Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Utveckling av en Backbone cyklisk peptidbibliotek som Potential Antiparasitärt Therapeutics Använda mikrovågsstrålning

Published: January 26, 2016 doi: 10.3791/53589
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

Abstract

Protein-proteininteraktioner (PPI) är intimt involverade i nästan alla biologiska processer och är kopplade till många sjukdomar hos människor. Därför finns det en stor ansträngning för att rikta PPI i grundforskning och inom läkemedelsindustrin. Protein-protein gränssnitt är oftast stora, platta, och ofta saknar fickor, vilket komplicerar upptäckten av små molekyler som riktar sådana webbplatser. Alternativa inriktning på metoder för användning av antikroppar har begränsningar på grund av dålig oral biotillgänglighet, låg cell-permeabilitet, och produktion ineffektivitet.

Med hjälp av peptider att rikta PPI gränssnitt har flera fördelar. Peptider har högre konformationsflexibilitet, ökad selektivitet, och är i allmänhet billiga. Men peptider har sina egna begränsningar, inklusive dålig stabilitet och ineffektivitet passerar cellmembran. För att övervinna sådana begränsningar, kan utföras peptid cyklisering. Cyklisering har visat sig förbättra peptid selektivitet, Metabolisk stabilitet och biologisk tillgänglighet. Emellertid förutsäger den bioaktiva konformationen av en cyklisk peptid är inte trivialt. För att övervinna denna utmaning, till en attraktiv metod det screena ett fokuserat bibliotek för att skärmen där alla stamnät cykliska peptider har samma primära sekvensen, men skiljer sig i parametrar som påverkar deras konformation, såsom ring storlek och position.

Vi beskriver ett detaljerat protokoll för att syntetisera ett bibliotek av ryggraden cykliska peptider riktade mot särskilda parasit protonpumpshämmare. Med hjälp av en rationell design strategi, utvecklade vi peptider härledda från ställningen protein L eishmania receptor för aktiverat C-kinas (LACK). Vi antog att sekvenser i LACK som är konserverade i parasiter, men inte i däggdjursvärden homologen, kan representera interaktionsställen för proteiner som är kritiska för parasiternas viabilitet. De cykliska peptider syntetiserades med användning av mikrovågsstrålning för att reducera reaktionstiderna och ökaeffektivitet. Utveckla ett bibliotek av ryggraden cykliska peptider med olika ringstorlekar underlättar en systematisk skärm för den mest biologiskt aktiva konformation. Denna metod ger en allmän, snabb och enkelt sätt att syntetisera cykliska peptider.

Introduction

Protein-proteininteraktioner (PPI) spelar en central roll i de flesta biologiska processer, från intracellulär signalöverföring till celldöd 1. Därför, med inriktning PPI är av grundläggande betydelse för grundforskning och terapeutiska tillämpningar. PPI kan regleras genom specifika och stabila antikroppar, men antikroppar är dyra och svåra att tillverka och ha dålig biotillgänglighet. Alternativt kan producentprisindex riktas av små molekyler. Små molekyler är lättare att syntetisera och billigt jämfört med antikroppar; men de är relativt mindre flexibel och passar bättre för små håligheter än till stora protein-protein gränssnitt 2,3. Olika studier har visat att peptider, som är enklare och billigare än antikroppar och mer flexibelt än små molekyler, kan binda protein gränssnitt och reglera PPI 4,5. Den globala terapeutisk peptid marknaden värderades cirka femton miljarder dollar under 2013 och växer 10,5% annually 6. Dessutom finns det mer än 50 marknadsförda peptider, cirka 270 peptider i olika faser av klinisk prövning, och omkring 400 peptider i avancerade prekliniska faser 7. Trots att många peptider används som läkemedel, peptider utgör fortfarande flera utmaningar som begränsar deras utbredd tillämpning inklusive dålig biotillgänglighet och stabilitet, ineffektivitet i korsningen cellmembran, och konformationsflexibilitet 8,9. Ett alternativ för att övervinna dessa nackdelar är att tillämpa olika modifieringar såsom lokala (D-aminosyra och N-alkylering) och global (cyklisering) begränsningar 8,10-12. Dessa ändringar förekommer också naturligt. Till exempel, cyklosporin A ett immunosuppressivt cyklisk naturlig peptid, innehåller en enda D-aminosyra och genomgår N-alkyleringsförfaranden modifieringar 13,14.

Modifiering av naturliga aminosyror för att inducera lokala begränsningar, såsom D- och N-alkylering, ofta påverkar peptiden9; s biologiska aktivitet. Emellertid cyklisering, där sekvensen av intresse kan vara densamma, är det mer sannolikt att bevara biologisk aktivitet. Cyklisering är ett mycket attraktivt sätt att begränsa peptidkonforma utrymme genom att minska balansen mellan olika konformationer. Det ökar vanligen biologisk aktivitet och selektivitet genom att begränsa peptiden till den aktiva konformationen som medierar endast en funktion. Cyklisering förbättrar även peptidstabilitet genom att hålla peptiden i en konformation som är mindre erkänt av nedbrytande enzymer. I själva verket var cykliska peptider visade sig ha förbättrad metabolisk stabilitet, biotillgänglighet och selektivitet jämfört med deras linjära motsvarigheter 15-17.

Däremot kan cyklisering vara ett dubbeleggat svärd eftersom det i vissa fall begränsningen kan förhindra peptiderna från att uppnå en bioaktiv konformation. För att övervinna detta hinder, en fokuserad bibliotek i vilket alla peptider har samma primära sequence och följaktligen konstant farmakoforer kan syntetiseras. Peptider i biblioteket skiljer sig i parametrar som påverkar deras struktur, såsom ring storlek och position, för att därefter screena för de mest bioaktiva konforma 9,18.

Peptider kan syntetiseras både i lösning och en fast fas peptidsyntes (SPPS) tillvägagångssätt, som nu är vanligare peptidsyntes strategi och kommer att diskuteras vidare. SPPS är en process genom vilken kemiska omvandlingar utförs på en fast bärare via en linker till framställning av en mängd olika syntetiska föreningar 19. SPPS möjliggör montering peptider genom rad koppling av aminosyror stegvis från C-terminalen, som är bunden till en fast bärare, till N-terminalen. De N-a-aminosyrasidokedjor måste maskeras med skyddsgrupper som är stabila under de använda reaktionsbetingelserna under peptid töjning för att säkerställa tillsatsen av en aminosyra per step. I det slutliga steget, är peptiden frigörs från hartset och sidokedjan skyddande grupper ges samtidigt avlägsnas. Medan peptiden som syntetiseras, kan alla lösliga reagens avlägsnas från peptiden-fasta stödmatrisen genom filtrering och tvättades bort vid slutet av varje kopplingssteg. Med ett sådant system, kan ett stort överskott av reagens vid hög koncentration driva kopplingsreaktioner till fullständighet och alla syntessteg kan utföras i samma kärl utan någon överföring av material 20.

Även SPPS har vissa begränsningar såsom produktion av ofullständiga reaktioner, bireaktioner, orena reagens, liksom svårigheter övervakar reaktionen 21, har fördelarna med SPPS gjorde det "gold standard" för peptidsyntes. Dessa fördelar innefattar möjligheten att införliva icke-naturliga aminosyror, automation, enkel rening, minimerade fysiska förluster, och användningen av överskott av reagens, vilket resulterar ihög avkastning. SPPS har visat sig vara mycket användbar i syntesen av svåra sekvenser 21,22, fluorescerande ändringar 23 och peptidbibliotek 24,25. SPPS är också mycket användbar för andra poly-kedjeanordningama såsom oligonukleotider 26,27, oligosackarider 28,29 och peptidnukleinsyror 30,31. Intressant i vissa fall var SPPS visat sig vara fördelaktigt för att syntetisera små molekyler som traditionellt gjorda i lösning 32,33. SPPS används både i liten skala för forskning och undervisning 34,35 samt storskalig inom industrin 36-38.

Två syntesstrategier som huvudsakligen används i SPPS metodologi för syntes av peptider är butyloxikarbonyl (Boc) och 9-fluorenylmetoxikarbonyl (Fmoc). Den ursprungliga strategin infördes för SPPS var Boc, som kräver starka sura betingelser för att avlägsna sidokedjeskyddande grupper och klyva peptiden från rESIN. Fmoc-baserad peptidsyntes är emellertid utnyttjar måttliga normalförhållanden och är en mildare alternativ till den syralabila Boc-protokoll 39. Fmoc-strategin utnyttjar ortogonal t-butyl (tBu) sidokedjeskydd som avlägsnas i det sista steget av syntesen medan klyvning av peptiden från hartset under sura betingelser.

Den allmänna principen för peptidsyntes på fast bärare presenteras i figur 1. Den initiala aminosyran, maskeras av en temporär skyddsgrupp på N-α-terminalen, laddas på hartset från C-terminalen. En semipermanent skyddsgrupp för maskering av sidokedjan används också vid behov (figur 1, steg 1). Syntesen av målpeptiden är sammansatt av C-terminalen till N-terminalen av repetitiva cykler av avskyddande av den N-α-temporär skyddsgrupp (figur 1, steg 2) och koppling av nästa skyddade aminosyra (figur 1 ong>, steg 3). Efter den sista aminosyran är laddad (figur 1, steg 4), klyvs peptiden från hartsbäraren och de halvpermanenta skyddsgrupper avlägsnas (figur 1, steg 5).

Figur 1
Figur 1. Allmänt system av fast fas-peptidsyntes. Den N-α-skyddad aminosyra är förankrad med hjälp av karboxylgruppen via en linker till hartset (steg 1). Den önskade peptiden ihopsätts på ett linjärt sätt från C-terminalen till N-terminalen av repetitiva cykler av avskyddning av den temporära skyddsgruppen (TPG) från N-α (steg 2) och aminosyrakoppling (steg 3). Efter fullföljandet av syntesen (steg 4), är de halvpermanenta skyddsgrupper (SPG) avskyddas under peptidklyvning (steg 5).få = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter monteringen av hela peptidkedjan, kan cyklisering uppnås genom flera alternativ: (A) head-to-tail cyklisering - detta är ett bekvämt sätt, men begränsad, eftersom det ger bara ett alternativ för cyklisering (Figur 2A), (B) cyklisering med användning av de aminosyror från sekvensen av intresse som innehåller bioaktiva funktionella grupper - kan emellertid användningen av dessa aminosyror påverkar den biologiska aktiviteten (figur 2B), och (C) cyklisering genom tillsats aminosyror (eller andra byggstenar) utan att störa det bioaktiva sekvensen. Presentation dessa molekyler är utbredd eftersom den tillåter framställning av fokuserade bibliotek utan att modifiera sekvensen av intresse (figur 2C).

Figur 2
Figure 2. Alternativa peptid cyklisering strategier (A) huvud till svans cyklisering, genom en peptidbindning mellan C-terminalen och N-terminalen.; (B) cyklisering mellan funktionella grupper, såsom en disulfidbindning mellan cysteinrester (1), eller en amidbindning mellan sidokedjorna av lysin till asparaginsyra / glutaminsyra (2), eller sidokedjan till N- eller C-terminalen (3 -4); (C) cyklisering genom att lägga till extra aminosyror eller aminosyraderivat eller små molekyler, till exempel innan (R0) och efter (R7) den bioaktiva sekvensen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mikrovågsassisterad syntes använder mikrovågsstrålning att värma reaktioner, vilket accelererande organisk kemisk omvandling 40,41. Mikrovågsugn kemi är baserad på förmågan hos reagenset / lösningsmedel för att absorbera denmikrovågsenergi och omvandla den till värme 42. Innan tekniken blev utbredd, hade stora nackdelar som måste övervinnas, inklusive styrbarhet och reproducerbarhet syntesprotokoll och brist på tillgängliga system för lämpliga temperatur- och tryckkontroller 43,44. Den första rapporten från mikrovågsassisterad peptidsyntes utfördes med användning av ett kök mikrovågsugn att syntetisera flera korta peptider (7-10 aminosyror) med betydande förbättring av kopplingseffektiviteten och renhet 45. Dessutom har mikrovågsenergi visat sig minska kedja aggregering, minska sidoreaktioner, begränsa racemisering och förbättra kopplingshastigheter, som alla är avgörande för svåra och långa sekvenser 46-53.

För närvarande användningen av mikrovågsbestrålning för syntes av peptider eller besläktade föreningar på en fast bärare är omfattande, inklusive (a) Syntes i vatten i stället för organiska lösningsmedel 54; (B) Syntes av peptider medgemensamma posttranslationella modifieringar, såsom glykopeptider 55-58 eller fosfopeptider 59-61, vars syntes är typiskt svårt på grund av den låga kopplingseffektiviteten av steriskt hindrade aminosyraderivat; (C) Syntes av peptider med modifikation i huvudkedjan, såsom azapeptides, som kan bildas genom ersättning av C (α) av en aminosyrarest med en kväveatom 62 eller peptoider, vars sidokedja är förbunden med amidkvävet snarare än Ca atom 63,64; (D) Syntes av cykliska peptider 65-71; och (E) syntes av kombinatoriska bibliotek 51,72. I många fall, rapporterade författarna högre effektivitet och minskad syntes gång med användning av mikrovågsbestrålning i jämförelse med det konventionella protokollet.

Med hjälp av en rationell design 73-75, har vi utvecklat anti-parasit peptider som härrör från ställningen L eishmania receptor for aktiverade C-kinas (LACK). LACK spelar en viktig roll i den tidiga fasen av Leishmania-infektion 76. Parasiter som uttrycker lägre nivåer av LACK inte parasitera även immun äventyras möss 77 som LACK är involverat i viktiga parasitsignalprocesser och proteinsyntes 78. Därför är LACK en viktig byggnadsställning protein 79 och en värdefull läkemedelsmål. Fokusera på sekvenser i LACK som är konserverade i parasiter, men inte i värddäggdjurshomologen RACK, identifierade vi en 8 aminosyrapeptid (RNGQCQRK) som minskade Leishmania sp. Viabilitet i odling.

Här beskriver vi ett protokoll för syntes av ryggraden cykliska peptider härledda från LACK proteinsekvensen som beskrivits ovan. Peptiderna syntetiserades på en fast bärare med användning av mikrovågsuppvärmning av SPPS metodologi med Fmoc / tBu-protokollet. Peptider konjugerades till en TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) bärarpeptid genom en amidbindning somdel av SPPS. TAT-baserad transport av olika laster till celler har använts i över 15 år och leverans av lasten i subcellulära organeller har bekräftats 80. Fyra olika linkers, bärnstenssyra och glutarsyra-anhydrid samt adipinsyra och pimelinsyra, användes för att utföra cykliseringen att alstra karboxylsyragrupper linkers enligt två till fem kolatomer. Cyklisering utfördes med användning av mikrovågsenergi, och de slutliga klyvnings och i sidokedjan avlägsnande stegen gjordes manuellt utan mikrovågsenergi. Användningen av en automatiserad mikro-syntetiserare förbättras produktrenheten, ökade produktutbytet, och minskad varaktighet av syntesen. Denna allmänna protokoll kan tillämpas på andra studier som utnyttjar peptider att förstå viktig molekylär mekanism in vitro och in vivo och ytterligare utveckla potentiella läkemedel för mänskliga sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utrustning och reagenser Förberedelse

  1. Framställning utrustning
    1. Utför alla steg inuti ett dragskåp med rätt personlig skyddsutrustning.
    2. Kemiskt syntetisera peptider på fast underlag med användning av en mikrovågsugn Peptide Synthesizer med en tilläggsmodul över Discover utrustad med en fiberoptisk temperaturgivare för styrning av mikrovågseffekten leverans i en Teflon reaktionskärl (30 ml, med en glasfritta) eller i en engångs polypropen patron (12 ml, med en grov fritta).
    3. För korrekt blandning, anslut kvävetillförseln till reaktionskärlet, eller alternativt försegla båda ändarna av polypropylen patronen och placera på en rotationsskak.
    4. För att dränera reaktionsblandningar eller tvättar, ansluta till husvakuum via en avfallsfälla.
    5. Placera den fiberoptiska sonden i reaktionskärlet.
  2. Förberedelse reagens
    1. Förbered hartset genom vägning Rink Amide AM harts 100-200 mesh (0,204 mg), Tillsätt 5 ml 1: 1 blandning av N, N-dimetylformamid (DMF) / diklormetan (DCM) för reaktionskärlet / polypropen patronen för att tvätta hartset ner, skaka i 2-4 h för att svälla ordentligt, och avlopp.
    2. Bered 0,2 M 9-fluorenylmetoxikarbonyl (Fmoc) -amino syralösningar genom upplösning av den motsvarande Fmoc-aminosyra i DMF och vortexblanda blandningen tills aminosyrorna löses (tabell 1).
    3. Förbered 0,45 M aktivatorlösning blandning genom upplösning 18,96 g O - (bensotriazol-1-yl) - N, N, N ', N' tetrametyluronium hexafluorofosfat (HBTU) i 100 ml DMF och vortexa blandningen tills fastämnet är upplöst (tabell 1).
    4. Bered 2 M aktivator baslösning blandning genom att kombinera 34,8 ml N, N-diisopropyletylamin (DIEA) med 65,2 ml 1-metyl-2-pyrrolidinon (NMP) (tabell 1).
    5. Bered 0,1 M avskyddande lösning blandning genom upplösning 3,37 g 1-hydroxibensotriazolhydrat (HOBt)i 250 ml av en 20% volym / volym lösning av piperidin i DMF och vortexa blandningen tills fastämnet är upplöst (tabell 1).

2. Fmoc-skyddade aminosyra Koppling

  1. Aminosyrakoppling
    1. Lägg aminosyra (2,5 ml) / aktivator (1 ml) / aktivator bas (0,5 ml) till reaktionskärlet / polypropen patronen och låt reaktionen fortgå under 300 sek (25 W, 75 ° C, Tabell 2). Töm lösningen.
    2. Tvätta hartset med DMF. Lägg DMF till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, RT) och dränera lösningen. Upprepa fem gånger.
  2. Fmoc-avskyddning
    1. Lägg 7 ml 20% piperidin i DMF med 0,1 M HOBt till reaktionskärl / polypropylen patron och inkubera i 30 sek (45 W, 75 ° C, tabell 2).
    2. Töm reaktionsblandningen.
    3. Lägg 7 ml 20% piperidin i DMF med 0,1 M HOBt till reaktionskärl / polypropylen patron och inkubera i 180 sek (45 W, 75 ° C, Tabell 2).
    4. Töm reaktionsblandningen.
    5. Tvätta hartset med DMF. Lägg DMF till hartset för 120 sek (7 ml 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa fem gånger.
      Obs: Du kan, pausa proceduren här och fortsätta vid ett senare tillfälle.
  3. Efter aminosyrakopplingssteget, tvätta hartset med DCM och lagra i minst flera dagar vid 4 ° C (för en längre period lagra hartset vid - 20 ° C).
    1. Flytta hartset från reaktionskärlet till en polypropen patron.
    2. Tvätta hartset med DCM. Lägg DCM till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa tre gånger.
    3. Täta polypropylen kassetten ordentligt med en övre locket och kranen.
    4. Innan du startar en ny syntes, svälla hartset under 3-4 timmar i DMF (7 ml).
  4. Övervakning syntesen
    1. Använd Kaiser (ninhydrin) test eller kloranil test för att snabbt avgöra utvecklingen avsyntes. Eventuellt utföra en småskalig klyvningsreaktion för bestämning av renhet och massan av den syntetiserade peptiden. Se avsnitt 9.
      Obs: För ytterligare felsökning, se tabell 3.
  5. Upprepa steg 2.1 och 2.2 som önskat att syntetisera riktade peptid: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Anhydride / Acid Koppling

  1. Anhydrid koppling
    1. Tvätta hartset med NMP. Lägg NMP till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa tre gånger.
    2. Lös 10 ekvivalenter av den motsvarande anhydriden i NMP (5 ml), tillsätt en ekvivalent 4-dimetylaminopyridin (DMAP) och 10 ekvivalenter DIEA till lösningen (tabell 1).
    3. Lägg till en 10: 1: 10 blandning av anhydrid / DMAP / DIEA till hartset och inkubera i 300 sek (25W, 75 ° C, Tabell 2). Töm lösningen.
    4. Tvätta hartset med NMP. Lägg NMP till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa tre gånger.
  2. Syra koppling
    1. Tvätta hartset med DMF. Lägg DMF till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa tre gånger.
    2. Lös 10 ekvivalenter av den motsvarande dikarboxylsyran i DMF (5 ml). Lägg ett ekvivalent DMAP och 10 ekvivalenter N, N '-Diisopropylcarbodiimide (DIC) till lösningen (tabell 1).
    3. Pre-aktivera blandningen genom blandning under 30 minuter.
    4. Tillsätt blandningen till hartset och inkubera i 300 sek (25 W, 75 ° C, Tabell 2) och tappa ur lösningen.
    5. Tvätta hartset med DMF. Lägg DMF till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och tappa lösning. Upprepa steg tre gånger.

4. N-methyltrityl (MTT) skyddsgruppen avskyddaJon

Obs: lysinsidokedja var skyddad med N-methyltrityl (MTT) 81, en ​​skyddsgrupp som kan avskyddas selektivt under sura labila förhållanden 82,83. Avskydda Mtt skyddsgrupp manuellt på en shaker utan mikrovågsenergi.

  1. Överför hartset till en polypropen patron utrustad med mössa plug and kranen.
  2. Tvätta hartset med DCM. Lägg DCM till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa tre gånger.
  3. Lägg 15-25 ml av en blandning av 1% trifluorättiksyra (TFA), 5% triisopropylsilan (TIS), och 94% DCM till polypropenen patronen per ett gram harts.
    Obs: TFA är en stark syra och korrosivt och är extremt irriterande för huden, ögonen, och lungvävnad.
    1. Håll koncentrerade lösningar av TFA i kåpan vid alla tidpunkter.
    2. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, skyddsrock och handskar) och arbeta i en väl ventilerad huv. Byt handskar omgåendeom de kommer i kontakt med TFA och omedelbart sanerings spill. Om hud eller ögon kommer i kontakt med syran, spola det drabbade området omedelbart med vatten och tvätta ytterligare 15 minuter.
  4. Placera polypropylen patronen på en shaker och skaka i 5 minuter vid RT.
  5. Töm lösningen från polypropylen patronen genom att applicera vakuum.
  6. Upprepa steg 4,3-4,5, tre gånger.
  7. Tvätta hartset med DCM. Lägg DCM till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa fem gånger.

5. Cyklisering av den linjära peptiden

  1. Tvätta hartset med DCM. Lägg DCM till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa fem gånger.
  2. I en 50 ml polypropylenrör, lös 5 ekvivalenter Bensotriazol-1-ly-oxi-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) i Dibrommetan (DBM, 5 ml) och tillsätt 10 ekvivalenter DIEA till lösningen (tabell 1).
    3. Tabell 2). Töm lösningen.
  3. Tvätta hartset med DCM. Lägg DCM till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa tre gånger.

6. Klyvning och Avskyddande av sidokedjegrupper

  1. Tvätta hartset med DCM och dietyleter.
    1. Lägg DCM till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa två gånger.
    2. Lägg dietyleter till hartset för 120 sek (7 ml, 0 W, rt) och dränera lösningen. Upprepa två gånger.
  2. Torka hartset i vakuumexsickator vid rt under minst 3 h över kaliumhydroxid (KOH, 1-10 g).
  3. Väg den torkade hartset och överföra den till en polypropen patron.
  4. Tillsätt 10 ml av en i förväg kyld trifluorättiksyra (TFA) klyvningscocktail (t.ex., 90% TFA, 2,5% vatten, 2,5% TIS och 5% fenol) till varje ett gram harts.
  5. Skaka om 3 hvid RT.
  6. Samla TFA klyvningslösningen genom filtrering av hartset in i en 50 ml polypropenrör. För filtrering, använda frittan som är i polypropen patronen 12 ml.
  7. Lägg kall dietyleter (35 ml) till röret.
  8. Centrifugera i 5 min vid 1207 xg vid 4 ° C.
  9. Dekaneterskiktet.
  10. Upprepa steg från 6,7 till 6,9, fem gånger.

7. Torkning av Backbone cykliska peptiden

  1. Håll den utfällda peptiden i samma rör och torka den i en huv under 30 minuter.
  2. Lös peptiden i en 1: 1 blandning av vatten och acetonitril (ACN).
  3. Frys den slutliga produktlösningen i flytande kväve.
  4. Lyofilisera den slutliga produkten.

8. Characterizing ryggraden cykliska peptiden

  1. Lös ett litet prov (1 mg) av produkten i vatten (400 pl).
  2. Injicera den upplösta peptiden (10-200 ul) till en omvänd fas högupplösande vätskekromatografi chromatography (RP-HPLC) system för att testa peptidrenhet 34.
  3. Kontrollera massan av peptiden med användning av masspektrometri matrisassisterad laserdesorptionsjonisering (MS-MALDI) 84.
    1. Blanda 1 pl (100 | iM) peptid i en 1: 1 (volym / volym) blandning av acetonitril: vatten med 1 ni av matrisen (5 mg / ml, α-cyano-4-hydroxikanelsyra) i en 1: 1 (v / volym) blandning av acetonitril: vatten med TFA (0,1%).
    2. Spot 1 pl på MS-MALDI plattan.
    3. Torka provet och placera den i masspektrometern.
  4. Väg peptiden och beräkna procent utbyte.
  5. Förvara vid -20 ° C.

9. Övervakning den sammanfattande

  1. Kaiser (ninhydrin) testet 85
    1. Bered reagenslösningarna.
      1. Bered lösning A genom att lösa 16,5 mg kaliumcyanid (KCN) i 25 ml destillerat vatten. Späd 1 ml av ovanstående lösning med 49 ml pyridin.
      2. Bered Lösning Bgenom upplösning av en g ninhydrin i 20 ml etanol.
      3. Bered Lösning C genom upplösning av 40 g fenol i 20 ml etanol.
    2. Använd Kaiser-testet för att kontrollera fullbordandet av aminosyrakoppling eller avskyddande av den skyddande gruppen.
      1. Överför några pärlor från hartset till ett provrör.
      2. Tillsätt tre droppar (~ 100 | il) av varje lösning (A, B och C) och blanda.
      3. Värm provröret på ett värmeblock vid 110 ° C under 5 minuter.
        Obs: Blå pärlor (positivt resultat) indikerar ofullständig kopplingsreaktion eller avskyddande av Fmoc-skyddsgruppen.
  2. Kloranil testet 86
    1. Bered följande reagenser färska för varje test.
      1. Bered en lösning av 2% kloranil i DMF, lösning A.
      2. Framställ en lösning av 2% acetaldehyd i DMF, lösning B.
    2. Utför kloranil test för att kontrollera fullbordandet av aminosyrakoppling eller than avskyddande av den skyddande gruppen.
      1. Blanda 100 pl lösning A med 100 pl av lösning B i en 1,5 ml rör.
      2. Släpp pärlorna i och försiktigt skaka i 5 minuter.
        Obs: mörkbrun färgade pärlor (positiv resultat) indikera borttagande av skydd av Fmoc-skyddsgrupp eller en ofullständig kopplingsreaktion.
  3. Småskalig klyvningsreaktion
    1. Avlägsnande av en liten mängd harts till en polypropen patron 3 ml utrustad med lockplugg och kranen.
    2. Behandla med en 2 ml blandning av 95% TFA, 2,5% vatten och 2,5% TIS.
    3. Skaka blandningen under 30 min vid RT.
    4. Avlägsna hartset genom filtrering med användning av frittan av polypropenen patronen och indunsta lösningsmedlen med en ström av kväve.
    5. Lös återstoden i vatten och analysera produkten med HPLC och / eller MS.

10. Leishmania donovani Promastigote Viability i Kultur-analys

    <li> Leishmania donovani (L. donovani) tillväxt- och behandlingsförhållanden
    1. Kultur L. donovani promastigoter i Dulbeccos Modifikation av Eagles medium (DMEM) med 4,5 g / I glukos, L-glutamin, och natriumpyruvat vid 26 ° C.
    2. Behandla L. donovani promastigoter med cykliska peptider (100 | iM) för 24 timmar vid 26 ° C.
  1. Leishmania donovani (L. donovani) viabilitetsanalys
    1. Utvärdera parasit lönsamhet med 20 pl alamarBlue enligt tillverkarens protokoll.
    2. Bestäm alamarBlue reduktion genom mätning av fluorescens (vid 570 nm excitation och 590 nm emission). Högre fluorescensvärdena indikerar större metabolisk aktivitet och ökad parasit livskraft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här beskriver vi utvecklingen av en fokuserad litet bibliotek med ryggraden cykliska peptider som specifikt riktar viktiga producentprisindex för parasiten Leishmania och agera som antiparasitmedel (för översyn om peptider som riktar protonpumpshämmare som antiparasitmedel 87). Genom syntes av nya ryggraden cykliska peptider, är farmakoforer bevarade i en byggnadsställning av utdragbara storlek. Styrkan hos den fokuserade bibliotek föreslås här är förmågan att variera peptidställningsstorlekar samtidigt som en begränsad grad av konformations frihet genom cyklisering. Hela syntesen av ryggraden cykliska peptider gjordes med hjälp av en automatiserad mikrovågsugn synthesizer på fast stöd, till följd av Fmoc / tBu protokollet. Cyklisering utfördes genom att skapa en amidbindning mellan linkern, anhydrid / syra och sidokedjan amin med lysin. Den slutliga klyvningen och sidokedje-deprotektion utfördes manuellt utan mikrovågsenergi (för syntesschema och fSLUT produkter struktur se Figur 3). Produkten analyserades med hjälp av preparativ HPLC till bildning av 25 mg av ett vitt pulver som lagras vid -20 ° C. Ett prov av produkten kontrollerades medelst MS (figur 4) och dess grad av renhet bestämdes med användning av analytisk HPLC (Figur 5). Ett prov av varje cyklisk peptid sändes för biologisk kontroll. En av de fyra cykliska peptider (PL1) var aktivt mot Leishmania donovani (L. donovani), en parasit som orsakar visceral leishmaniasis, den allvarligaste leishmaniasis hos människor. Peptid PL1 reducerade parasit viabilitet med 75% jämfört med kontrollbehandlingen (tabell 4).

Figur 3
Figur 3. Syntes uppläggning och struktur av ryggraden cykliska peptiden syntetiseras i denna studie Reagens och betingelser:. (I) Aminosyra koppling: 300 sek, 25 W, 75 ° C,användning av 1,1: 1: 2,2 aminosyra / aktivator / aktivator bas. (ii) Fmoc-avskyddning: 30 sek och 180 sek både på 45 W, 75 ° C, med användning 20% ​​piperidin i DMF + 0,1 M HOBt. (iii) anhydrid koppling: 300 sek, 25 W, 75 ° C, med användning 10: 10: 1 anhydrid / DIEA / DMAP i NMP. (iv) Mtt avskyddande: 3 * (300 sekund, 0 W, rt) under användning av en: 5: 94 TFA / TIS / DCM. (v) Cyklisering: 300 sek, 25 W, 75 ° C, med användning av 05:10 PyBOP / DIEA i DBM. (vi) Klyvning och avskyddande: 3 tim, 0 W, rt, med användning av 90: 2,5: 2,5: 5 TFA / TIS / H2O / Fenol. Peptider konjugerades till en TAT 47-57 (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) bärarpeptid genom en amidbindning som en del av syntesen i fast fas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. MALDI-TOF-masspektroskopi spår avrepresentativ ryggrad cyklisk peptid. Den observerade massan, 2853.456 är i nära överensstämmelse med den beräknade massan, 2854,271. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Analytisk omvänd fas HPLC-spår av representativa ryggrad cyklisk peptid. De analytiska HPLC-spår av det råa (A) och renad (B) huvudkedjan cyklisk peptid visas. De lösningsmedelssystem som användes var A (H 2 O med 0,1% TFA) och B (CH3CN med 0,1% TFA). En linjär gradient av 5-50% B vid 1 ml / min i 15 min vid 40 ° C med en C18, 5 ^ m, var 150 mm kolonn appliceras och detekteringen var vid 215 nm. Klicka häratt se en större version av denna siffra.

Lösning Reagens MW (g / mol) d (g / ml) Volym (ml) Koncentration (M) Totala summan
- Aminosyralösning - Alanin aminosyra 311,34 0,2 6,23 g
0,2 M av aminosyra i DMF DMF 100 100 ml
Ett exempel för alanin aminosyra, men samma beräkning bör göras för varje aminosyra, med den lämpliga MW. För att framställa en 100 ml aminosyralösning upplösa 6,23 g av alanin aminosyra i 100 ml DMF. Förvaras vid 4 ° C.
- Avlägsnande av skyddsgrupper lösning- HOBt 135,1 0,1 3,37 g
20% volym / volym lösning av piperidin i DMF med 0,1 M HOBt Piperidin 50 50 ml
DMF 200 200 ml
Avskyddning används för avlägsnande av Fmoc-N α - skyddsgrupp. För att bereda en 250 ml avskyddande lösning upplösa 3,37 g HOBt i 200 ml DMF och tillsätt 50 ml piperidin. Förvaras vid 4 ° C.
- Activator lösning - HBTU 379,24 0,45 18,96 g
0,45 M HBTU i DMF DMF 100 100 ml
Activator äranvändes med aktivatorn bas för att aktivera aminosyran före kopplingsreaktionen. För att framställa en 100 ml aktivatorlösning upplösa 18,96 g HBTU i 100 ml DMF. Förvaras vid 4 ° C.
- Activator baslösning - DIEA 129,24 0,742 2 34,80 ml
2 M DIEA i NMP NMP 65,20 ml
Aktivator bas används med aktivatorn för att aktivera aminosyran före kopplingsreaktionen. För att framställa en 100 ml aktivator baslösning mix 34,8 ml DIEA och 65,2 ml NMP. Förvaras vid 4 ° C.
Lösning Reagens MW (g / mol) d (g / ml) Volym (ml) Eq Totala summan
Anhydridlösningen - 10: 1: 10 anhydrid / DMAP / DIEA i NMP Glutarsyra / Bärnstenssyraanhydrid 114,1 / 100,07 10 0,11 / 0,10 g
DMAP 122,2 1 0,01 g
DIEA 129,24 0,742 10 0,09 ml
NMP 5 5 ml
Lös upp 0,11 / 0,10 g glutarsyra / bärnstenssyraanhydrid i 5 ml NMP, tillsätt 0,01 g DMAP och 0,09 ml DIEA till lösningen. Bered en färsk lösning.
Syralösning - 10: 1: 10 syra / DMAP / DIC i DMF Adipinsyra / pimelinsyra 146,14 / 160,17 10 0,15 / 0,16 g
DMAP </ td> 122,2 1 0,01 g
DIC 126,2 0,806 10 0,16 ml
DMF 5 5 ml
Lös upp 0,15 / 0,16 g Adipinsyra / pimelinsyra i 5 ml DMF, tillsätt 0,01 g DMAP och 0,16 ml DIC till lösningen. Bered en färsk lösning.
Cyklisering lösning - 05:10 PyBOP / DIEA i DBM PyBOP 520,3 5 0,26 g
DIEA 129,24 0,742 10 0,09 ml
DBM 5 ml 5 ml
Lös 0,26 g PyBOP i 5 ml DBM och tillsätt 0,09 ml DIEA till lösningen. Förbered enfärsk lösning.

Tabell 1. Reagens och lösningar för ryggraden cykliska peptidsyntes. Förteckning över de lösningar och reagens för syntesen tillhandahålls.

Mikrovågsugn cykel Effekt (Watt) Temp (° C) Tid (sek)
1 Koppling aminosyror 25 75 300
2 Avskyddande av Fmoc-skyddsgruppen (a) Inledande avskyddning 45 75 30
(b) Fullständig avblockering 45 75 180


Tabell 2. Mikrovågsugn cykler för koppling och avskyddning. Mikrovågsugn cykler föraminosyra koppling och Fmoc-avskyddning. (1) Koppling av aminosyror. (2) Avskyddande av Fmoc maskeringsgruppen sker i två steg: (a) inledande och (b) fullständig avlägsnande.

Problem Möjlig orsak Lösning
Kaiser eller kloranil test är positiva efter aminosyra koppling Aminosyra kopplingen är ofullständig Upprepa kopplingssteget
Peptider inte separeras effektivt från supernatanten Överskott av TFA Indunsta provet med användning av en ström av kväve
Förekomst av deletionssekvenser i produkten Fmoc-avlägsnande är ofullständig Övervaka avskyddning med Kaiser eller kloranil test och / eller småskalig klyvning, i fall Fmoc avlägsnande är ofullständig upprepa steg
Aminosyra couplning är ofullständig Övervaka kopplingen genom Kaiser eller kloranil test och / eller småskalig klyvning, om aminosyrakopplingen är ofullständig upprepa steget och / eller använder längre reaktionstid

Tabell 3. Felsökning råd Förteckning över lösningar för de vanligaste syntetiska utmaningar tillhandahålls.

Peptid Sekvens n FRÖKEN. Cal. MS Iakttagen. HPLC Avkastning Parasit viabilitet
PL1 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 2 2854.321 2853.456 98% 86% 25%
PL2 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 3 2868.348 98% 87% 100%
PL3 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 4 2882.375 2881.823 96% 89% 97%
pL4 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 5 2896.402 2895.603 97% 85% 98%

Tabell 4. Karakterisering och bioaktivitet av peptiderna i denna studie. N avser antalet av metylener i alkyl distanselementet (se fig 3 för struktur). MS utfördes med användning av MALDI-teknik och renheten bestämdes genom analytisk HPLC. Peptider tillsattes till Leishmania donovani promastigoter och livskraften hos parasiter bedömdes och uttrycktes som procent överlevnad jämfört med kontrollodlingar inkuberade i frånvaro av peptid. Endast PL1 hade högt Leishmanicidal aktivitet. Observatörenvar blind för försöksbetingelserna. Data är representativa för tre oberoende experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Syntesen av en fokuserad bibliotek av ryggrads cykliska peptider härledda från LACK proteinet enligt Leishmania parasiten med användning av en helt automatiserad mikrovågsugn syntetiserare beskrivs. En fokuserad bibliotek av cykliska peptider har utvecklats med konserverade farmakoforer och olika länkar. Tillsats av olika linkers såsom glutarsyraanhydrid, bärnstensyraanhydrid, adipinsyra, pimelinsyra, lysin, ornitin, och andra byggblock kan användas för att öka mångfalden av den konformationella utrymmet av de cykliska peptidema. Syntesen av en fokuserad cykliska peptider biblioteket kan forskare att screena för optimal konforma utrymme. Eftersom konforma av cykliska peptider varierar beroende på parametrar såsom ring storlek och position, kan genereras diverse analoger med olika konformationer, som kan vara användbar i biologisk struktur-aktivitetssamband studerar 88.

En största utmaningen i SPPS är diagnostisera synthetic framsteg och problemlösning eftersom inga mellan isoleras. Därför kan flera kolorimetriska tester användas för att övervaka reaktionen, såsom de som identifierar fria aminer av Kaiser och kloranil tester. Om Kaiser eller kloranil test tyder inte (t.ex. prolin och hydroxy-prolin inte reagerar med ninhydrin på samma sätt som de andra aminosyror eftersom deras alfaaminogruppen är en del av en fem-ledad ring), i liten skala klyvningsreaktion och masspektrometrianalys kan appliceras för att övervaka syntesen framsteg.

Klyvning tid och klyvningscocktail kan modifieras baserat på de kemiska egenskaperna och antal av de skyddsgrupper som används. Det rekommenderas att en inledande försöks klyvning med hjälp av en liten mängd av harts (1-10 mg) utföras för att verifiera de rätta förutsättningarna. King et al., Har testat olika klyvningscocktails för olika peptider och deras detaljerade riktlinjer kan användas för att optimera reaction villkor 89. För ryggrads cykliska peptider, är inkubation under minst 3 timmar rekommenderas som en standard för full klyvning. Emellertid peptider innehållande ett stort antal skyddsgrupper eller svåra skyddsgrupper (t.ex. t-butylester eller pentametyl-2,3-dihydrobensofuran-5-sulfonyl) bör inkuberas under en längre tid för att säkerställa fullständig avskyddning. Häri har vi inte systematiskt studerat optimal klyvnings tid eller cocktail. Ändå fann vi att en kort klyvnings tid (mindre än 2 h) resulterade i ofullständig spjälkning av vissa skyddsgrupper.

Standarden mikrovågsugn peptidsyntesprotokoll är en allmängiltig metod för syntes av en mångfald peptider. I de flesta fall kan användningen av en automatisk mikrovågsugn syntetiserare reducerar syntes varaktighet och ökar utbytet och renheten av produkterna. Dessutom minskar det bireaktioner sådana som racemisering och aspartimide bildning. Även om vi inte har gjorten sida-vid-sida jämförelse av mikrovågsugn och konventionell syntes i denna studie, baserad på vår och andra labb erfarenhet, visade det sig att användningen av mikro-syntes är överlägsen den konventionella protokoll 61,70. Nästan alla aktivatorer och hartser kan effektivt användas i mikrovågsugn SPPS och det allmänna förfarandet kan också tillämpas på syntes av en mångfald modifierade peptider, såsom, glykopeptider, fosfopeptider, azapeptides, peptoider och cykliska peptider 90.

Cyklisering är ett bekvämt sätt att öka effekten och stabiliteten av linjära prekursorer. Cykliska peptider kan få en önskvärd begränsad konformation som kan bidra till ökad bindnings affinitet och selektivitet. Dessutom kan linjära peptider modifieras för att innehålla flera cykliska slingor, gör det möjligt för dem att eventuellt rikta flera endogena proteinbindnings gränssnitt 91. Det är emellertid viktigt att notera att cyklisering inte necessarily leda till förbättringar i alla eller ibland någon av dessa egenskaper. Vissa cykliska peptider kan leda till konforma som inte erkänns av riktade receptorer (t ex 92,93) .Därför är nödvändigt att screena för bioaktivitet en fokuserad bibliotek av cykliska peptider. Sammanfattningsvis syntetiska cykliska peptider uppvisar önskvärda farmakologiska egenskaper, är tillräckligt små för att passera cellmembranet, och är tillräckligt stora för att ha hög selektivitet. Hög styrka, specificitet och säker profil bidrar till cykliska peptidernas löfte som läkemedelskandidater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi tackar Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang, och Daria Mochly-Rosen för bra diskussioner. Arbetet stöddes av National Institutes of Health Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) att Nq Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic.
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials - micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
Nitrogen cylinder
Desiccator
Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).
Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450 (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
  3. Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 797-807 (2009).
  4. Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochemistry. 37 (16), 5616-5622 (1998).
  5. Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282 (6), 4113-4123 (2007).
  6. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15 (1-2), 40-56 (2010).
  7. Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, American Chemical Society. 17-24 (2005).
  8. Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305 (5689), 1411-1413 (2004).
  9. Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10 (2), 256-266 (2008).
  10. Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (6), 872-877 (2002).
  11. Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (7), 512-523 (1982).
  12. Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24 (12), 1847-1852 (2003).
  13. Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochemistry. 30 (26), 6574-6583 (1991).
  14. Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116 (11), 1783-1799 (2015).
  15. Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O'Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61 (6), 287-297 (2003).
  16. Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121 (51), 12204-12205 (1999).
  17. Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274 (25), 17573-17579 (1999).
  18. Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6 (1), 99-104 (2004).
  19. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  20. Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using 'safety catch' methodology. J Vis Exp. (63), e4112 (2012).
  21. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2 (12), 3247-3256 (2007).
  22. Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91 (2), 157-168 (2009).
  23. Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based 'building block' approach. Nat. Protoc. 2 (12), 3210-3218 (2007).
  24. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  25. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126 (Pt 3), 789-802 (2013).
  26. Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (2), 203-216 (2008).
  27. Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9 (2), 169-185 (2009).
  28. Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446 (7139), 1046-1051 (2007).
  29. Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291 (5508), 1523-1527 (2001).
  30. Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3 (4), 646-654 (2008).
  31. Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1 (3), 175-183 (1995).
  32. Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90 (4), 526-536 (2008).
  33. O'Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10 (10), 857-876 (2007).
  34. Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84 (12), 1988-1991 (2007).
  35. Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79 (1), 85-86 (2002).
  36. Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis - A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 75-82 (2007).
  37. Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2 (7), 587-593 (2003).
  38. Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29 (2), 4-7 (2011).
  39. Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37 (22), 3404-3409 (1972).
  40. Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (3), 279-282 (1986).
  41. Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (41), 4945-4948 (1986).
  42. Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5 (1), 51-63 (2006).
  43. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (46), 6250-6284 (2004).
  44. de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34 (2), 164-178 (2005).
  45. Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57 (18), 4781-4784 (1992).
  46. Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20 (1), 1-47 (1991).
  47. Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27 (3), 213-224 (1998).
  48. Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (6), 762-770 (2008).
  49. Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5 (1), 39-50 (2010).
  50. Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (9), 2222-2227 (2007).
  51. Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (3), 624-631 (2007).
  52. Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13 (3), 143-148 (2007).
  53. Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
  54. Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11 (20), 4488-4491 (2009).
  55. Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 203-208 (2007).
  56. Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7 (5), 877-880 (2005).
  57. Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8 (20), 4465-4468 (2006).
  58. Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71 (26), 9609-9621 (2006).
  59. Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12 (4), 349-357 (2006).
  60. Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14 (4), 387-392 (2008).
  61. Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85 (3), 300-305 (2014).
  62. Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7 (25), 5649-5652 (2005).
  63. Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4 (23), 4057-4059 (2002).
  64. Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7 (8), 1521-1524 (2005).
  65. Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51 (9), 2701-2707 (2008).
  66. Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75 (1), 40-50 (2010).
  67. Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7917-7927 (2009).
  68. Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
  69. Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10 (12), 2329-2332 (2008).
  70. Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14 (6), 683-689 (2008).
  71. Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2 (3), 281-283 (2004).
  72. Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13271-13280 (2005).
  73. Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20 (1), 25-33 (2009).
  74. Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28 (1), 14-16 (2010).
  75. Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7 (2), e87-e93 (2010).
  76. Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268 (5210), 563-566 (1995).
  77. Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198 (11), 1689-1698 (2003).
  78. Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6 (6), e20710 (2011).
  79. Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259 (3), 909-916 (1999).
  80. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13 (10), 443-448 (2007).
  81. Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45 (5), 488-496 (1995).
  82. Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60 (5), 300-303 (2002).
  83. Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6 (6), 264-270 (2000).
  84. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373 (2011).
  85. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  86. Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33 (10), 763-766 (1979).
  87. Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32 (6), 62-66 (2014).
  88. Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39 (16), 3174-3178 (1996).
  89. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36 (3), 255-266 (1990).
  90. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41 (5), 1826-1844 (2012).
  91. Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28 (11), 2698-2709 (2008).
  92. Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58 (3), 246-256 (2001).
  93. Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52 (2), 83-90 (2006).

Tags

Kemi Utgåva 107 protein-proteininteraktioner peptider peptidomimetika cyklisk peptid ryggrad cyklisering fastfaspeptidsyntes mikrovågsbestrålning mikrovågsassisterad syntes
Utveckling av en Backbone cyklisk peptidbibliotek som Potential Antiparasitärt Therapeutics Använda mikrovågsstrålning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qvit, N., Kornfeld, O. S.… More

Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter