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Chemistry

सीएन GELFrEE - साफ़ देशी जेल-eluted तरल अंश फंसाने वैद्युतकणसंचलन

doi: 10.3791/53597 Published: February 29, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

प्रोटीन परिसरों महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों की एक सरणी प्रदर्शन करते हैं। उनकी गैर सहसंयोजक बातचीत और गतिशीलता elucidating जैविक प्रणालियों में परिसरों की भूमिका को समझने के लिए सर्वोपरि है। biomolecular विधानसभाओं के प्रत्यक्ष लक्षण वर्णन हाल के वर्षों में तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है, मूल निवासी विभाजन तकनीक है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित बहाव के विश्लेषण तकनीक के साथ संगत कर रहे हैं, आगे इन अध्ययनों का विस्तार करने के लिए आवश्यक हैं। फिर भी, क्षेत्र एक उच्च throughput, व्यापक रेंज, उच्च वसूली जुदाई मूल निवासी प्रोटीन विधानसभाओं के लिए विधि का अभाव है। यहाँ, हम स्पष्ट देशी जेल-eluted तरल अंश फंसाने वैद्युतकणसंचलन (सीएन GELFrEE) है, जो गैर-सहसंयोजक प्रोटीन विधानसभाओं के लिए एक उपन्यास जुदाई साधन है प्रस्तुत करते हैं। सीएन GELFrEE जुदाई प्रदर्शन माउस दिल से निकाला fractionating परिसरों द्वारा प्रदर्शन किया गया। भिन्न 2 घंटा से अधिक एकत्र और असतत ~ 30 से 500 केडीए को लेकर बैंड प्रदर्शित किए गए। एक चोरआणविक वजन बैंडविड्थ बढ़ाने की sistent पैटर्न मनाया गया, प्रत्येक लेकर ~ 100 केडीए। इसके अलावा, एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से मूल निवासी अंशों के बाद के पुनर्विश्लेषण आणविक वजन प्रोटीन परिसरों का विकृतीकरण के साथ लगातार बदलाव से पता चला है। इसलिए, सीएन GELFrEE, एक बड़ी आणविक वजन सीमा से प्रोटीन परिसरों पर उच्च संकल्प और उच्च वसूली मूल निवासी विभाजन प्रदर्शन करने की क्षमता की पेशकश करने अंशों कि बहाव प्रोटीन का विश्लेषण करती है के साथ संगत कर रहे हैं प्रदान कर साबित कर दिया था।

Introduction

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एक कोशिका के भीतर हो रहा जैविक प्रक्रियाओं के बहुमत के एक प्रोटीन 1 प्रोटीन विधानसभाओं के बजाय द्वारा किया जा करने के लिए लगा रहे हैं। नतीजतन, क्रम में एक सेल में एक प्रोटीन सबयूनिट के विशिष्ट जैविक भूमिका को स्पष्ट करने के लिए यह परिसरों में 2 अन्य प्रोटीन या ligands के साथ अपनी संरचनात्मक बातचीत को समझने के लिए आवश्यक है। हालांकि, प्रोटीन natively का अध्ययन, उनके गैर सहसंयोजक बातचीत और गतिविधि को बनाए रखने, चुनौती बनी हुई है। मूल निवासी प्रोटीन के अध्ययन की कमियों में से एक एक उपयुक्त मूल निवासी जुदाई तकनीक है कि विभिन्न डाउनस्ट्रीम प्रोटीन विश्लेषण तकनीक के साथ संगत है। इसलिए, जुदाई biomolecules के गैर-सहसंयोजक विधानसभाओं निस्र्पक में सक्षम तकनीक में हाल ही में ब्याज तेजी से 3 बढ़ गई है।

प्रोटीन जुदाई तकनीक जैव रसायन, बायोफिज़िक्स और विभिन्न अन्य अध्ययन के लिए जरूरी हैं। वर्तमान मूल निवासी जुदाई तकनीक intrinsi हैसी कमी है कि इस तरह के कम संकल्प, कम throughput, वर्षा के लिए हानि, और प्रारंभिक नमूना की बड़ी मात्रा की आवश्यकता के रूप में नीचे की ओर विश्लेषण, साथ अनुकूलता को कम। मिलकर आत्मीयता शुद्धि सामान्यतः प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह प्रत्येक प्रोटीन लक्ष्य के लिए अलग से बाहर ले जाने के लिए यह उच्च throughput विश्लेषण 4 के साथ असंगत होने के कारण है। आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी 5, आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी 5 और घनत्व-ढाल जुदाई 6 सभी देशी विभाजन प्रदान की है, लेकिन स्वाभाविक कम संकल्प तकनीक रहे हैं और उच्च प्रारंभिक नमूना मात्रा की आवश्यकता के साथ चयनात्मक वर्षा।

वैकल्पिक रूप से, इस तरह के मूल निवासी ब्लू (बी एन) और साफ़ मूल निवासी (सीएन) पेज के रूप में जेल आधारित तकनीक, (या तो 1-डी या 2 डी), उच्च संकल्प जुदाई प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, के साथ अन्य तकनीकों का उल्लेख विषम, दोनों देशी पृष्ठ विभाजन घुलनशीलता और एक व्यापक आर के मूल निवासी रचना को बनाए रखने केहाइड्रोफोबिक प्रोटीन सहित macromolecule प्रजातियों की Ange। यह क्षमता आगे proteome कवरेज इन तरीकों 7.8 से पहुंचा broadens और सीएन और बी एन-पृष्ठ के बीच अलग-अलग रसायन विज्ञान के माध्यम से हासिल की है। सीएन पृष्ठ आमतौर पर वाहक अणुओं के रूप में मुलायम का आरोप लगाया डिटर्जेंट, बीएन पृष्ठ में Coomassie ब्लू डाई की जगह पर निर्भर करता है। बीएन पृष्ठ, हालांकि उच्च संकल्प के साथ जुड़े, इस तरह के अलग प्रोटीन 8 और Coomassie अणु अभिवर्तन गठन में कम enzymatic गतिविधि, बाद में काफी नीचे की ओर एमएस के प्रतिकूल होने के नाते विश्लेषण 9 के रूप में निरंतर है। इन दोनों विधियों, हालांकि, पारंपरिक रूप से कम वसूली और धुंधला हो जाना और जेल निकालना सीमाओं 7 के कारण संकीर्ण proteome कवरेज के साथ जुड़े रहे हैं।

विकृत प्रोटीन के अध्ययन के लिए, वहाँ कई तकनीकों है कि macromolecule घुलनशीलता बनाए रखने, जबकि उच्च प्रोटीन वसूली के साथ उच्च संकल्प विभाजन प्रदर्शन कर रहे हैं और कहा कि डी के साथ संगत कर रहे हैंपोस्ट-जुदाई प्रोटीन विश्लेषण तकनीक iverse। जेल eluted तरल अंश फंसाने इलेक्ट्रोफ़ोरेसिस (GELFrEE) विभाजन तकनीक है कि इन सभी विशेषताओं फिट में से एक है। इस विधि को काफी हद तक उच्च throughput ऊपर से नीचे प्रोटिओमिक्स अध्ययन में लागू किया जाता है, यह दर्शाता है कि यह तेजी से और बहुमुखी है। GELFrEE, प्रोटीन विकृत कर रहे हैं और एक ट्यूबलर जेल मैट्रिक्स के माध्यम से आणविक वजन के आधार पर अलग हो गए, जिनमें से porosity नमूना आवश्यकताओं और वांछित परिणाम के आधार पर विभाजन अलग किया जा सकता है। भिन्न तरल चरण में eluted हैं, इस प्रकार है, जबकि उच्च संकल्प को बनाए रखने के एसडीएस पृष्ठ के साथ जुड़े वसूली सीमाओं को कम करने। अंश aliquots तो आणविक वजन बैंडविड्थ चयन 11 के लिए 1-डी पृष्ठ से विश्लेषण किया जा सकता है। वहाँ के मूल निवासी जुदाई तकनीक में GELFrEE से जुड़े फायदे के लिए उच्च मांग है। विधि यहाँ बताया, साफ़ मूल निवासी GELFrEE (सीएन-GELFrEE), GELFrEE के एक निवासी रूपांतर है। आदेश में एक व्यापक एस के साथ संगत होना करने के लिएउनके पैतृक राज्य में बड़े अणुओं की pectrum, इस विधि से न केवल मुलायम सीएन पृष्ठ रसायन विज्ञान पर, लेकिन यह भी एक porosity ढाल जुदाई, जो असंतत जेल सिस्टम 9 में मौजूद porosities के बीच कठोर संक्रमण को नष्ट करने से प्रोटीन वर्षा कम कर देता है पर निर्भर करता है। जब माउस दिल से निकाले गए प्रोटीन परिसरों fractionate के लिए आवेदन किया, eluted अंशों उच्च वसूली और आणविक वजन की एक विस्तृत श्रृंखला के एक उच्च संकल्प जुदाई प्राप्त हुई थी दिखाया गया है। इसके अलावा, जिसके परिणामस्वरूप अंशों सबसे नीचे की ओर जैव रासायनिक और biophysical प्रोटीन का विश्लेषण करती है के साथ संगत कर रहे हैं।

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Protocol

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नोट: यह वीडियो प्रोटोकॉल एक संबद्ध प्रकाशन 9 पर आधारित है। विशिष्ट अभिकर्मकों, सामग्री और उपकरणों के लिए सभी कदम इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक सामग्री अनुभाग में सूचीबद्ध हैं। व्यंजनों और सभी आवश्यक समाधान की तैयारी के लिए जानकारी तालिका 1 में अलग अलग रखा जाता है।

1. ढाल ट्यूब जैल की घनघोर

  1. कास्टिंग प्रणाली कोडांतरण
    1. एक लौ गर्म धार या छुरी का प्रयोग, वितरण टिप के ऊपर से 10 सेमी एक orthogonal वर्ग के साथ एक 20 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट काटा। सुनिश्चित करें कि कटौती की सतह चिकनी है। (टिप) के साथ नीचे टुकड़ा रखें और शीर्ष टुकड़ा त्यागें। नीचे पिपेट एक समर्थन खड़ा करने के लिए खड़ी (शंक्वाकार टिप नीचे का सामना करना पड़) टुकड़ा दबाना।
      चेतावनी: गर्म ब्लेड धातु मत छुओ, उचित संभालती है या एक plier का उपयोग जलता से बचने के लिए।
    2. लचीला ट्यूबिंग के 3 सेमी कट और कटौती pipet के लिए यह इस पर खींच द्वारा कनेक्टवितरण टिप। ट्यूब के दूसरे छोर पर प्रवाह नियंत्रण वाल्व कनेक्ट करें।
    3. ट्यूबिंग के एक टुकड़े का उपयोग ढाल मिक्सर का वितरण टिप करने के लिए वाल्व के नीचे लिंक। वाल्व खुला रखें।
    4. एक चुंबकीय उत्तेजक के शीर्ष पर ढाल मिक्सर सेट करें। मिश्रण कक्षों के अंदर चुंबकीय सलाखों रखें।
    5. ढाल मिक्सर के लिए जेल गंभीरता से डाला जा करने के लिए 5-10 सेमी पिपेट टुकड़ा के शीर्ष से अधिक की अनुमति देने के लिए वितरण टिप स्थिति।
    6. विआयनीकृत पानी के साथ लीक के लिए प्रणाली का परीक्षण करें। कोई लीक पाए जाते हैं, तो आगे बढ़ने से पहले इसके अंदर हवा बह द्वारा प्रणाली सूखी।
    7. टेप के दो या अधिक परतों के साथ पिपेट टुकड़ा के ऊपर कवर। परिपत्र उद्घाटन के केंद्र में टेप परतों के माध्यम से एक छेद पंचर। सुनिश्चित करें कि पंचर काफी बड़े ग्लास ट्यूब के माध्यम से कसकर पारित करने के लिए है।
    8. ग्लास ट्यूब, जहां जेल, डाली जाएगी पंक्चर्ड छेद के माध्यम से, टेप खींच तो कांच कसकर फिट बैठता स्लाइड। मैंग्लास ट्यूब nsert इतना है कि ट्यूब के नीचे पिपेट नीचे से ऊपर 2 मिमी है।
    9. यदि ग्लास ट्यूब आयोजित किया जाता है और केंद्रीकृत और छू नहीं है पिपेट दीवार एक बार सिस्टम तैयार किया जाता है देखने के लिए जाँच करें। प्रणाली अब ढलाई के लिए तैयार है।
  2. कास्टिंग जेल
    1. जेल बफर, ए पी एस और Coomassie समाधान (समाधान 1-3, 1 टेबल) तैयार करें।
    2. 12% टी (समाधान 4, 1 टेबल) और 1% टी (समाधान 5, 1 टेबल) जेल समाधान को अलग करने को तैयार है। 12% टी अलग जेल समाधान में Coomassie समाधान के 10 μl जोड़ें। ए पी एस और दोनों के समाधान में TEMED तुरंत ढाल मिक्सर में गिरने से पहले जोड़े।
      चेतावनी: polyacrylamide अत्यधिक न्यूरोटोक्सिक है और दस्ताने पहना जाना चाहिए।
    3. यकीन ढाल मिक्सर का वितरण वाल्व बंद कर दिया जाता है सुनिश्चित करें। 12% टी वितरण सिरे से सब से अधिक दूर करने के लिए मिश्रण कक्ष जेल समाधान को अलग जोड़ें। दोनों कक्षों के बीच वाल्व खोलने के लिए और समाधान प्रवाह मैं ऐसाअगले चैम्बर Nto।
    4. वाल्व बंद करो और हड्डी उखड़ 12% टी अलग जेल समाधान पिछले चैम्बर के लिए वापस विंदुक। इस कक्षों के बीच हवा के बुलबुले से बचने के लिए किया जाता है।
    5. 1% टी मिश्रण कक्ष वितरण टिप करने के लिए करीब के लिए जेल समाधान को अलग जोड़ें। चुंबकीय उत्तेजक चालू करें।
    6. एक ही समय में दोनों ओपन ढाल मिक्सर वाल्व को अलग जेल समाधान मिलाया जा करने के लिए और पिपेट और ग्लास ट्यूब में प्रवाह करने की अनुमति है।
    7. एक बार मिक्सर में ढाल को अलग जेल समाधान समाप्त हो रहे हैं, एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के लिए मिक्सर और यह जोड़ी से ट्यूबिंग uncouple। यकीन है कि जब तक सिरिंज मजबूती से जुड़ा हुआ है ट्यूब के अंत पिपेट में तरल के स्तर से ऊपर रहता है।
    8. सिरिंज का प्रयोग धीरे पिपेट और ग्लास ट्यूब में ट्यूबिंग से शेष को अलग जेल समाधान करने के लिए धक्का। इसे में हवा के बुलबुले अनुमति देने से पहले पिपेट वाल्व बंद करें।
    9. धीरे पानी से संतृप्त BUTANO के लगभग 0.25 मिलीलीटर की एक परत जोड़नेग्लास ट्यूब के अंदर जेल समाधान के शीर्ष पर एल (समाधान 6, 1 टेबल) हवा में ऑक्सीजन से polymerization प्रतिक्रिया सील करने के लिए और शीर्ष meniscus समतल करने के लिए।
    10. विआयनीकृत पानी (डिटर्जेंट का उपयोग नहीं करते हैं) के साथ तुरंत डालने का कार्य तंत्र को साफ करें।
    11. कमरे के तापमान पर पूरा जेल polymerization के लिए रात भर प्रतीक्षा करें।
  3. डिवाइस और संग्रहीत करने से detaching जेल ट्यूब
    1. अगले दिन, ध्यान से डिवाइस के ऊपर से टेप छील।
    2. पिपेट तहत ट्यूबिंग से वाल्व डिस्कनेक्ट। दबाना से पिपेट रिलीज और कदम 1.3.3 प्रदर्शन करते हैं। और 1.3.4। एक सिंक पर।
    3. युगल एक 10 मिलीलीटर लचीला टयूबिंग के लिए विआयनीकृत पानी से भर सिरिंज। पिपेट में टयूबिंग के माध्यम से पानी धक्का, धीरे धीरे पिपेट से बाहर polymerized जेल फिसलने।
    4. पिपेट क्षैतिज पकड़ो और ध्यान से जेल खुले अंत के बाहर फिसलने सुरक्षित।
    5. नीचे और एआरओ अतिरिक्त polyacrylamide कटएक रेजर ब्लेड का उपयोग ग्लास ट्यूब und। , ट्यूब के भीतर जेल पर एक चिकनी अंत बनाने के लिए यह ग्लास ट्यूब की नोक से भरा बनाकर सुनिश्चित करें।
    6. जेल के ऊपर की ओर से किसी भी शेष butanol बांटना और एक नवोदित 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में जेल ट्यूब निर्धारित किया है। 4.5 मिलीलीटर अति शुद्ध पानी के साथ 0.5 मिलीलीटर जेल बफर (समाधान 1, 1 टेबल) मिक्स और जेल ट्यूब के दोनों ऊपर की ओर (ग्लास ट्यूब के भीतर) का हल और नीचे की ओर (अपकेंद्रित्र ट्यूब में) के बारे में 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. बफर वाष्पीकरण को रोकने के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब से भरा ऊपर की ओर, ग्लास ट्यूब खोलने सहित कवर, parafilm के साथ। जैल के बारे में 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

2. नमूना तैयार

  1. दो दिलों माउस वजन और उन्हें एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर एक पेट्री डिश में कीमा।
  2. एक मोर्टार के लिए कार्रवाई की ऊतक जोड़ें और नमूना कवर करने के लिए पर्याप्त तरल नाइट्रोजन जोड़ें। एक पैर के साथ ऊतक घोटना, और अधिक जोड़नेतरल नाइट्रोजन जब यह evaporates।
  3. एक बार ऊतक को अच्छी तरह से जमीन है, नाइट्रोजन लुप्त हो जाना और ऊतकों के हर 100 मिलीग्राम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर (समाधान 7, 1 टेबल) lysis बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में समाधान ले जाएँ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र। ध्यान से एक नया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने और गोली त्यागें। सतह पर तैरनेवाला में प्रोटीन एकाग्रता bicinchoninic एसिड विधि का उपयोग कर 12 यों, या पसंदीदा के रूप में। नोट: मूल सेल lysates या subcellular भिन्न के रूप में पसंद कर तैयार किया जा सकता है। सीएन GELFrEE विभिन्न विभिन्न देशी नमूना तैयारी के साथ संगत है।
  5. Solubilization बफर समाधान और लदान समाधान (समाधान 8 और 9, 1 टेबल) तैयार करें।
  6. नमूना एक गोली है, तो solubilization बफर के 50-150 μl में यह resuspend। 15 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना रखें।
  7. बफर resuspended नमूना या solubilizat साथ सेल lysate का आदान-प्रदानआयन बफर एक 30 केडीए-MWCO अल्ट्रा केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग कर।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन नमूना और 5-10 मिनट के लिए या जब तक बनाए रखा अंश मात्रा लगभग 20 μl के लिए नीचे है 10,000 XG अपकेंद्रित्र। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  9. बरकरार रखा अंश के लिए solubilization बफर के 400 μl जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र और 5-10 मिनट के लिए या जब तक बनाए रखा अंश लगभग 20 μl के लिए नीचे है 10,000 XG। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  10. दोहराएँ कदम 2.9 दो अतिरिक्त समय।
  11. solubilization बफर के 100 μl में छान नमूना (लगभग 20 μl) पतला।
  12. नमूने के लिए समाधान लोडिंग के 20 μl जोड़ें।

3. सीएन GELFrEE डिवाइस

  1. सीएन GELFrEE विभाजन को करने के लिए एक मशीन की दुकान का हवाला देते हुए डिवाइस भागों का निर्माण। निर्माण Teflon में डिवाइस भागों। सभी जानकारी आवश्यक भागों और टी का निर्माण करने के लिए 1 चित्रा को देखेंएक डिवाइस के लिए आवश्यक भागों की संख्या के लिए ओ 2 टेबल।
    सुरक्षा कारणों: पहनने उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण। जॉब उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति के आसपास लिया जाना चाहिए, और सभी जंक्शनों को सही ढंग से रखा जाना चाहिए। डिवाइस या किसी आसन्न गीला क्षेत्र स्पर्श करते हुए वोल्टेज पर है और वैद्युतकणसंचलन के दौरान आसपास के क्षेत्र की सूखी बेंच बनाए रखने नहीं है। इसके अलावा, बिजली की आपूर्ति पूरी तरह से जब डिवाइस से निपटने और / या भिन्न एकत्रित बंद कर दिया जाना चाहिए।
  2. एनोड और कैथोड बफर बफर (समाधान 10-11, 1 टेबल) तैयार करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर या बर्फ में रहते हैं।
  3. एक "सैंडविच" फैशन में एक स्पेसर, एक हे अंगूठी और एक दूसरे स्पेसर के माध्यम से जेल ट्यूब (जेल के बिना अंत) के शीर्ष के अंत फ़िट।
  4. दूसरी स्पेसर के बाद बफर चैम्बर (कैथोड) जोड़ें, ओर छेद के माध्यम से पूरी तरह से शिकंजा गुजरती हैं, दोनों पक्षों के लिए जोड़ सकते हैं और नट कस लें। सुनिश्चित करें कि glas के शीर्ष के अंतएस ट्यूब तय हो गई है बफर चैम्बर के शीर्ष एपर्चर से पहले, इसके तहत या यह अतीत सीधे नहीं।
  5. एक स्पेसर, एक हे अंगूठी, संग्रह कक्ष, और एक दूसरे स्पेसर के माध्यम से जेल ट्यूब के नीचे अंत फिट बैठते हैं।
  6. दूसरी स्पेसर के बाद बफर चैम्बर (एनोड) जोड़ें, ओर छेद के माध्यम से पूरी तरह से शिकंजा गुजरती हैं, दोनों पक्षों के लिए जोड़ सकते हैं और नट कस लें। सुनिश्चित करें कि जेल ट्यूब के नीचे अंत अतीत बफर चैम्बर के शीर्ष एपर्चर तय हो गई है, लेकिन करीब पीछे की दीवार को छू नहीं।
  7. कैथोड बफर चैम्बर ऊपर की तरफ clamps के साथ एक समर्थन स्टैंड का उपयोग के साथ खड़ी सीएन GELFrEE डिवाइस सेट करें।
  8. एनोड बफर चैम्बर (नीचे) और कैथोड बफर चैम्बर (ऊपर) के लिए कैथोड बफर करने के लिए एनोड बफर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी बफ़र्स रखें।
  9. धीरे ग्लास ट्यूब दोहन से ग्लास ट्यूब के अंदर से हवा के बुलबुले निकालें और रिसाव के लिए प्रणाली की जाँच करें।
  10. सुनिश्चित करें कि प्लैटिनम इलेक्ट्रोड कक्षों में और दोनों कि buffers के साथ संपर्क में हैंजेल ट्यूब समाप्त होता है प्रत्येक कक्ष के भीतर बफर में डूब रहे हैं।
  11. एनोड बफर चैम्बर (नीचे) पर कैथोड बफर चैम्बर (ऊपर) पर नकारात्मक और सकारात्मक: संबंधित केले प्लग करने के लिए बिजली की आपूर्ति से बिजली तार कनेक्ट करें।
  12. नमूना एक जेल लोड टिप का उपयोग कर जेल की सतह शीर्ष पर, जेल ट्यूब के अंदर लोड।
  13. 1 डब्ल्यू निरंतर में जेल चला, overheating से बचने के लिए, जब तक लाल डाई सामने जेल ट्यूब के नीचे है।
    चेतावनी: जारी रखने से पहले बिजली की आपूर्ति बंद कर दें।
  14. एनोड और कैथोड बफ़र्स त्यागें।
  15. एनोड बफर चैंबर द्वारा पागल Untighten और नीचे स्पेसर और कक्ष जुदा, एक स्पेसर और हे अंगूठी को बनाए रखने। संग्रह कक्ष के अंदर जेल ट्यूब के नीचे अंत प्लेस, शीर्ष एपर्चर, अतीत या सीधे इसके तहत पहले नहीं। स्पेसर और संग्रह कक्ष के करीब हे अंगूठी पुश।
  16. सेल्यूलोज डायलिसिस झिल्ली का एक टुकड़ा काट और एनोड बफर में immerging द्वारा यह rehydrate। एपी कवरसंग्रह कक्ष और नीचे स्पेसर डायलिसिस झिल्ली का उपयोग कर के बीच erture।
  17. , दूसरी स्पेसर के बाद एनोड बफर चैम्बर इकट्ठा जोड़ सकते हैं और शिकंजा और बोल्ट कस लें।
  18. एक बर्फ बाल्टी भर में क्षैतिज डिवाइस निर्धारित करना। बफर कक्षों के लिए ताजा एनोड और कैथोड बफ़र्स जोड़ें और रिसाव के लिए प्रणाली की जाँच करें।
  19. संग्रह कक्ष में एनोड बफर के 150 μl जोड़ें। संबंधित केले प्लग करने के लिए बिजली तार जोड़ने।
  20. 3 मा निरंतर वर्तमान में बिजली की आपूर्ति चालू करें। डाई सामने तो संग्रह कक्ष में बफर में elute शुरू कर देना चाहिए।
  21. जब पूरे डाई सामने eluted है, बिजली की आपूर्ति बंद कर देते हैं और पहली अंश (0 मिनट) जमा है, एक कम प्रोटीन बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरित।
  22. फिर से भरना एनोड बफर के 150 μl के साथ संग्रह कक्ष। बर्फ पर सभी एकत्र भिन्न रखें।
  23. के संग्रह से निम्नलिखित समय के अंतराल के बाद अंशों लीजिएपहला अंश: 2 मिनट, 4 मिनट, 6 मिनट, 8 मिनट, 10 मिनट, 15 मिनट, 20 मिनट, 25 मिनट, 30 मिनट, 45 मिनट और 60 मिनट। समय के लिए खाते हैं, जबकि बिजली की आपूर्ति बंद है क्या नहीं। भूलना मत अंशों इकट्ठा करने से पहले बिजली की आपूर्ति बंद करने के लिए और नमूनों के बीच एनोड बफर के 150 μl के साथ संग्रह कक्ष फिर से भरना। संग्रह के बाद फिर से चालू बिजली की आपूर्ति अगले अंश एल्यूटिंग शुरू करने के लिए।
  24. एनोड और कैथोड बफ़र्स बांटना और 60 मिनट के बाद बफर कक्षों के लिए ताजा समाधान जोड़ें। 90 मिनट और 120 मिनट पर अंशों लीजिए।
  25. एनोड और कैथोड बफ़र्स हर एक घंटे में बदलें।
  26. एक स्पष्ट देशी या भागों के साथ एक नीले रंग की मूल निवासी पृष्ठ को चलाने और यह दाग के रूप में प्राथमिकता दी। निर्माता के निर्देशों या पसंदीदा प्रोटोकॉल का पालन करें।
  27. एक कम करने एसडीएस पृष्ठ चलाने और यह दाग के रूप में प्राथमिकता दी। निर्माता के निर्देशों या पसंदीदा प्रोटोकॉल का पालन करें।
  28. साफ GELFrEE अंशों और देशी मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्रस्तुत जनसंपर्क के रूप में वर्णित विश्लेषण करती हैeviously 9।

आकृति 1
चित्रा 1:। सीएन GELFrEE डिवाइस (ए) GELFrEE डिवाइस भागों चित्र और (बी) निर्मित भागों की तस्वीर; (सी) सीएन GELFrEE विधानसभा डिवाइस योजना: (1) बफर चैम्बर, (2) स्पेसर, (3) हे अंगूठी, (4) जेल ट्यूब, (5) संग्रह कक्ष, और (6) डायलिसिस झिल्ली।

तालिका एक
तालिका 1: समाधान की तालिका।

सारणी 2
तालिका 2: GELFrEE डिवाइस भागों की तालिका।

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Representative Results

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cryogenically जमीन माउस दिल से निकाले गए प्रोटीन की 200 माइक्रोग्राम प्रति 150 μl प्रत्येक के 14 भागों में natively fractionated थे, एक 1-12% टी जेल ट्यूब में सीएन GELFrEE विधि का उपयोग। प्रत्येक अंश के 10 μl के एक विभाज्य एक सीएन पृष्ठ स्लैब जेल और चांदी दाग ​​पर चलाया गया था। विभाजन और संकल्प सीएन GELFrEE विभाजन के साथ प्राप्त की एक स्पष्ट चित्रण चित्रा 2A में दिखाया गया है। भिन्न दो घंटे से अधिक एकत्र किए गए थे और जेल परख आणविक ~ 30 से 500 केडीए से लेकर वजन में वृद्धि का एक सुसंगत पैटर्न से पता चलता है। प्रत्येक अंश ~ 100 केडीए से अधिक मास में लेकर प्रजातियों में शामिल है। भिन्न आणविक वजन पर्वतमाला है कि तेजी से कम हो जाता है और अधिक संग्रह के अंशों के बीच होने के रूप में की एक कम ओवरलैप प्रदर्शित करते हैं। सीएन पृष्ठ स्लैब यहाँ दिखाया गया जेल प्रोटीन प्रत्येक 150 μl अंश से बरामद की केवल 6% का प्रतिनिधित्व करता है।

Fract के प्रत्येकआयनों natively eluted सीएन GELFrEE से बाद में कम कर सकते हैं और उन्हें एक एसडीएस पृष्ठ स्लैब जेल पर चलने से पहले विकृत कर रहे थे। को कम करने एसडीएस पृष्ठ स्लैब जेल (चित्रा 2 बी) में, यह सब भागों में बड़े पैमाने पर बदलाव के देखने के लिए जब संबंधित मूल निवासी भिन्न (2A चित्रा) की तुलना में यह दर्शाता है कि बरकरार प्रोटीन परिसरों disassembled किया गया और डाइसल्फ़ाइड पुलों कम हो गई थी संभव है।

चित्र 2
चित्रा 2:। माउस दिल क्रायोजेनिक पीस निकालने की सीएन GELFrEE जुदाई (ए) साफ़ मूल निवासी समय अंतराल 0 120 मिनट के लिए कम से एकत्र सीएन GELFrEE अंशों की पृष्ठ। वाम: मूल आणविक वजन सीढ़ी। (बी) ए वाम के रूप में ही अंशों की एसडीएस पृष्ठ को कम करना: कम और विकृत आणविक वजन सीढ़ी।

भागों तो साफ है और submitt जा सकती हैमूल निवासी मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एड 9 विश्लेषण करती है। Homodimeric Malate डिहाइड्रोजनेज, GELFrEE अंशों में से कुछ में पहचान के मूल निवासी एमएस स्पेक्ट्रम, 16+ और 20 + और ​​72843 दा (चित्रा 3 ए) के एक आणविक जन के बीच एक प्रभारी वितरण से पता चलता। 18+ आरोप राज्य अलग किया गया था और, collisionally सक्रिय 36,421.7 (चित्रा 3 बी) के एक आणविक जन के साथ monomeric Malate डिहाइड्रोजनेज के इंजेक्शन में जिसके परिणामस्वरूप। स्रोत सक्रियण आदेश मोनोमर इंजेक्शन, अलगाव की अनुमति और monomers के आगे विखंडन के लिए प्रेरित करने में बरकरार जटिल करने के लिए लागू किया गया था। 11 + मोनोमर के विखंडन नक्शा चित्रा -3 सी में मनाया जा सकता है। सीएन GELFrEE मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ, का विश्लेषण करती है macromolecular विधानसभाओं के noncovalent प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का कोई व्यवधान दिखा संगत होना सिद्ध किया गया था।

चित्र तीन चित्रा 3: homodimer Malate डिहाइड्रोजनेज की जन स्पेक्ट्रा और विखंडन नक्शा (ए) बरकरार परिसर के MS1 स्पेक्ट्रम, (बी) MS2 स्पेक्ट्रम प्रदर्शन मोनोमर परिसर से निकली, और (सी) एक विखंडन नक्शा मोनोमर के विखंडन से प्राप्त की। । लाल एन इंगित करता है कि एन टर्मिनल acetylated है।

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Discussion

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सीएन GELFrEE स्पष्ट मूल निवासी (सीएन) पृष्ठ बफर सिस्टम एक जेल मैट्रिक्स के माध्यम से आणविक वजन आधारित प्रोटीन विभाजन के लिए वाहक अणुओं 9 के रूप में ऋणात्मक और तटस्थ डिटर्जेंट का एक मिश्रण का उपयोग करता है से ली गई है। एक देशी माउस दिल प्रोटीन निकालने के लिए सीएन GELFrEE के आवेदन असतत बैंडविड्थ biomolecular विधानसभाओं के गैर सहसंयोजक बातचीत को बनाए रखते हुए साथ कम जटिलता अंशों उत्पन्न। सीएन पृष्ठ और कम करने एसडीएस पृष्ठ स्लैब जैल के बीच अंशों की तुलना में बड़े पैमाने पर बदलाव है कि भागों में बड़े अणुओं और प्रोटीन श्रृंखला के बीच डाइसल्फ़ाइड बांड का टूटना के बीच गैर सहसंयोजक बातचीत के नुकसान का प्रदर्शन दिखाया। परिणाम सीएन GELFrEE जुदाई के मूल चरित्र की पुष्टि करें।

इस प्रोटोकॉल में कुछ कदम महत्वपूर्ण हैं और इस प्रकार अधिक ध्यान वारंट। सबसे पहले, कास्टिंग के बाद, जेल ट्यूब धीरे धीरे डिवाइस और बाहरी polyacrylamide ध्यान में कटौती से अलग किया जाना चाहिए। ऐसा करने में विफलताइसलिए जेल नुकसान पहुंचा सकता है, जाल के भीतर हवा के बुलबुले के कारण या ग्लास ट्यूब से जेल detaching। ये नुकसान जुदाई संकल्प क्षीण और अच्छी तरह से बचा जाना चाहिए। दूसरे, वैद्युतकणसंचलन के दौरान बिजली व्यवस्था का प्रतिरोध अतिरिक्त समय में वृद्धि होगी, गर्मी पैदा करने, इस प्रकार यह या तो एक ठंड चैम्बर में प्रक्रिया का प्रदर्शन या एक बर्फ बाल्टी के लिए इस उपकरण को स्थानांतरित करने के बाद नमूना में लोड किया गया है के लिए बहुत महत्वपूर्ण है जेल, क्रम में गर्मी से भरी हुई प्रोटीन denature के लिए नहीं। इसके अलावा, यह तकनीक के कुछ प्रमुख सीमाओं जब मन में वर्णित प्रोटोकॉल प्रदर्शन जरूरी है। उच्च प्रोटीन लोड सीएन GELFrEE संकल्प को कम कर सकते हैं। अधिक भार विशेष रूप से नमूने जहां कुछ प्रजातियों अधिक प्रचुर मात्रा में कर रहे हैं, उन प्रोटीन प्रजातियों का कारण लगातार अंशों के एक नंबर के माध्यम से eluted किया जाना है। माउस cryogenically जमीन नमूने के लिए, सबसे अच्छा परिणाम 200 और 400 माइक्रोग्राम के बीच मात्रा के साथ देखा गया था, लेकिन इस व्यवहार नमूना पर निर्भर है। इसके अलावा, जनमूने में नमक की igh स्तरों प्रोटीन के electrophoretic गुणों को बदलने, बैंड पैटर्न में फेरबदल और विभाजन के प्रस्ताव को कम करेगा। इन महत्वपूर्ण कदम और सीमाओं बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के दौरान लिए जिम्मेदार होना चाहिए।

इसके अलावा, सीएन GELFrEE मूल निवासी क्रोमैटोग्राफी में कई अत्यधिक मांग की विशेषताओं के लिए दिखाया गया था। यह सरल जुदाई विधि प्रोटीन परिसरों के उच्च संकल्प विभाजन को प्राप्त होता है, आणविक वजन की एक विस्तृत श्रृंखला के माध्यम से प्रोटीन लोड और fractionating की उच्च मात्रा में स्वीकार नहीं है। सीएन GELFrEE भी जीवों और विभिन्न तैयारियों 9 की एक बड़ी विविधता से जैविक नमूने fractionating करने में सक्षम किया जा रहा है, बहुत बहुमुखी साबित हो गया था।

इसके अलावा, इस तकनीक में तरल अंश क्षालन उच्च प्रोटीन वसूली है कि अन्य जेल आधारित मूल निवासी विभाजन में नहीं मनाया जाता है सक्षम बनाता है। इसके अलावा, अन्य विधियों के विपरीत है कि ईवीणा विधानसभाओं तरल चरण में, सीएन GELFrEE नमूना एकाग्रता को कम नहीं करता। वास्तव में, प्रोटोकॉल यहाँ बताया ~ भिन्न करने के लिए नमूना से 2 गुना से प्रत्येक प्रोटीन विधानसभा की एकाग्रता बढ़ जाती है। अंत में, तरल नमूने इस विधि उत्पन्न बहाव के विभिन्न जैव रासायनिक और biophysical देशी-प्रोटीन का विश्लेषण करती है, मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित के साथ आसानी से संगत कर रहे हैं। एक भी साफ कदम के बाद हम देशी मास स्पेक्ट्रोमेट्री, सीएन GELFrEE भागों में अज्ञात प्रोटीन परिसरों के माध्यम से पहचान करने और चिह्नित करने के लिए, आगे इन तकनीकों के बीच मूल निवासी फैशन और अनुकूलता का प्रदर्शन कर रहे थे।

इसी तरह GELFrEE denaturing करने के लिए, इस उपन्यास मूल निवासी विभाजन तकनीक को भी अत्यधिक अनुकूलनीय है। समाधान कास्टिंग की सांद्रता अलग ढाल जैल बनाने के लिए, क्रम में आणविक वजन सीमा है कि एक रन के दौरान हल हो गई है भिन्न करने में समायोजित किया जा सकता है। उच्च resolut में जुदाई जेल समाधान परिणामों के% टी बढ़ाने सेकम द्रव्यमान प्रजातियों के आयन को कम करते हुए इसे उच्च आणविक भार प्रजाति की जुदाई में सुधार। संग्रह बार के माध्यम से जो प्रयोग किया जाता है यह भी आदेश आणविक वजन जरूरत के रूप में प्रत्येक अंश में हासिल की बैंडविड्थ का अनुकूलन करने में रूपांतरित किया जा सकता है। 120 मिनट के ऊपर विस्तारित प्रयोग समय इस प्रोटोकॉल में दर्शाया से भी अधिक आणविक वजन पर्वतमाला उत्पन्न होगा। इसके अलावा, अंश संग्रह के बीच के समय को कम करने के लिए प्रत्येक अंश में जटिलता को कम कर सकते हैं। इसलिए, कई मापदंडों को आसानी से ठीक-देखते जा सकता है, विभिन्न अध्ययनों के लिए तकनीक के उपयोग का अनुकूलन।

अंत में, सीएन GELFrEE फायदे के आणविक वजन, उच्च प्रोटीन वसूली के एक विस्तृत रेंज में उच्च संकल्प पेश जुदाई, और प्रोटीन की उच्च मात्रा को स्वीकार लोड मूल निवासी जुदाई तकनीक के क्षेत्र में एक अंतराल पर कब्जा। अंत में, जिसके परिणामस्वरूप अंशों सबसे नीचे की ओर देशी और denaturing प्रोटीन विश्लेषण तकनीक के साथ संगत कर रहे हैं।

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Acknowledgments

WM उबकना फाउंडेशन उदारता से इस काम के लिए धन प्रदान किया। इस सामग्री को काम FAPERJ शोध अनुदान १००.०३९ / 2014 से रियो डी जनेरियो राज्य की सरकार से समर्थन पर आधारित है - उच्च शिक्षा में सुधार के लिए कार्मिक समन्वय से बॉर्डर्स छात्रवृत्ति ८८,८८८.०७५४१६ / 2,013-00 बिना आरडीएम के लिए ब्राजील, विज्ञान सरकार के तहत, ब्राजील की, एचएसएस के लिए, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप के लिए ओ.एस.एस. नंबर 2014171659 के तहत फैलोशिप, और CNPq शोध अनुदान LHFDVPCH के लिए ब्राजील की सरकार की ओर से 202,011 / 2012-7 से जीवन का एक नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय के रसायन विज्ञान के एक प्राप्तकर्ता प्रक्रियाओं संस्थान Postdoctoral है फैलोशिप अवार्ड।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Materials
15 ml conical tube Any supplier n/a
30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 ml Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

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References

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सीएन GELFrEE - साफ़ देशी जेल-eluted तरल अंश फंसाने वैद्युतकणसंचलन
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Cite this Article

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).More

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