager ved 4 ° C (for en lengre periode butikk harpiksen ved - 20 ° C).
    1. Flytt harpiks fra reaksjonskaret til en polypropylen-patron.
    2. Vask harpiksen med DCM. Legg DCM til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tøm løsningen. Gjenta tre ganger.
    3. Tett polypropylen kassetten godt med en topplokket og stoppekran.
    4. Før du starter en ny syntese, hovne harpiksen i 3-4 timer i DMF (7 ml).
  4. Overvåking syntesen
    1. Bruk Kaiser (ninhydrin) test eller Chloranil test raskt avgjøre fremdriften avsyntese. Eventuelt kan utføre en liten-skala spaltningsreaksjon for å bestemme renheten, og massen av det syntetiserte peptid. Se § 9.
      Merk: For ytterligere feilsøking, se tabell 3.
  5. Gjenta trinn 2.1 og 2.2 som ønsket å syntetisere målrettet peptid: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Anhydride / Acid Coupling

  1. Anhydride kobling
    1. Vask harpiksen med NMP. Legg NMP til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tøm løsningen. Gjenta tre ganger.
    2. Oppløs 10 ekvivalenter av det tilsvarende anhydrid i NMP (5 ml), tilsett 1 ekvivalent 4-dimetylaminopyridin (DMAP) og 10 ekvivalenter DIEA til løsningen (tabell 1).
    3. Legg til en 10: 1: 10 blanding av anhydrid / DMAP / DIEA til harpiksen og inkuberes i 300 sek (25W, 75 ° C, tabell 2). Renne løsningen.
    4. Vask harpiksen med NMP. Legg NMP til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tøm løsningen. Gjenta tre ganger.
  2. Acid kobling
    1. Vask harpiksen med DMF. Legg DMF til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tøm løsningen. Gjenta tre ganger.
    2. Oppløs 10 ekvivalenter av den tilsvarende dikarboksylsyre i DMF (5 ml). Tilsett 1 ekvivalent DMAP og 10 ekvivalenter N, N'-diisopropylkarbodiimid (DIC) i oppløsning (tabell 1).
    3. Pre-aktivere blandingen ved å blande i 30 minutter.
    4. Tilsett blandingen til harpiksen og inkuberes i 300 sek (25 W, 75 ° C, tabell 2) og tapp oppløsningen.
    5. Vask harpiksen med DMF. Legg DMF til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tapp løsning. Gjenta trinn tre ganger.

4. N-methyltrityl (Mtt) Beskytte Gruppe Avbeskyttion

Merk: lysin sidekjede ble beskyttet med N-methyltrityl (Mtt) 81, en ​​gruppe som kan avbeskyttes selektivt under sure labile forhold 82,83. Avbeskytt Mtt beskyttelsesgruppe manuelt på en shaker uten mikrobølgeenergi.

  1. Overfør harpiks til en polypropylen patron utstyrt med cap plugg og stoppekran.
  2. Vask harpiksen med DCM. Legg DCM til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tøm løsningen. Gjenta tre ganger.
  3. Legg 15-25 ml av en blanding av 1% trifluoreddiksyre (TFA), 5% triisopropylsilan (TIS), og 94% DCM til polypropylenet patronen pr ett gram harpiks.
    Merk: TFA er en sterk syre og etsende og er ekstremt irriterende for huden, øynene, og lungevev.
    1. Hold konsentrerte oppløsninger av TFA i hetten til enhver tid.
    2. Bruk egnet personlig verneutstyr (vernebriller, frakk og hansker) og jobbe i et godt ventilert hette. Skift hansker omgåhvis de kommer i kontakt med TFA og umiddelbart rydde opp eventuelle utslipp. Hvis hud eller øyne kommer i kontakt med syre, må du skylle det berørte området umiddelbart med vann og vask for ytterligere 15 min.
  4. Plasser polypropylen patronen på en ristemaskin og rystes i 5 minutter ved RT.
  5. Renne løsningen fra polypropylen kassetten ved hjelp av vakuum.
  6. Gjenta trinn 4,3-4,5, tre ganger.
  7. Vask harpiksen med DCM. Legg DCM til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tøm løsningen. Gjenta fem ganger.

5. Syklisering av Linear Peptide

  1. Vask harpiksen med DCM. Legg DCM til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tøm løsningen. Gjenta fem ganger.
  2. I et 50 ml polypropylenrør, oppløse 5 ekvivalenter benzotriazol-1-ly-oksy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) i dibrommetan (DBM, 5 ml) og tilsett 10 ekvivalenter DIEA til løsningen (tabell 1).
    3. tabell 2). Renne løsningen.
  3. Vask harpiksen med DCM. Legg DCM til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tøm løsningen. Gjenta tre ganger.

6. Spalting og avbeskyttelse av sidekjedegrupper

  1. Vask harpiksen med DCM og dietyleter.
    1. Legg DCM til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tøm løsningen. Gjenta to ganger.
    2. Legg dietyleter til harpiks for 120 sek (7 ml, 0 W; rt) og tøm løsningen. Gjenta to ganger.
  2. Tørk harpiksen i vakuumeksikator ved romtemperatur i minst 3 timer i løpet av kaliumhydroksid (KOH, 1-10 g).
  3. Veie den tørkede harpiks og overføre den til en polypropylen-patron.
  4. Tilsett 10 ml av en på forhånd avkjølt trifluoreddiksyre (TFA) Kløyvingsblandingen (for eksempel 90% TFA, 2,5% vann, 2,5% TIS, 5% fenol) til hver og ett gram harpiks.
  5. Rist i 3 timerved RT.
  6. Samle TFA-spaltning oppløsningen ved filtrering av harpiksen i et 50 ml polypropylenrør. For filtreringen, bruk fritte som er i 12 ml polypropylen-patron.
  7. Legg kald dietyleter (35 ml) til røret.
  8. Sentrifuger i 5 minutter ved 1207 xg ved 4 ° C.
  9. Dekanter eterlaget.
  10. Gjenta trinn 6,7 til 6,9, fem ganger.

7. Tørking av Backbone Cyclic Peptide

  1. Hold det utfelte peptid i samme rør, og tørke den i en hette i 30 minutter.
  2. Oppløse peptidet i en 1: 1 blanding av vann og acetonitril (ACN).
  3. Fryse den endelige produktløsningen i flytende nitrogen.
  4. Lyofilisere det endelige produktet.

8. karakteriserer Backbone Cyclic Peptide

  1. Oppløse en liten prøve (1 mg) av produktet i vann (400 mL).
  2. Injiser det oppløste peptid (10-200 ul) til en revers fase høy ytelse væske Chromatogrhy (RP-HPLC) system for å teste renheten 34 peptidet.
  3. Kontroller massen av peptidet ved hjelp av massespektrometri matriks-assistert laserdesorpsjon ionisering (MALDI-MS) 84.
    1. Bland 1 pl (100 pM) peptidet i en 1: 1 (v / v) blanding av acetonitril: vann med 1 mL av matriksen (5 mg / ml, α-cyano-4-hydroxycinnamic syre) i et 1: 1 (v / v) blanding av acetonitril: vann med TFA (0,1%).
    2. Spot 1 pl på MS MALDI-plate.
    3. Tørk prøven og plasser den i massespektrometer.
  4. Vei peptidet og beregne prosent utbytte.
  5. Oppbevar ved -20 ° C.

9. Overvåke Synthesis

  1. Kaiser (ninhydrid) test 85
    1. Forbered reagensoppløsninger.
      1. Fremstille Oppløsning A ved å oppløse 16,5 mg kaliumcyanid (KCN) i 25 ml destillert vann. Fortynn 1 ml av den ovennevnte oppløsning med 49 ml pyridin.
      2. Forbered Løsning Bved oppløsning av 1 g av ninhydrin i 20 ml etanol.
      3. Fremstille Oppløsning C ved oppløsning av 40 g fenol i 20 ml etanol.
    2. Bruke Kaiser-test for å sjekke fullføringen av aminosyren kopling eller avbeskyttelse av den beskyttende gruppe.
      1. Overføre noen få perler fra harpiksen til et reagensrør.
      2. Legg tre dråper (~ 100 pl) av hver løsning (A, B og C) og bland.
      3. Varm testrøret på en varmeblokk ved 110 ° C i 5 min.
        Merk: Blå fargede perler (positivt resultat) indikerer ufullstendig koblingsreaksjon eller avbeskyttelse av Fmoc beskyttelsesgruppe.
  2. Kloranil test 86
    1. Forbered følgende reagenser friske for hver test.
      1. Forbered en løsning av 2% Chloranil i DMF, løsning A.
      2. Forbered en løsning av 2% acetaldehyd i DMF, løsning B.
    2. Utfør Chloranil test for å sjekke ferdigstillelse av aminosyren kobling eller tHan avbeskyttelse av den beskyttende gruppe.
      1. Bland 100 ul av oppløsning A med 100 ul av oppløsning B i et 1,5 ml rør.
      2. Slippe perlene i og rist i 5 min.
        Merk: Mørk brun fargede perler (positivt resultat) indikerer avbeskyttelse av Fmoc beskyttelsesgruppe eller en ufullstendig koblingsreaksjon.
  3. Småskala kløyvingsreaksjon
    1. Fjerne en liten mengde harpiks til en 3 ml polypropylen patron utstyrt med lokk plugg og stoppekran.
    2. Behandl med en 2 ml blanding av 95% TFA, 2,5% vann og 2,5% TIS.
    3. Rist blandingen i 30 minutter ved romtemperatur.
    4. Fjern harpiksen ved filtrering under anvendelse av frit for polypropylen patronen og fordamp løsningsmidlet med en strøm av nitrogen.
    5. Oppløs residuet i vann og analysere produktet ved hjelp av HPLC og / eller MS.

10. Leishmania donovani Promastigote levedyktighet i Kultur-analysen

    <li> Leishmania donovani (L. donovani) vekst- og behandlingsforhold
    1. Kultur L. donovani promastigotes i Dulbeccos modifikasjon av Eagles medium (DMEM) med 4,5 g / l glukose, L-glutamin, natriumpyruvat og ved 26 ° C.
    2. Unn L. donovani promastigotes med sykliske peptider (100 mm) i 24 timer ved 26 ° C.
  1. Leishmania donovani (L. donovani) levedyktighet assay
    1. Vurdere parasitt levedyktighet med 20 ul alamarBlue henhold til produsentens protokoll.
    2. Bestem alamarBlue reduksjon ved å måle fluorescens (ved 570 nm eksitasjon og 590 nm utslipp). Høyere fluorescens verdier indikerer større metabolsk aktivitet og økt parasitt levedyktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi utviklingen av et fokusert lite bibliotek av ryggraden sykliske peptider som spesifikt retter vitale PPIs av Leishmania parasitten og fungere som Antiparasittiske midler (for vurdering om peptider som er rettet mot PPIs som Antiparasittiske midler 87). Ved syntesen av nye ryggrad sykliske peptider, er pharmacophores konservert i et stillas av uttrekk størrelse. Styrken på det fokuserte biblioteket foreslås her er evnen til å variere peptid stillas størrelse samtidig som den tillater en begrenset grad av konformasjonell frihet gjennom ringslutning. Hele syntesen av ryggraden sykliske peptidene ble utført ved bruk av en automatisert syntetisator mikrobølge på fast bærer, som følge av Fmoc / tBu-protokollen. Cykliseringen ble utført ved å opprette en amidbinding mellom linkeren, anhydrid / syre, og sidekjeden amin med lysin. Den endelige spaltning og sidekjede-avbeskyttelse ble utført manuelt uten mikrobølgeenergi (for synteseskjemaet, og fINAL produkter strukturen se figur 3). Produktet ble analysert ved hjelp av preparativ HPLC for å gi 25 mg hvitt pulver som er lagret ved -20 ° C. En prøve av produktet ble kontrollert ved MS (figur 4) og dens grad av renhet ble bestemt ved hjelp av analytisk HPLC (figur 5). En prøve av hver cykliske peptid ble sendt for biologisk screening. En av de fire sykliske peptidene (P1) var aktiv mot Leishmania donovani (L. donovani), en parasitt som forårsaker visceral leishmaniasis, den mest alvorlige leishmaniasis hos mennesker. Peptide PL1 redusert parasitt levedyktighet med 75% sammenlignet med kontrollbehandling (Tabell 4).

Figur 3
Figur 3. Syntese ordningen og struktur av ryggraden syklisk peptid syntetisert i denne studien Reagenser og betingelser:. (I) aminosyre kobling: 300 sek, 25 W, 75 ° C,ved anvendelse av 1,1: 1: 2,2 aminosyre / aktivator / aktivator base. (ii) fjerning av Fmoc: 30 sek og 180 sek både ved 45 W, 75 ° C, ved bruk av 20% piperidin i DMF + 0,1 M HOBt. (iii) Anhydride kobling: 300 sek, 25 W, 75 ° C, ved bruk av 10: 10: 1 anhydrid / DIEA / DMAP i NMP. (iv) avblokkering Mtt: 3 * (300 sek, 0 W, RT) ved anvendelse av 1: 5: 94 TFA / TIS / DCM. (v) Ringslutning: 300 sek, 25 W, 75 ° C, ved bruk av 5:10 PyBOP / DIEA i dBm. (vi) Spalting og avbeskyttelse: 3 H, 0-W, rt, ved bruk av 90: 2,5: 2,5: 5 TFA / TIS / H 2 O / fenol. Peptider ble konjugert til en TAT 47-57 (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) bærerpeptid gjennom en amidbinding som en del av fastfase-syntese. Klikk her se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. MALDI-TOF massespektroskopi spor avrepresentant ryggrad syklisk peptid. Den observerte masse, 2853.456 er i nær avtale om den beregnede masse, 2854,271. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Analytisk revers fase HPLC spor av representative ryggrad syklisk peptid. De analytiske HPLC-spor av det urene (A) og renset (B) ryggrad syklisk peptid er vist. De løsningsmiddel-systemer som ble brukt var A (H2O med 0,1% TFA) og B (CH3CN med 0,1% TFA). En lineær gradient av 5-50% B ved 1 ml / min i 15 min ved 40 ° C med en C18, 5 um, 150 mm-kolonne ble anvendt, og påvisning var ved 215 nm. Trykk herfor å se en større versjon av dette tallet.

Løsning Reagens MW (g / mol) d (g / ml) Volum (ml) Konsentrasjon (M) Totalbeløp
- Amino acid solution - Alanin aminosyre 311,34 0.2 6,23 g
0,2 M av aminosyren i DMF DMF 100 100 ml
Et eksempel for aminosyren alanin, men den samme beregningen skal utføres for hver aminosyre, med det passende MW. For å fremstille en 100 ml aminosyreløsning oppløse 6,23 g av aminosyren alanin i 100 ml DMF. Oppbevar ved 4 ° C.
- Avbeskyttelse løsning- HOBt 135,1 0.1 3,37 g
20% volum / volum oppløsning av piperidin i DMF med 0,1 M HOBt Piperidin 50 50 ml
DMF 200 200 ml
Avbeskyttelse brukes for fjerning av Fmoc N α - beskyttelsesgruppe. For å forberede en 250 ml deproteksjon løsning oppløse 3,37 g HOBt i 200 ml DMF og tilsett 50 ml piperidine. Oppbevar ved 4 ° C.
- Activator løsning - HBTU 379,24 0,45 18.96 g
0,45 M HBTU i DMF DMF 100 100 ml
Activator erbrukes sammen med aktivatoren basen for å aktivere aminosyren før koblingsreaksjonen. For å fremstille en 100 ml aktivatorløsning oppløse 18,96 g HBTU i 100 ml DMF. Oppbevar ved 4 ° C.
- Activator baseløsning - DIEA 129,24 0,742 2 34.80 ml
2 M DIEA i NMP NMP 65.20 ml
Aktivator base anvendes med aktivator for å aktivere aminosyren før koblingsreaksjonen. For å forberede en 100 ml aktivator baseløsning mix 34,8 ml DIEA og 65,2 ml NMP. Oppbevar ved 4 ° C.
Løsning Reagens MW (g / mol) d (g / ml) Volum (ml) Eq Totalbeløp
Anhydrid løsning - 10: 1: 10 anhydrid / DMAP / DIEA i NMP Glutaric / Ravsyreanhydrid 114,1 / 100,07 10 0,11 / 0,10 g
DMAP 122,2 1 0,01 g
DIEA 129,24 0,742 10 0,09 ml
NMP 5 5 ml
Oppløs 0,11 / 0,10 g glutarsyre / ravsyreanhydrid i 5 ml NMP, tilsett 0,01 g DMAP og 0,09 ml DIEA til løsningen. Forbered en frisk løsning.
Syreoppløsningen - 10: 1: 10-syre / DMAP / DIC i DMF Adipic / pimelinsyre 146,14 / 160,17 10 0,15 / 0,16 g
DMAP </ td> 122,2 1 0,01 g
DIC 126,2 0,806 10 0,16 ml
DMF 5 5 ml
Oppløs 0,15 / 0,16 g Adipinsyre / pimelinsyre i 5 ml DMF, tilsett 0,01 g DMAP og 0,16 ml av DIC til løsningen. Forbered en frisk løsning.
Syklisering løsning - 05:10 PyBOP / DIEA i DBM PyBOP 520,3 5 0,26 g
DIEA 129,24 0,742 10 0,09 ml
DBM 5 ml 5 ml
Oppløs 0,26 g i 5 ml PyBOP DBM og tilsett 0,09 ml DIEA til løsningen. Forberede enfrisk oppløsning.

Tabell 1. Reagenser og løsninger for ryggraden cyklisk peptidsyntese. Liste over de løsninger og reagenser for syntese er gitt.

Mikrobølgeovn syklus Power (Watts) Temp (° C) Tid (sek)
1 Kobling aminosyrer 25 75 300
2 Avbeskyttelse av Fmoc beskyttelsesgruppe (a) Initial deproteksjon 45 75 30
(b) Komplett deproteksjon 45 75 180


Tabell 2. Mikrobølge sykluser for koblingen og avbeskyttelsen. Mikro sykluser foraminosyre kobling og Fmoc-avbeskyttelse. (1) Kobling av aminosyrer. (2) Avbeskyttelse av Fmoc maskeringsgruppen foregår i to trinn: (a) første og (b) fullstendig avbeskyttelse.

Problem Mulig årsak Løsning
Kaiser eller kloranil testene er positive etter aminosyre kobling Aminosyren koblingen er ufullstendig Gjenta koblingstrinnet
Peptider er ikke effektivt separert fra supernatanten Overskytende beløp av TFA Fordamp prøven ved bruk av en strøm av nitrogen
Tilstedeværelse av delesjonssekvenser i produkt Fmoc fjerning er ufullstendig Overvåke avbeskyttelse ved Kaiser eller kloranil tester og / eller liten skala spalting, i tilfelle Fmoc fjerning er ufullstendig gjenta trinnet
Aminosyre coupling er ufullstendig Overvåk koplingen ved Kaiser eller kloranil tester og / eller liten skala spalting, i tilfelle aminosyren koblingen er ufullstendig repetere trinnet og / eller bruke lengre reaksjonstid

Tabell 3. Feilsøking råd Liste av løsninger for de mest vanlige syntetiske utfordringer er gitt.

Peptide Sekvens n MS. Cal. MS Obs. HPLC Avkastning Parasitt levedyktighet
PL1 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 2 2854.321 2853.456 98% 86% 25%
PL2 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 3 2868.348 98% 87% 100%
PL3 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 4 2882.375 2881.823 96% 89% 97%
PL4 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 5 2896.402 2895.603 97% 85% 98%

Tabell 4. Karakterisering og bioaktivitet av peptider i denne undersøkelsen. N refererer til antall methylenes i alkyl-avstandsstykket (se Figur 3 for strukturen). MS ble utført ved hjelp av MALDI teknikk og renhet ble bestemt ved analytisk HPLC. Peptider ble tilsatt til Leishmania donovani promastigotes og levedyktigheten av parasitter ble målt og uttrykt som prosent overlevelse i forhold til kontrollkulturene inkubert i fravær av peptid. Bare PL1 hadde høy Leishmanicidal aktivitet. Observatørenble blindet for forsøksbetingelsene. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Syntesen av et fokusert bibliotek av ryggraden sykliske peptider avledet fra mangel protein av Leishmania parasitten ved hjelp av en helautomatisk mikrobølgeovn syntetisator er beskrevet. En fokusert bibliotek av sykliske peptider ble utviklet med konserverte pharmacophores og ulike forbindelsesledd. Tilsetning av forskjellige linkere som glutarsyreanhydrid, ravsyreanhydrid, adipinsyre, pimelinsyre, lysin, ornitin, og andre byggeklosser kan anvendes for å øke variasjonen av den konformasjonelle plass av de sykliske peptider. Syntesen av et fokusert sykliske peptider bibliotek tillater forskere å screene for optimal conformational plass. Siden konformasjon av sykliske peptider som varierer avhengig av parametere så som størrelse og posisjon ring, kan diverse analoger med forskjellige konformasjoner skal genereres, noe som kan være nyttig i biologisk struktur-aktivitetsforhold 88 studier.

En hovedutfordring i SPPS er diagnostisere synthetic fremgang og problemløsning siden ingen mellom er isolert. Derfor kan flere kolorimetriske tester kan brukes for å overvåke reaksjonen, slik som de som identifiserer frie aminer ved Kaiser og kloranil tester. Dersom Kaiser eller kloranil testene er ikke en indikasjon (f.eks, prolin og hydroksy-prolin reagerer ikke med ninhydrin på samme måte som de andre aminosyrene fordi deres a-aminogruppe er en del av et fem-leddet ring), en liten skala spaltningsreaksjon og kan anvendes massespektrometri-analyse for å overvåke syntese fremdrift.

Spalting tid og Kløyvingsblandingen kan endres basert på de kjemiske egenskaper og antall av de beskyttende grupper som benyttes. Det anbefales at en innledende prøveperiode splitting under anvendelse av en liten mengde av harpiksen (1-10 mg) bli utført for å verifisere riktig forhold. Kongen et al. Har testet forskjellige cleavage cocktails for ulike peptider og deres detaljerte retningslinjer kan brukes til å optimalisere reaction tilstander 89. For ryggrad sykliske peptider, er inkubasjon i minst 3 timer anbefales som en standard for fullt cleavage. Imidlertid, peptider inneholdende et høyt antall beskyttende grupper eller vanskelige beskyttende grupper (for eksempel t-butyl-ester eller pentametyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl) bør inkuberes i en lengre tid for å sikre fullstendig avbeskyttelse. Heri, har vi ikke systematisk studert optimal cleavage tid eller cocktail. Likevel har vi funnet at en kort spaltning tid (mindre enn 2 timer) resulterte i ufullstendig spalting av enkelte beskyttelsesgrupper.

Den mikrobølge standard peptidsyntese-protokollen er en generelt anvendbar metode for syntesen av en rekke forskjellige peptider. I de fleste tilfeller, ved bruk av en automatisk mikrobølge synthesizer reduserer syntesen varighet og øker utbyttet og renheten av produktene. Videre, men senker sidereaksjoner som for eksempel racemisering og aspartimide formasjonen. Selv om vi ikke har gjortet side-ved-side-sammenligning av mikrobølge og konvensjonell syntese i denne studien, basert på vår og andre laboratorier erfaring, ble det vist at ved bruk av mikrobølgeassistert syntese er overlegen i forhold til den konvensjonelle protokollen 61,70. Nesten alle aktivatorer og harpikser som kan brukes effektivt i mikrobølgeovn SPPS og den generelle fremgangsmåten kan også brukes til syntese av en rekke modifiserte peptider, som for eksempel, glykopeptider, fosforpeptidene, azapeptides, peptoids og sykliske peptider 90.

Ringslutning er en praktisk måte å forbedre styrken og stabiliteten av lineære forløpere. Sykliske peptider kan oppnå en ønskelig begrenset konformasjon som kan bidra til økt bindende affinitet og selektivitet. Videre kan lineære peptider modifiseres til å inneholde flere sykliske looper, slik at de kan muligens målrette flere endogen proteinbindings grensesnitt 91. Det er imidlertid viktig å merke seg at cykliseringen ikke nødvenarily føre til forbedringer i alle eller noen ganger noen av disse egenskapene. Enkelte sykliske peptider kan resultere i conformations som ikke er anerkjent av målrettede reseptorer (for eksempel 92,93) .Derfor, er nødvendig for å skjerm for bioaktivitet en fokusert bibliotek av sykliske peptider. Som konklusjon, syntetiske sykliske peptider utviser ønskelige farmakologiske egenskaper, er små nok til å krysse cellemembranen, og er store nok til å ha høy selektivitet. Høy potens, spesifisitet og sikker profil bidra til sykliske peptider 'løftet som legemiddelkandidater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang, og Daria Mochly-Rosen for nyttige diskusjoner. Arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) til NQ De organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic.
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials - micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
Nitrogen cylinder
Desiccator
Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).
Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450 (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
  3. Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 797-807 (2009).
  4. Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochemistry. 37 (16), 5616-5622 (1998).
  5. Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282 (6), 4113-4123 (2007).
  6. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15 (1-2), 40-56 (2010).
  7. Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, American Chemical Society. 17-24 (2005).
  8. Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305 (5689), 1411-1413 (2004).
  9. Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10 (2), 256-266 (2008).
  10. Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (6), 872-877 (2002).
  11. Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (7), 512-523 (1982).
  12. Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24 (12), 1847-1852 (2003).
  13. Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochemistry. 30 (26), 6574-6583 (1991).
  14. Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116 (11), 1783-1799 (2015).
  15. Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O'Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61 (6), 287-297 (2003).
  16. Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121 (51), 12204-12205 (1999).
  17. Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274 (25), 17573-17579 (1999).
  18. Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6 (1), 99-104 (2004).
  19. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  20. Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using 'safety catch' methodology. J Vis Exp. (63), e4112 (2012).
  21. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2 (12), 3247-3256 (2007).
  22. Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91 (2), 157-168 (2009).
  23. Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based 'building block' approach. Nat. Protoc. 2 (12), 3210-3218 (2007).
  24. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  25. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126 (Pt 3), 789-802 (2013).
  26. Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (2), 203-216 (2008).
  27. Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9 (2), 169-185 (2009).
  28. Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446 (7139), 1046-1051 (2007).
  29. Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291 (5508), 1523-1527 (2001).
  30. Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3 (4), 646-654 (2008).
  31. Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1 (3), 175-183 (1995).
  32. Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90 (4), 526-536 (2008).
  33. O'Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10 (10), 857-876 (2007).
  34. Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84 (12), 1988-1991 (2007).
  35. Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79 (1), 85-86 (2002).
  36. Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis - A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 75-82 (2007).
  37. Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2 (7), 587-593 (2003).
  38. Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29 (2), 4-7 (2011).
  39. Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37 (22), 3404-3409 (1972).
  40. Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (3), 279-282 (1986).
  41. Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (41), 4945-4948 (1986).
  42. Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5 (1), 51-63 (2006).
  43. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (46), 6250-6284 (2004).
  44. de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34 (2), 164-178 (2005).
  45. Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57 (18), 4781-4784 (1992).
  46. Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20 (1), 1-47 (1991).
  47. Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27 (3), 213-224 (1998).
  48. Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (6), 762-770 (2008).
  49. Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5 (1), 39-50 (2010).
  50. Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (9), 2222-2227 (2007).
  51. Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (3), 624-631 (2007).
  52. Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13 (3), 143-148 (2007).
  53. Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
  54. Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11 (20), 4488-4491 (2009).
  55. Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 203-208 (2007).
  56. Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7 (5), 877-880 (2005).
  57. Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8 (20), 4465-4468 (2006).
  58. Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71 (26), 9609-9621 (2006).
  59. Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12 (4), 349-357 (2006).
  60. Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14 (4), 387-392 (2008).
  61. Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85 (3), 300-305 (2014).
  62. Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7 (25), 5649-5652 (2005).
  63. Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4 (23), 4057-4059 (2002).
  64. Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7 (8), 1521-1524 (2005).
  65. Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51 (9), 2701-2707 (2008).
  66. Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75 (1), 40-50 (2010).
  67. Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7917-7927 (2009).
  68. Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
  69. Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10 (12), 2329-2332 (2008).
  70. Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14 (6), 683-689 (2008).
  71. Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2 (3), 281-283 (2004).
  72. Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13271-13280 (2005).
  73. Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20 (1), 25-33 (2009).
  74. Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28 (1), 14-16 (2010).
  75. Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7 (2), e87-e93 (2010).
  76. Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268 (5210), 563-566 (1995).
  77. Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198 (11), 1689-1698 (2003).
  78. Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6 (6), e20710 (2011).
  79. Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259 (3), 909-916 (1999).
  80. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13 (10), 443-448 (2007).
  81. Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45 (5), 488-496 (1995).
  82. Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60 (5), 300-303 (2002).
  83. Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6 (6), 264-270 (2000).
  84. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373 (2011).
  85. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  86. Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33 (10), 763-766 (1979).
  87. Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32 (6), 62-66 (2014).
  88. Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39 (16), 3174-3178 (1996).
  89. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36 (3), 255-266 (1990).
  90. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41 (5), 1826-1844 (2012).
  91. Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28 (11), 2698-2709 (2008).
  92. Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58 (3), 246-256 (2001).
  93. Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52 (2), 83-90 (2006).

Tags

Chemistry utgave 107 protein-protein interaksjoner peptider peptidetterligninger cyklisk peptid ryggrad cyklisering fastfase-peptidsyntese mikrobølgebestråling mikrobølgeassistert syntese
Utvikling av en Backbone Cyclic Peptide Library som Potential antiparasittisk Therapeutics Bruke Mikrobølgeovn Bestråling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qvit, N., Kornfeld, O. S.… More

Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter