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Chemistry

Développement d'un Backbone peptide cyclique Bibliothèque en tant que potentiel Antiparasitaires Therapeutics Utilisation irradiation micro-ondes

Published: January 26, 2016 doi: 10.3791/53589
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

Abstract

Interactions protéine-protéine (IPP) sont intimement impliqués dans la plupart des processus biologiques et sont liées à de nombreuses maladies humaines. Par conséquent, il ya un effort important de cibler les IPP en recherche fondamentale et dans l'industrie pharmaceutique. Interfaces protéine-protéine sont généralement de grande taille, plat, et manquent souvent des poches, ce qui complique la découverte de petites molécules qui ciblent ces sites. Les approches de ciblage alternatifs utilisant des anticorps ont des limitations dues à la biodisponibilité orale pauvre, faible perméabilité cellulaire, et l'inefficacité de la production.

Utilisation de peptides pour cibler interfaces PPI présente plusieurs avantages. Les peptides ont flexibilité conformationnelle plus élevée, une sélectivité accrue, et sont généralement peu coûteux. Cependant, les peptides ont leurs propres limites, y compris une mauvaise stabilité et l'inefficacité de traverser les membranes cellulaires. Pour surmonter ces limitations, un peptide cyclisation peut être effectuée. Cyclisation a été démontré pour améliorer la sélectivité peptide, La stabilité métabolique et la biodisponibilité. Cependant, la prédiction de la conformation bioactive d'un peptide cyclique est pas trivial. Pour surmonter ce défi, une approche attrayante pour cribler une banque ciblée à l'écran dans lequel tous les peptides cycliques de squelette ont la même séquence primaire, mais diffèrent dans les paramètres qui influent sur leur conformation, tels que la taille et la position de l'anneau.

Nous décrivons un protocole détaillé pour la synthèse d'une bibliothèque de peptides cycliques backbone ciblant IPP de parasites spécifiques. En utilisant une approche de conception rationnelle, nous avons développé des peptides dérivés du récepteur L eishmania de protéines d'échafaudage C-kinase activée (manque). Nous émettons l'hypothèse que les séquences A défaut qui sont conservés dans parasites, mais pas dans l'homologue hôte de mammifère, peuvent représenter des sites d'interaction pour des protéines qui sont essentiels pour la viabilité des parasites. Les peptides cycliques ont été synthétisés par irradiation micro-ondes pour réduire les temps de réaction et d'augmenterEfficacité. Développer une bibliothèque de peptides cycliques backbone avec différentes tailles d'anneaux facilite un écran systématique de la conformation active plus biologique. Cette méthode fournit une manière générale, rapide et facile à synthétiser des peptides cycliques.

Introduction

Interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central dans la plupart des processus biologiques, de transduction du signal intracellulaire à la mort cellulaire 1. Par conséquent, en ciblant les IPP est d'une importance fondamentale à la recherche fondamentale et les applications thérapeutiques. IPP peuvent être réglés par des anticorps spécifiques et stables, mais les anticorps sont coûteux et difficiles à fabriquer et ont une faible biodisponibilité. Alternativement, les IPP peuvent être ciblées par de petites molécules. Les petites molécules sont plus faciles à synthétiser et à bon marché par rapport à des anticorps; cependant, ils sont relativement moins flexible et correspondent mieux aux petites et grandes cavités à des interfaces protéine-protéine 2,3. Diverses études ont démontré que les peptides, qui sont plus simples et moins coûteux que des anticorps et plus flexibles que les petites molécules, peuvent se lier à des interfaces de protéine et réguler IPP 4,5. Le marché mondial du peptide thérapeutique a été évalué autour de quinze milliards de dollars en 2013 et est en croissance de 10,5% annually 6. En outre, il ya plus de 50 peptides, commercialisés autour de 270 peptides dans les différentes phases des essais cliniques, et environ 400 peptides en phase préclinique avancé 7. Bien que de nombreux peptides sont utilisés comme médicaments, peptides posent encore plusieurs défis qui limitent leur application généralisée, y compris une faible biodisponibilité et la stabilité, l'inefficacité dans les membranes cellulaires de passage, et la flexibilité conformationnelle 8,9. Une alternative à surmonter ces inconvénients consiste à appliquer différentes modifications telles que (acide D-aminé et N-alkylation) local et global (cyclisation) 8,10-12 contraintes. Ces modifications se produisent aussi naturellement. Par exemple, la cyclosporine A, un peptide cyclique naturel immunosuppresseur, contient un acide D-aminé unique et subit des modifications N-alkylation 13,14.

La modification des acides aminés naturels à induire des contraintes locales, telles que D et N-alkylation, affecte souvent le peptide9, de l'activité biologique. Cependant, la cyclisation, dans laquelle la séquence d'intérêt peut rester le même, est plus susceptible de conserver une activité biologique. Cyclisation est un moyen très attractif pour restreindre l'espace conformationnel peptide en réduisant l'équilibre entre les différentes conformations. Il augmente généralement l'activité biologique et la sélectivité en limitant le peptide de la conformation active qui médie une seule fonction. La cyclisation améliore également la stabilité du peptide en maintenant le peptide dans une conformation qui est moins reconnu par les enzymes de dégradation. En effet, les peptides cycliques se sont avérés avoir une meilleure stabilité métabolique, la biodisponibilité et la sélectivité par rapport à leurs homologues linéaires 15-17.

Cependant, la cyclisation peut être une arme à double tranchant puisque, dans certains cas, la restriction peut empêcher les peptides d'atteindre une conformation bioactive. Pour surmonter cet obstacle, une bibliothèque ciblée dans laquelle tous les peptides ont la même sequenc primairee et par conséquent constants pharmacophores peuvent être synthétisés. Peptides dans la bibliothèque diffèrent des paramètres qui influent sur ​​leur structure, tels que la taille et la position de l'anneau, afin de dépister la suite pour la conformation la plus bioactive 9,18.

Peptides peuvent être synthétisés à la fois en solution et une approche par synthèse peptidique en phase solide (SPPS), qui est maintenant l'approche de la synthèse des peptides plus répandue et seront discutés plus loin. SPPS est un processus par lequel les transformations chimiques sont réalisées sur un support solide par l'intermédiaire d'un lieur pour préparer une large gamme de composés synthétiques 19. SPPS permet d'assemblage peptides par couplage consécutif d'acides aminés par étapes à partir de l'extrémité C-terminale, qui est fixé à un support solide, à l'extrémité N-terminale. Les chaînes latérales d'acide N-a-aminés doivent être masqués par des groupes protecteurs qui sont stables dans les conditions réactionnelles utilisées au cours de l'allongement de peptide pour assurer l'addition d'un acide aminé par rep. Dans l'étape finale, le peptide est libéré de la résine et la chaîne latérale sont des groupes protecteurs de façon concomitante enlevé. Bien que le peptide est synthétisé, tous les réactifs solubles peuvent être éliminés à partir de la matrice de support solide de peptides par filtration et lavés à la fin de chaque étape de couplage. Avec un tel système, un grand excès de réactifs à forte concentration peut conduire les réactions de couplage à l'achèvement et à toutes les étapes de synthèse peuvent être effectuées dans le même récipient sans aucun transfert de matériel 20.

Bien SPPS a quelques limitations telles que la production de réactions incomplètes, des réactions secondaires, des réactifs impurs, ainsi que les difficultés de suivi de la réaction 21, les avantages de la SPPS ont fait le «gold standard» pour la synthèse peptidique. Ces avantages comprennent la possibilité d'incorporer des acides aminés non naturels, l'automatisation, la purification facile, pertes physiques réduites, et l'utilisation de réactifs en excès, résultant endes rendements élevés. SPPS a été montré pour être extrêmement utile dans la synthèse de séquences difficiles 21,22 fluorescents, des modifications 23 et des banques de peptides 24,25. SPPS est également très utile pour d'autres ensembles de poly-chaîne tels que des oligonucleotides, des oligosaccharides 28,29 26,27 et 30,31 acides nucléiques peptidiques. Fait intéressant, dans certains cas, SPPS a été montré qu'il était avantageux pour la synthèse de petites molécules qui sont traditionnellement fabriqués en solution 32,33. SPPS est utilisé à la fois sur une petite échelle pour la recherche et l'enseignement ainsi que 34,35 à grande échelle dans l'industrie 36-38.

Deux stratégies de synthèse qui sont utilisés principalement dans la méthode SPPS pour la synthèse de peptides sont butyloxycarbonyle (Boc) et 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc). La stratégie originale a été introduit pour SPPS Boc, ce qui nécessite des conditions fortement acides pour éliminer la chaîne latérale et les groupes protecteurs de cliver le peptide de la resin. La synthèse des peptides à base de Fmoc, cependant, utilise des conditions modérées de base et est une alternative plus doux au protocole Boc labile en milieu acide 39. La stratégie Fmoc utilise de t-butyle (tBu) la protection de la chaîne latérale orthogonale qui est enlevée lors de la dernière étape de la synthèse tandis que le clivage du peptide de la résine dans des conditions acides.

Le principe général pour la synthèse peptidique sur support solide est présentée dans la figure 1. L'acide aminé initial, masqué par un groupe protecteur temporaire sur le N-α-terminale, est chargé sur la résine à partir de l'extrémité C-terminale. Un groupe protecteur semi-permanent pour masquer la chaîne latérale est également utilisé le cas échéant (figure 1, étape 1). La synthèse du peptide cible est assemblée à partir de l'extrémité C-terminale à l'extrémité N-terminale par des cycles répétitifs de déprotection du groupe protecteur N-α-temporaire (figure 1, étape 2) et de couplage du prochain acide aminé protégé (Figure 1 ong>, étape 3). Après le dernier acide aminé est chargé (Figure 1, étape 4), le peptide est clivé à partir du support de résine et les groupes protecteurs semi-permanentes sont enlevés (figure 1, étape 5).

Figure 1
Figure 1. Schéma général de synthèse de peptides en phase solide. L'acide aminé N-α-protégé est ancrée à l'aide du groupe carboxyle par l'intermédiaire d'un lieur à la résine (étape 1). Le peptide souhaité est assemblé de manière linéaire à partir de l'extrémité C-terminale à l'extrémité N-terminale par des cycles répétitifs de déprotection du groupe temporaire de protection (TPG) à partir du N-α (étape 2) et le couplage d'acides aminés (étape 3). Après l'accomplissement de la synthèse (étape 4), les groupes protecteurs semi-permanents (SPG) sont déprotégés pendant clivage du peptide (étape 5).obtenir = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Après assemblage de la chaîne peptidique complète, cyclisation peut être réalisé en plusieurs alternatives: (A) en tête-à-queue cyclisation - ce qui est un moyen pratique, mais limité, car il donne une seule option pour la cyclisation (figure 2A), (B) cyclisation en utilisant les acides aminés provenant de la séquence d'intérêt qui contiennent des groupes fonctionnels bioactifs - cependant, l'utilisation de ces acides aminés peut influer sur l'activité biologique (figure 2B), et (C) la cyclisation par addition d'acides aminés (ou d'autres éléments de base) sans perturber la séquence bioactive. L'introduction de ces molécules est très répandue car elle permet la production des banques focalisées sans modifier la séquence d'intérêt (figure 2C).

Figure 2
Figure 2. stratégies peptide alternatif de cyclisation (A) de tête à la queue cyclisation, par le biais d'une liaison peptidique entre l'extrémité C-terminale et N-terminale.; (B) la cyclisation entre les groupes fonctionnels comme une liaison disulfure entre les résidus de cysteine ​​(1), ou une liaison amide entre les chaînes latérales de la lysine à aspartique / acide glutamique (2), ou une chaîne latérale d'extrémité N- ou C-terminale (3 -4); (C) cyclisation en ajoutant des acides aminés supplémentaires ou des dérivés d'acides aminés ou de petites molécules, par exemple avant (R0) et après (R7), la séquence bioactif. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Synthèse utilise irradiation micro-ondes pour chauffer réactions, accélérant ainsi chimique organique assistée par micro-ondes transformations 40,41. Chimie des micro-ondes est fondé sur la capacité du réactif / solvant pour absorber lemicro-ondes de l'énergie et le convertir en chaleur 42. Avant la technologie est répandue, des inconvénients majeurs ont dû être surmontés, y compris la contrôlabilité et la reproductibilité des protocoles de synthèse et le manque de systèmes disponibles pour température et de pression des contrôles adéquats 43,44. Le premier rapport de synthèse peptidique assistée par micro-ondes a été effectué en utilisant un four micro-ondes de cuisine pour synthétiser plusieurs peptides courts (7-10 acides aminés) avec une amélioration significative de l'efficacité de couplage et la pureté 45. De plus, l'énergie de micro-ondes a été montré pour diminuer l'agrégation de chaîne, de réduire les réactions secondaires, limiter la racémisation, et améliorer le taux de couplage, qui sont tous essentiels pour les séquences difficiles et longues 46-53.

Actuellement, l'utilisation de l'irradiation de micro-ondes pour la synthèse de peptides ou de composés apparentés sur un support solide est très étendue, y compris: (A) synthèse dans l'eau au lieu de 54 solvant organique; (B) synthèse de peptides avecmodifications post-traductionnelles communs, tels que les glycopeptides ou les phosphopeptides 59-61 55-58, dont la synthèse est typiquement difficile en raison de la faible efficacité de couplage de dérivés d'acides aminés à encombrement stérique; (C) la synthèse de peptides à modification dans le squelette, tels que azapeptides, qui peuvent être formés par le remplacement de la C (α) d'un résidu d'acide aminé par un atome d'azote 62, ou peptoïdes, dont la chaîne latérale est reliée à la amide de l'azote plutôt que l'atome Ca 63,64; (D) la synthèse de peptides cycliques 65-71; et (E) synthèse de bibliothèques combinatoires 51,72. Dans de nombreux cas, les auteurs ont rapporté une plus grande efficacité et une réduction du temps de synthèse en utilisant irradiation micro-ondes par rapport au protocole classique.

En utilisant une conception rationnelle 73-75, nous avons développé des peptides anti-parasitaires qui ont été tirées de la récepteurs de l'échafaud L eishmania for activé C-kinase (manque). MANQUE joue un rôle important dans la phase précoce de l'infection Leishmania 76. Les parasites exprimant des niveaux inférieurs de l'absence ne parviennent pas à parasiter les souris immunodéprimées même 77 que le manque est impliqué dans les processus de signalisation de parasites essentiels et la synthèse des protéines 78. Par conséquent, MANQUE est une protéine d'échafaudage clé 79 et une cible de médicament précieux. En se concentrant sur ​​des séquences en manque qui sont conservés dans les parasites, mais pas chez l'hôte mammifère homologue RACK, nous avons identifié un peptide de 8 acides aminés (RNGQCQRK) que la diminution de Leishmania sp. Viabilité dans la culture.

Ici, nous décrivons un protocole pour la synthèse du squelette cyclique des peptides dérivés de la séquence de la protéine LACK décrit ci-dessus. Les peptides ont été synthétisés sur un support solide en utilisant un chauffage par micro-ondes par la méthode SPPS Fmoc avec protocole / tBu. Les peptides ont été conjugués à un TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) transporteur peptide par une liaison amide commepartie de la SPPS. Le transport d'une variété de cargaisons dans des cellules à base de TAT a été utilisé pendant plus de 15 ans et la livraison de la cargaison dans des organites intracellulaires a été confirmée 80. Quatre groupes de liaison différents, succinique et l'anhydride glutarique adipique, ainsi que et l'acide pimélique, ont été utilisés pour effectuer la cyclisation pour produire des lieurs d'acides carboxyliques de deux à cinq atomes de carbone. La cyclisation a été effectuée en utilisant une énergie hyperfréquence, et le clivage de la chaîne latérale et les dernières étapes de déprotection a été effectuée manuellement sans énergie micro-ondes. L'utilisation d'un synthétiseur automatisé de micro-ondes a amélioré la pureté du produit, a augmenté le rendement en produit, et de réduire la durée de la synthèse. Ce protocole général peut être appliqué à d'autres études qui utilisent des peptides de comprendre le mécanisme moléculaire important dans vitro et in vivo et de développer des médicaments potentiels pour des maladies humaines.

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Protocol

1. Matériel et réactifs Préparation

  1. Préparation de l'équipement
    1. Effectuez toutes les étapes à l'intérieur d'une hotte en utilisant un équipement de protection adéquat.
    2. Synthétiser chimiquement les peptides sur support solide en utilisant un synthétiseur de peptides à micro-ondes avec un module supplémentaire de Discover équipé d'une sonde de température à fibre optique pour commander la fourniture de micro-ondes de puissance dans un récipient de réaction en Téflon (30 ml, avec une fritte de verre) ou dans un polypropylène à usage unique Cartouche (12 ml, avec une fritte grossier).
    3. Pour un mélange correct, connecter l'alimentation en azote dans le récipient de réaction, ou bien sceller les deux extrémités de la cartouche de polypropylène, et le placer sur un agitateur rotatif.
    4. Pour drainer des mélanges ou des lavages réaction, se connecter à l'aspirateur de la maison par l'intermédiaire d'un siphon.
    5. Placer la sonde à fibre optique dans le récipient de réaction.
  2. Préparation des réactifs
    1. Préparer la résine en pesant Rink Amide AM résine 100-200 mesh (0,204 mg), Ajouter 5 ml de mélange 1: 1 de N, N-diméthylformamide (DMF) / dichlorométhane (DCM) à la cartouche navire / polypropylène réaction à laver la résine vers le bas, agiter pendant 2-4 heures à gonfler correctement, et les égoutter.
    2. Préparer 0,2 M 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc) amino solutions acides en dissolvant l'acide Fmoc-aminé correspondant dans du DMF et le mélange vortex jusqu'à ce que les acides aminés sont dissous (tableau 1).
    3. Préparer 0,45 M activateur solution en dissolvant 18,96 mix g O - (benzotriazol-1-yl) - N, N, N ', N' tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU) dans 100 ml de DMF et le mélange au vortex jusqu'à ce que le solide est dissous (Tableau 1).
    4. Préparer 2 M activateur base de mélange de solution en combinant 34,8 ml de N, N-diisopropyléthylamine (DIEA) avec 65,2 ml de 1-méthyl-2-pyrrolidinone (NMP) (tableau 1).
    5. Préparer une solution 0,1 M de déprotection mélange par dissolution de 3,37 g d'hydrate de 1-hydroxybenzotriazole (HOBt)dans 250 ml d'une solution v / v de 20% de pipéridine dans du DMF et le mélange au vortex jusqu'à ce que le solide est dissous (tableau 1).

2. Fmoc-protégé amino acide Accouplement

  1. Couplage des acides aminés
    1. Ajouter de l'acide aminé (2,5 ml) / activateur (1 ml) / de la base de l'activateur (0,5 ml) à une réaction cartouche récipient / polypropylène et de laisser la réaction se déroule pendant 300 sec (25 W, 75 ° C, Tableau 2). Égoutter la solution.
    2. Laver la résine avec du DMF. Ajouter DMF à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, RT) et vidanger la solution. Répétez cinq fois.
  2. Déprotection Fmoc
    1. Ajouter 7 ml de pipéridine à 20% dans du DMF avec 0,1 M de HOBt réaction cartouche récipient / polypropylène et incuber pendant 30 sec (45 W, 75 ° C, Tableau 2).
    2. Égoutter le mélange de réaction.
    3. Ajouter 7 ml de pipéridine à 20% dans le DMF avec 0,1 M de HOBt à la réaction cartouche navire / polypropylène et incuber pendant 180 secondes (45 W, 75 ° C, Tableau 2).
    4. Égoutter le mélange de réaction.
    5. Laver la résine avec du DMF. Ajouter du DMF à la résine pour 120 sec (7 ml 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez cinq fois.
      Remarque: En option, mettre en pause la procédure ici et reprendre à une date ultérieure.
  3. Après acide aminé étape de couplage, laver la résine avec du DCM et de stocker pendant au moins plusieurs jours à 4 ° C (pour une période plus longue magasin la résine à - 20 ° C).
    1. Déplacer la résine de la cuve de réaction à une cartouche de polypropylène.
    2. Laver la résine avec du DCM. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois.
    3. Sceller la cartouche de polypropylène étroitement avec un capuchon et robinet.
    4. Avant de commencer une nouvelle synthèse, gonfler la résine pendant 3-4 heures dans le DMF (7 ml).
  4. Suivi de la synthèse
    1. Utilisez le test de Kaiser (ninhydrine) ou un test Chloranile de déterminer rapidement les progrès de lala synthèse. En option, effectuer une réaction de clivage à petite échelle pour déterminer la pureté et la masse du peptide synthétisé. Voir la section 9.
      Remarque: Pour de plus amples dépannage voir le tableau 3.
  5. Répétez les étapes 2.1 et 2.2 comme désiré pour synthétiser peptide ciblé: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Anhydride / Couplage acide

  1. Couplage anhydride
    1. Laver la résine avec de la NMP. Ajouter NMP à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois.
    2. Dissoudre 10 équivalents de l'anhydride correspondant dans de la NMP (5 ml), ajouter 1 équivalent de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) et 10 équivalents de DIEA pour la solution (Tableau 1).
    3. Ajouter un mélange 10: 10 d'anhydride / DMAP / DIEA à la résine et incubation pendant 300 sec (25: 1W, 75 ° C, Tableau 2). Égoutter la solution.
    4. Laver la résine avec de la NMP. Ajouter NMP à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois.
  2. Couplage de l'acide
    1. Laver la résine avec du DMF. Ajouter DMF à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois.
    2. Dissoudre 10 équivalents de l'acide dicarboxylique correspondant dans du DMF (5 ml). Ajouter 1 équivalent de DMAP et 10 équivalents de N, N '-Diisopropylcarbodiimide (DIC) à la solution (Tableau 1).
    3. Pré-activer le mélange en mélangeant pendant 30 min.
    4. Ajouter le mélange à la résine et incubation pendant 300 sec (25 W, 75 ° C, le tableau 2) et vidanger la solution.
    5. Laver la résine avec du DMF. Ajouter DMF à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger solution. Répétez l'étape trois fois.

4. N-méthyltrityle (MTT) Protéger Groupe Déprotégerion

Remarque: La chaîne latérale de la lysine est protégée avec le N-méthyltrityle (Mtt) 81, un groupe protecteur qui peut être sélectivement déprotégé dans des conditions acides labiles 82,83. Groupe déprotègent Mtt protéger manuellement sur un agitateur sans énergie à micro-ondes.

  1. Transférer la résine à une cartouche de polypropylène équipé de capuchon de bougie et robinet.
  2. Laver la résine avec du DCM. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois.
  3. Ajouter 15 à 25 ml d'un mélange de 1% d'acide trifluoroacétique (TFA), 5% de triisopropylsilane (TIS), et 94% de DCM à la cartouche de polypropylène par gramme de résine.
    Remarque: TFA est un acide fort et corrosif et est extrêmement irritant pour la peau, les yeux et les tissus pulmonaires.
    1. Garder solutions concentrées de TFA dans la hotte à tout moment.
    2. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié (protection oculaire, une blouse et des gants) et le travail dans une hotte bien ventilée. Changer rapidement les gantssi elles entrent en contact avec du TFA et immédiatement nettoyage des déversements. Si la peau ou les yeux entrent en contact avec l'acide, rincez la zone affectée immédiatement avec de l'eau et laver pendant 15 min supplémentaires.
  4. Placez la cartouche de polypropylène sur un agitateur et agiter pendant 5 min à température ambiante.
  5. Égoutter la solution à partir de la cartouche de polypropylène par application d'un vide.
  6. Répétez les étapes 4.3-4.5, trois fois.
  7. Laver la résine avec du DCM. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez cinq fois.

5. La cyclisation du peptide linéaire

  1. Laver la résine avec du DCM. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez cinq fois.
  2. Dans un tube en polypropylene de 50 ml, dissoudre 5 équivalents de benzotriazole-ly 1-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) de dibromométhane (DBM, 5 ml) et 10 équivalents de DIEA ajouter à la solution (Tableau 1).
    3. tableau 2). Égoutter la solution.
  3. Laver la résine avec du DCM. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répétez trois fois.

6. Le clivage et la déprotection des chaînes latérales

  1. Laver la résine avec du DCM et de l'éther diéthylique.
    1. Ajouter DCM à la résine pendant 120 secondes (7 ml, 0 W, rt) et vidanger la solution. Répéter deux fois.
    2. Ajouter de l'éther diéthylique à la résine pour 120 sec (7 ml, 0 W, température ambiante) et vidanger la solution. Répéter deux fois.
  2. On sèche la résine sous vide dans un dessiccateur à température ambiante pendant au moins 3 heures sur de l'hydroxyde de potassium (KOH, 10.1 g).
  3. Peser la résine séchée et le transférer sur une cartouche en polypropylène.
  4. Ajouter 10 ml d'acide trifluoroacétique à un (TFA) clivage cocktail pré-refroidi (par exemple, 90% de TFA, 2,5% d'eau, 2,5% de TIS et 5% de phénol) pour chaque gramme de résine.
  5. Agiter pendant 3 heuresà la température ambiante.
  6. Recueillir la solution de clivage TFA par filtration de la résine dans un tube de polypropylene de 50 ml. Pour la filtration, en utilisant la fritte qui se trouve dans la cartouche 12 ml en polypropylene.
  7. Ajouter de l'éther diéthylique froid (35 ml) au tube.
  8. Centrifugeuse pendant 5 min à 1207 g à 4 ° C.
  9. Décanter la couche d'éther.
  10. Répétez l'étape 6,7-6,9, cinq fois.

7. Le séchage du Backbone peptide cyclique

  1. Gardez le peptide précipité dans le même tube et le sécher dans une hotte pendant 30 min.
  2. On dissout le peptide dans un mélange 1: 1 d'eau et d'acétonitrile (ACN).
  3. Congeler la solution finale du produit dans de l'azote liquide.
  4. Lyophiliser le produit final.

8. Caractérisation du Backbone peptide cyclique

  1. Dissoudre un petit échantillon (1 mg) du produit dans l'eau (400 ul).
  2. Injecter le peptide dissous (10 à 200 ul) à un liquide à haute performance en phase inverse chromatography système (RP-HPLC) pour tester la pureté du peptide 34.
  3. Vérifiez la masse du peptide en utilisant la spectrométrie de masse par désorption laser assistée par matrice ionisation (MALDI-MS) 84.
    1. Mélanger 1 pi (100 pM) peptide dans un mélange 1: (v / v) d'acétonitrile 1: eau avec 1 pl de matrice (acide 5 mg / ml, α-cyano-4-hydroxycinnamique) dans un mélange 1: 1 (v / v) d'acétonitrile: eau avec du TFA (0,1%).
    2. Spot 1 pl sur la plaque MS-MALDI.
    3. Sécher l'échantillon et le placer dans le spectromètre de masse.
  4. Peser le peptide et de calculer le rendement de pour cent.
  5. Conserver à -20 ° C.

9. Suivi de la Synthèse

  1. Kaiser (ninhydrine) Test 85
    1. Préparer les solutions de réactifs.
      1. Préparer la solution A en dissolvant 16,5 mg de cyanure de potassium (KCN) dans 25 ml d'eau distillée. Diluer 1 ml de la solution ci-dessus avec 49 ml de pyridine.
      2. Préparer la solution Bpar dissolution de 1 g de ninhydrine dans 20 ml d'éthanol.
      3. Préparer la solution C en dissolvant 40 g de phénol dans 20 ml d'éthanol.
    2. Utilisez le test de Kaiser pour vérifier l'achèvement du couplage de l'acide aminé ou la déprotection du groupe protecteur.
      1. Transférer quelques perles de la résine dans un tube à essai.
      2. Ajouter trois gouttes (~ 100 pi) de chaque solution (A, B et C) et mélanger.
      3. Chauffer le tube à essai sur un bloc chauffant à 110 ° C pendant 5 min.
        Note: perles de couleur bleue (résultat positif) indiquent réaction de couplage incomplet ou déprotection du groupe protecteur Fmoc.
  2. Chloranile essai 86
    1. Préparer les réactifs suivants fraîches pour chaque test.
      1. Préparer une solution à 2% de chloranile dans du DMF, la solution A.
      2. Préparer une solution de 2% de l'acétaldéhyde dans le DMF, la solution B.
    2. Effectuer le test Chloranile pour vérifier l'achèvement du couplage de l'acide aminé ou til déprotection du groupe protecteur.
      1. Mélanger 100 ul de solution A avec 100 ul de solution B dans un tube de 1,5 ml.
      2. Déposez les billes et secouez doucement pendant 5 min.
        Remarque: perles de couleur brun foncé (résultat positif) indiquent déprotection du groupe protecteur Fmoc ou une réaction de couplage incomplet.
  3. Réaction de clivage à petite échelle
    1. Retirer une petite quantité de résine pour une cartouche de polypropylène de 3 ml muni de capuchon de bougie et robinet.
    2. Traitez-les avec un mélange de 2 ml de TFA à 95%, 2,5% d'eau et 2,5% TIS.
    3. Agiter le mélange pendant 30 min à température ambiante.
    4. Éliminer la résine par filtration en utilisant la fritte de la cartouche de polypropylène et évaporer les solvants par un courant d'azote.
    5. Dissoudre le résidu dans l'eau et analyser le produit par HPLC et / ou MS.

10. Leishmania donovani Promastigote viabilité Culture Assay

    <li> Leishmania donovani (L. donovani) Les conditions de croissance et de traitement
    1. Culture L. donovani promastigotes dans la modification de Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM) avec 4,5 g / L de glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium à 26 ° C.
    2. Traiter le L. donovani promastigotes avec des peptides cycliques (100 uM) pendant 24 heures à 26 ° C.
  1. Leishmania donovani (L.donovani) test de viabilité
    1. Évaluer la viabilité parasite avec 20 ul alamarBlue selon le protocole du fabricant.
    2. Déterminer la réduction alamarBlue en mesurant la fluorescence (à 570 nm et 590 nm excitation émission). Des valeurs plus élevées de fluorescence indiquent une plus grande activité métabolique et l'augmentation de la viabilité du parasite.

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Representative Results

Nous décrivons ici le développement d'une petite bibliothèque ciblée de la colonne vertébrale des peptides cycliques qui ciblent spécifiquement les IPP vitaux du parasite Leishmania et agir en tant qu'agents antiparasitaires (pour avis sur les peptides qui ciblent les IPP comme agents antiparasitaires 87). Grâce à la synthèse de nouveaux backbone peptides cycliques, pharmacophores sont conservées dans un échafaudage de taille extensible. La force de la bibliothèque focalisée proposé ici est la possibilité de faire varier les tailles peptide d'échafaudage, tout en permettant un degré limité de liberté conformationnelle par cyclisation. L'ensemble de la synthèse des peptides cycliques squelette a été fait en utilisant un synthétiseur automatisé de micro-ondes sur un support solide, suivant le protocole Fmoc / tBu. La cyclisation est réalisée en créant une liaison amide entre le groupe de liaison, l'anhydride / acide, et l'amine de la chaîne latérale de la lysine. Le clivage et la chaîne latérale finale déprotection ont été effectuées manuellement, sans l'énergie des micro-ondes (pour le schéma de synthèse et fproduits FINALES la structure voir Figure 3). Le produit a été analysé par HPLC preparative pour obtenir 25 mg de poudre blanche stockées à -20 ° C. Un échantillon du produit a été vérifiée par la SP (figure 4) et de son degré de pureté a été déterminée en utilisant une HPLC analytique (Figure 5). Un échantillon de chaque peptide cyclique a été envoyé pour le dépistage biologique. L'un des quatre peptides cycliques (PL1) est actif contre Leishmania donovani (L. donovani), un parasite provoquant la leishmaniose viscérale, la leishmaniose plus grave chez les humains. Peptide pL1 parasite viabilité réduite de 75% par comparaison avec le traitement témoin (tableau 4).

Figure 3
Figure 3. schéma de synthèse et de la structure du squelette peptidique cyclique synthétisés dans cette étude Réactifs et conditions:. (I) couplage de l'acide aminé: 300 sec, 25 W, 75 ° C,en utilisant 1,1: 1: 2,2 acide aminé / activateur / base de l'activateur. (ii) la déprotection Fmoc: 30 s et 180 s à la fois à 45 W, 75 ° C, en utilisant 20% de pipéridine dans du DMF + 0,1 M de HOBt. (iii) le couplage d'anhydride: 300 sec, 25 W, 75 ° C, en utilisant 10: 10: 1 d'anhydride / DIEA / DMAP dans du NMP. (iv) la déprotection Mtt: 3 * (300 sec, W 0, rt) en utilisant 1: 5: 94 de TFA / TIS / DCM. (v) La cyclisation: 300 sec, 25 W, 75 ° C, en utilisant 05:10 PyBOP / DIEA dans DBM. (vi) Le clivage et la déprotection: 3 h, W 0, rt, en utilisant 90: 2,5: 2,5: 5 TFA / TIS / H2 O / phénol. Les peptides ont été conjugués à un TAT 47-57 (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) transporteur peptide par une liaison amide dans le cadre de la synthèse en phase solide. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. MALDI-TOF spectrométrie de masse trace desquelette représentant du peptide cyclique. La masse observée, 2853.456 est en accord étroit à la masse calculée, 2,854,271. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. analytique inverse trace de HPLC en phase de la colonne vertébrale représentant peptide cyclique. Les traces de HPLC analytique du brut (A) et purifié (B) épine dorsale peptide cyclique sont présentées. Les systèmes de solvants utilisés étaient A (H 2 O avec 0,1% de TFA) et B (CH 3 CN avec 0,1% de TFA). Un gradient linéaire de 5-50% B à 1 ml / min à 15 min à 40 ° C avec un C18, 5 um, la colonne de 150 mm a été appliqué et la détection était à 215 nm. S'il vous plaît, cliquez icipour voir une version plus grande de cette figure.

Solution Réactif MW (g / mol) d (g / ml) Volume (ml) Concentration (M) Montant total
- Solution d'acides aminés - Acide aminé Alanine 311,34 0,2 6,23 g
0,2 M d'acide aminé dans du DMF DMF 100 100 ml
Un exemple pour l'acide aminé alanine, mais le même calcul doit être effectué pour chaque acide aminé, avec la MW approprié. Pour préparer une solution d'acide aminé 100 ml dissout 6,23 g de l'acide aminé alanine dans 100 ml de DMF. Conserver à 4 ° C.
- Solution de déprotection- HOBt 135,1 0,1 3,37 g
Solution v / v à 20% de pipéridine dans du DMF avec 0,1 M de HOBt Pipéridine 50 50 ml
DMF 200 200 ml
La déprotection est utilisé pour l'élimination des Fmoc N α - groupe protecteur. Pour préparer 250 ml d'une solution de déprotection se dissout 3,37 g de HOBt dans du DMF et 200 ml 50 ml d'ajouter la pipéridine. Conserver à 4 ° C.
- Solution de Activator - HBTU 379,24 0,45 18,96 g
0,45 M de HBTU dans le DMF DMF 100 100 ml
Activator estutilisée avec la base de l'activateur pour activer l'acide aminé avant la réaction de couplage. Pour préparer une solution d'activateur de 100 ml, dissoudre 18,96 g de HBTU dans 100 ml de DMF. Conserver à 4 ° C.
- Solution de base de Activator - DIEA 129.24 0,742 2 34,80 ml
2 M dans de la NMP DIEA NMP 65,20 ml
Base de l'activateur est utilisé avec l'activateur pour activer l'acide aminé avant la réaction de couplage. Pour préparer un 100 ml de base activateur mélange de solution 34,8 ml de DIEA et 65,2 ml de NMP. Conserver à 4 ° C.
Solution Réactif MW (g / mol) d (g / ml) Volume (ml) Eq Montant total
Solution d'anhydride - 10: 1: 10 anhydride / DMAP / DIEA dans NMP Glutarique / anhydride succinique 114.1 / 100.07 10 0,11 / 0,10 g
DMAP 122,2 1 0,01 g
DIEA 129.24 0,742 10 0,09 ml
NMP 5 5 ml
Dissoudre 0,11 / 0,10 g de l'acide glutarique / anhydride succinique dans 5 ml de NMP, ajouter 0,01 g de DMAP et 0,09 ml de DIEA à la solution. Préparer une solution fraîche.
Solution acide - 10: 1: 10 / acide DMAP / DIC dans le DMF Adipique / acide pimélique 146.14 / 160.17 10 0,15 / 0,16 g
DMAP </ td> 122,2 1 0,01 g
DIC 126,2 0,806 10 0,16 ml
DMF 5 5 ml
Dissoudre 0,15 / 0,16 g d'acide adipique / acide pimélique dans 5 ml de DMF, ajoute 0,01 g de DMAP et 0,16 ml de DIC à la solution. Préparer une solution fraîche.
La cyclisation de solution - 05:10 PyBOP / DIEA dans DBM PyBOP 520,3 5 0,26 g
DIEA 129.24 0,742 10 0,09 ml
DBM 5 ml 5 ml
Dissoudre 0,26 g de PyBOP dans 5 ml DBM et ajouter 0,09 ml de DIEA à la solution. Préparer unsolution fraîche.

Tableau 1. Réactifs et solutions pour le squelette cyclique synthèse peptidique. Liste des solutions et des réactifs pour la synthèse sont fournis.

Cycle de micro-ondes Puissance (Watts) Temp (° C) Temps (s)
1 Le couplage des acides aminés 25 75 300
2 La déprotection du groupe protecteur Fmoc (a) déprotection initiale 45 75 30
(b) la déprotection complète 45 75 180


Tableau 2. cycles de micro-ondes pour le couplage et la déprotection. Cycles de micro-ondes pourcouplage d'acides aminés et Fmoc-déprotection. (1) Le couplage d'acides aminés. (2) La déprotection du groupe Fmoc de masquage se fait en deux étapes: (a) de départ et (b) déprotection complète.

Problème Raison possible Solution
Des tests de Kaiser ou CHLORANILE sont positifs après le couplage de l'acide aminé Le couplage d'acides aminés est incomplète Répétez l'étape de couplage
Les peptides ne sont pas efficacement séparées du surnageant Excédent de TFA Évaporer l'échantillon à l'aide d'un courant d'azote
La présence de séquences de deletion dans le produit Élimination du Fmoc est incomplète Surveiller la déprotection par Kaiser ou CHLORANILE tests et / ou petite clivage à grande échelle, dans le cas où l'élimination de Fmoc est incomplète répétez l'étape
Amino coupl acideING est incomplète Surveiller le couplage par Kaiser ou CHLORANILE tests et / ou petite clivage à grande échelle, dans le cas où le couplage de l'acide aminé est incomplète répéter l'étape et / ou utiliser plus de temps de réaction

Tableau 3. Dépannage des conseils Liste des solutions aux défis synthétiques les plus courantes est fourni.

Peptide Séquence n MME. Californie MS Obs. HPLC rendement La viabilité du parasite
pL1 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 2 2854.321 2853.456 98% 86% 25%
pL2 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 3 2868.348 98% 87% 100%
PL3 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 4 2882.375 2881.823 96% 89% 97%
pL4 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 5 2896.402 2895.603 97% 85% 98%

Tableau 4. Caractérisation et bioactivité des peptides de la présente étude. N désigne le nombre de groupes méthylène dans l'entretoise d'alkyle (voir la figure 3 pour la structure). MS a été effectuée en utilisant la technique MALDI et la pureté a été déterminée par HPLC analytique. Les peptides ont été ajoutés à donovani promastigotes de Leishmania et la viabilité des parasites a été évaluée et exprimées en pour cent survie par rapport aux cultures témoins incubées en l'absence de peptide. Seulement pL1 avait une activité leishmanicide élevé. L'observateura été aveugle aux conditions expérimentales. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes.

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Discussion

La synthèse d'une bibliothèque focalisée du squelette des peptides cycliques dérivés de la protéine LACK du parasite Leishmania utilisant un synthétiseur à micro-ondes est décrit entièrement automatisé. Une bibliothèque de peptides cycliques ciblée a été développé avec pharmacophores conservées et divers linkers. L'addition de divers agents de liaison tels que l'anhydride glutarique, l'anhydride succinique, l'acide adipique, l'acide pimélique, la lysine, l'ornithine, et d'autres blocs de construction peuvent être utilisés pour augmenter la diversité de l'espace conformationnel des peptides cycliques. La synthèse d'une bibliothèque de peptides cycliques ciblée permet aux chercheurs de l'écran pour la espace conformationnel optimale. Etant donné que la conformation de peptides cycliques varie en fonction de paramètres tels que la taille et la position de l'anneau, divers analogues de différentes conformations peuvent être générés, ce qui peut être utile dans biologique relation structure-activité 88 Études.

Un défi majeur dans le diagnostic de la SPPS est Synthetic progrès et la résolution de problèmes puisque aucun intermédiaires sont isolés. Par conséquent, plusieurs tests colorimétriques peuvent être utilisés pour surveiller la réaction, telles que celles qui identifient amines libres par des tests de Kaiser et le chloranile. Si les tests de Kaiser ou CHLORANILE ne sont pas représentatifs (par exemple, la proline et hydroxy-proline ne réagissent pas avec la ninhydrine de la même manière que les autres acides aminés parce que leur groupe amino alpha fait partie d'un cycle à cinq), une réaction de clivage à petite échelle et l'analyse de spectrométrie de masse peut être appliqué pour contrôler les progrès de synthèse.

Le clivage et la durée cocktail de clivage peuvent être modifiées en fonction des propriétés chimiques, le nombre des groupes protecteurs utilisés. Il est recommandé qu'un clivage d'essai initiale en utilisant une petite quantité de résine (1-10 mg) être effectué pour vérifier les conditions appropriées. King et al. Ont testé différentes Les cocktails de clivage pour divers peptides et leurs lignes directrices détaillées peut être utilisé pour optimiser reaction 89 conditions. Pour backbone peptides cycliques, l'incubation pendant au moins 3 h est recommandé comme un défaut pour le plein clivage. Cependant, des peptides contenant un grand nombre de groupes protecteurs ou des groupes protecteurs difficiles (par exemple, l'ester de t-butyle ou pentaméthyl-2,3-dihydro-5-sulfonyl) doivent être mis en incubation pendant un temps plus long pour assurer la déprotection complète. Ici, nous ne sommes pas systématiquement étudié le temps de coupure optimale ou un cocktail. Néanmoins, nous avons trouvé que le temps clivage courte (moins de 2 heures) a entraîné un clivage incomplet de certains groupes protecteurs.

Le protocole de synthèse peptidique classique à micro-ondes est un procédé généralement applicable pour la synthèse d'une variété de peptides. Dans la plupart des cas, l'utilisation d'un synthétiseur automatique de micro-ondes permet de réduire la durée de synthèse et augmente le rendement et la pureté des produits. En outre, il diminue les réactions secondaires telles que la racémisation et la formation aspartimide. Bien que nous ayons pas faitune comparaison côte à côte des micro-ondes et classique en synthèse de cette étude, sur la base de notre et l'expérience de d'autres laboratoires, il a été montré que l'utilisation de la synthèse assistée par micro-ondes est supérieure à la classique 61,70 protocole. Presque tous les activateurs et les résines peuvent être efficacement utilisés dans des micro-ondes et SPPS le procédé général peuvent également être appliquées à la synthèse d'une variété de peptides modifiés, tels que les glycopeptides, phosphopeptides, azapeptides, peptoïdes, et des peptides cycliques 90.

La cyclisation est un moyen pratique pour améliorer la puissance et de la stabilité des précurseurs linéaires. Peptides cycliques peuvent obtenir une conformation contrainte souhaitable qui peut contribuer à l'augmentation de l'affinité de liaison et la sélectivité. En outre, les peptides linéaires peuvent être modifiés pour contenir de multiples boucles cycliques, leur permettant de cibler éventuellement plusieurs interfaces de liaison aux protéines endogènes 91. Cependant, il est important de noter que la cyclisation ne nécessprincipalem conduire à des améliorations dans tout ou parfois une de ces propriétés. Certains peptides cycliques peuvent entraîner des conformations qui ne sont pas reconnus par des récepteurs ciblés (par exemple 92,93) .Par conséquent, une bibliothèque de peptides cycliques ciblée est nécessaire d'écran pour la bioactivité. En conclusion, les peptides cycliques synthétiques présentent des caractéristiques pharmacologiques désirables, sont assez petits pour traverser la membrane cellulaire, et sont assez grands pour avoir une haute sélectivité. Haute puissance, la spécificité et le profil sécurité contribuent à la promesse de peptides cycliques comme candidats-médicaments.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang, et Daria Mochly-Rosen pour des discussions utiles. Le travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé NIH Grant RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) pour NQ Les bailleurs de fonds ne jouaient aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic.
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials - micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
Nitrogen cylinder
Desiccator
Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).
Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).

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Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).

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